徐阿晶，　馬　婧，　黃曉會，　蔣興浩

(1. 上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥劑科， 上海 200092;2. 上海交通大學(xué) 電子信息與電氣工程學(xué)院, 上海 200240)

0　引　言

秀麗線蟲,亦稱秀麗隱桿線蟲，以細(xì)菌為食, 其生命周期約為3 d, 平均壽命為3周。成蟲體長約1.0～1.5 mm, 體表有一層角質(zhì)層覆蓋物。作為一種模式動物, 已廣泛應(yīng)用于當(dāng)前生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。

秀麗線蟲對各種生物、化學(xué)刺激物會產(chǎn)生趨化作用，通過線蟲對各種刺激物的反應(yīng)特性加以鑒別可以實現(xiàn)生物檢測。早先的秀麗線蟲生物檢測研究方法是先使用疊氮化鈉將培養(yǎng)基上的線蟲麻痹使之少動或者不動，然后再對刺激物所在的培養(yǎng)基材料各個區(qū)域中線蟲的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)分析，以判斷線蟲對不同刺激物產(chǎn)生的趨化作用。但這種方法有很多重復(fù)性的人工操作，需要肉眼通過顯微鏡觀察判斷線蟲是否死亡，耗費很多人力和時間。近年來,國外學(xué)者提出了對整個生物活動過程進(jìn)行測定，特別是秀麗線蟲在培養(yǎng)基上活動的詳細(xì)運動軌跡，例如通過顯微鏡記錄蟲體蠕動速度和蟲體扭轉(zhuǎn)頻率等參數(shù)[1-2]。Moy等隨后對方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了更加微型化和全自動化的高通量篩選系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由復(fù)雜對象分類篩選系統(tǒng)COPAS和自動圖像獲取處理系統(tǒng)Biosort。使用這個系統(tǒng)，可以實現(xiàn)微型化和全自動化的384孔板采集分析的高通量篩選[3]。但此系統(tǒng)價格昂貴，而且上述方法受限于攝像顯微鏡的數(shù)量和視野，通常只能用384孔板的微量培養(yǎng)基做短時間觀察，而難以使用其他培養(yǎng)皿進(jìn)行不同分組之間的秀麗線蟲的大面積、長時間觀察。

為此，本文采用一種可用于6孔板的多重可視化指標(biāo)的秀麗線蟲藥物篩選評估體系，最多可以使用六個高清攝像頭同時記錄6孔板上線蟲活動的軌跡，并用自定義Matlab腳本處理圖像。

1　材料與方法

(1) 線蟲與菌株。N2 野生型秀麗隱桿線蟲(C. elegans， Bristolstrain N2)和大腸桿菌E.coliOP50，銅綠假單孢菌PseudomonasAeruginosa(PA14)由中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所楊崇林研究員惠贈。

(2) 試劑。疊氮鈉、蛋白胨、瓊脂粉、藥物等來自 Sgima公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

(3) NGM 培養(yǎng)基。1 L的NGM培養(yǎng)基含17 g瓊脂， 2. 5 g蛋白胨， 3 g NaCl， 1 mol/LPBS液(pH6.0) 25 mL，入975 mL蒸餾水，滅菌后加入濾膜除菌的1 mL膽固醇溶液( 5 mg/mL乙醇) ， 1 mol/L CaCl21 mL， 1 mol/L MgSO41 mL。

(4) M9緩沖液。1 L的M9緩沖液含15.12 g Na2HPO4·12H2O， 5 g NaCl， 3 g KH2PO4， 0.25 g MgSO4·7H2O。

2　線蟲自主活動跟蹤記錄系統(tǒng)

2.1　機(jī)械組件

為了記錄、觀察線蟲的運動，自制了一個攝影燈箱，使用不銹鋼板焊接成型，頂部開有6個直徑32 mm的觀察孔，在觀察孔上使用熱熔膠固定了6根PVC管，以利于安裝攝像頭。該觀察記錄裝置由圖1所示的304不銹鋼板焊接、裝配制成，分為上下兩層，下層為電源、散熱風(fēng)扇，為箱體光源提供穩(wěn)定的低紋波直流電源。上層主要由光源、攝像頭和6孔培養(yǎng)板組成。上層結(jié)構(gòu)的正中放置6孔培養(yǎng)板，6孔板內(nèi)含有培養(yǎng)基和秀麗線蟲。6孔板側(cè)壁四周圍繞一排發(fā)光二極管燈帶，燈帶背面的膠水緊貼不銹鋼外殼對外散熱，6孔板底部也放置有一塊平面光源。由于發(fā)光二極管燈帶為散射光源，部分光線會散射到6孔板上方造成損失，因此在燈帶上方放置了一塊中空不銹鋼遮光板，中空部分稍大于6孔板的外緣，該中空板可以將散射的光線重新聚集到6孔板的側(cè)壁，引導(dǎo)光線從側(cè)面射入6孔板。

圖1觀察記錄裝置的結(jié)構(gòu)示意圖

1-觀察箱體; 2-攝像頭; 3-中空遮光板; 4-側(cè)壁發(fā)光二極管燈帶; 5-6孔培養(yǎng)板; 6-電源控制模塊; 7-散熱風(fēng)扇; 8-底部平面光源

在觀察箱的頂部，用不銹鋼開孔器開6個直徑φ32 mm孔，開孔距離與6孔板的孔距完全一致，取φ(32×1) mm的PVC電工管，截取12 cm左右插入開孔處，用熱熔膠槍初步固定PVC管。購買微軟LifeCam Cinema HD 高清攝像頭，拆除外固定裝置后將攝像頭插入PVC管中。由于該攝像頭具有自動對焦和錄音功能，因此其麥克風(fēng)部分有一定突起，正好卡住PVC管壁固定，緩慢調(diào)節(jié)攝像頭、PVC管高度，使其視野完全覆蓋6孔板，此時6孔板培養(yǎng)基距離攝像頭約5 cm，攝像頭自動對焦后即可成像并開始記錄，最后用熱熔膠槍將PVC管和攝像頭固定完全。

2.2　秀麗線蟲觀測條件

秀麗線蟲成蟲的大小約1 mm，蟲體為白色半透明狀，因此使用傳統(tǒng)倒置顯微鏡觀察96孔板時主要通過透射光的折光率差異成像，由于顯微鏡視野過小，只能觀察幼蟲，而使用攝像頭觀察32 mm直徑的大視野6孔板時，透射光的觀測效果非常差，因此光源部分采用了暗視野技術(shù)，在6孔板下方安裝黑色的遮光紙，在箱體側(cè)面安裝LED燈帶，LED燈帶的散熱面緊貼箱體，通過箱體散熱。

2.3　數(shù)據(jù)采集與分析

線蟲被培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板(U型)，根據(jù)不同的實驗?zāi)康募尤霚y試物，然后放入攝影燈箱，開啟光源和攝像頭，使用計算機(jī)錄制線蟲的的自發(fā)活動視頻，通常記錄24 h或更長時間，并記錄活動情況。

使用2個計算機(jī)程序分別用于記錄和分析視頻，記錄軟件選用Debut Video Capture Software Professional,分析軟件采用自主編寫的LabVIEW以及MatLab腳本進(jìn)行視頻分析，提取線蟲的活動記錄信息。

2.4　實驗測試

2.4.1培養(yǎng)條件

秀麗隱桿線蟲細(xì)菌感染方法。從成蟲分離蟲卵，在M9緩沖液中孵化過夜，得到L1 期幼蟲，將幼蟲轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)基的E.coli菌苔上在20 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)生長48 h，用M9緩沖液洗脫蟲體并反復(fù)清洗后，將蟲體分別轉(zhuǎn)移到普通瓊脂平板的銅綠假單胞菌的菌苔上，在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h進(jìn)行感染，感染后轉(zhuǎn)移到6孔板的M9緩沖液中 (緩沖液中加入25 mol/L 5-氟脫氧尿苷(5-FUDR)，以防止自我繁殖) 繼續(xù)培養(yǎng)，觀察記錄每日死亡情況。培養(yǎng)板邊緣用膠帶密封，以防止干燥，系統(tǒng)可記錄線蟲自發(fā)活動超過21 d。

2.4.2視頻記錄裝置的環(huán)境控制

由于線蟲合適的生存溫度為12～22 ℃，最佳培養(yǎng)溫度為18 ℃，視頻跟蹤記錄裝置的溫度控制顯得尤為重要。上述裝置的電源部分帶有散熱風(fēng)扇，適當(dāng)措施后實測觀察箱內(nèi)溫度(17±2) ℃，達(dá)到線蟲培養(yǎng)的理想溫度。 6孔板的外面在記錄前應(yīng)噴涂防霧液并干燥成膜，以防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)凝結(jié)造成視頻圖像模糊。

3　結(jié)　果

3.1　線蟲運動軌跡的觀察

微軟攝像頭自帶的記錄軟件能夠以30幀/s的速率記錄高清運動圖像，因此選用了自帶核心顯卡的Intel i5-2400處理器的筆記本電腦作為記錄硬件。線蟲在培養(yǎng)基中的移動速度是緩慢的，而且考慮到USB總線的帶寬以及CPU視頻壓縮能力，記錄線蟲運動軌跡并不需要那么高的幀率，特別是以30幀/s默認(rèn)幀率存儲的視頻文件體積較為龐大，因此我們使用了錄像軟件Debut Video Capture Software Professional進(jìn)行記錄。選擇合適的分辨率960×720， Change Frame Rate設(shè)置為5幀/s。圖2顯示的是本觀察箱采集線蟲運動軌跡原始錄像截圖。其中存活的線蟲與死亡的線蟲在形態(tài)方面有明顯差異，存活的線蟲形態(tài)多為S型游動的正弦狀態(tài)，死亡的線蟲形態(tài)多為直線型僵直狀態(tài)(見圖 2)。

(a) 存活的線蟲運動形態(tài)截圖

(b) 死亡的線蟲

3.2　視頻分析用軟件

采用自主編寫的LabVIEW以及MatLab軟件進(jìn)行，提取線蟲的活動記錄信息。自動分析計算線蟲的成活率，及組間的差別(見圖3)。

圖3　軟件自動分析計算線蟲的成活率

3.3　銅綠假單胞菌感染對秀麗線蟲生存的影響及藥物的治療效果

圖4　　　　美羅培南對銅綠假單胞菌感染引起的秀麗線蟲死亡具有保護(hù)作用

從圖4可以看到，秀麗隱桿線蟲被銅綠假單胞菌(PseudomonasAeruginosa，PA14)感染1d后沒有發(fā)現(xiàn)死亡，隨后開始出現(xiàn)死亡，多次實驗表明，被銅綠假單胞菌感染后的線蟲均在7d內(nèi)死亡。我們的初步實驗結(jié)果表明，與OP-50菌處理的線蟲相比，銅綠假單胞菌感染線蟲的生存期限明顯縮短(見圖4)。而美羅培南(100 μg/mL)治療，可以明顯改善銅綠假單胞菌感染的線蟲的生存時間和生存率。

4　討　論

秀麗隱桿線蟲是近20年新興的模式動物，與傳統(tǒng)模式動物相比，秀麗線蟲全基因組測序已經(jīng)完成，遺傳背景非常清楚；線蟲生命周期短(從蟲卵發(fā)育到成蟲只需要53 h)，通過直接注射外源DNA的方法在很短時間內(nèi)就可以獲得轉(zhuǎn)基因線蟲；而且通過簡單的喂食方法進(jìn)行RNAi就能敲除基因。而且，秀麗線蟲可以像培養(yǎng)細(xì)胞一樣儲存在-80 ℃冰箱或液氮中，這就為大量保存和使用各種遺傳背景的秀麗線蟲株系提供了極大的便利。這些特點使得秀麗線蟲的細(xì)菌感染模型存在著基因操作簡單快速，準(zhǔn)確度高、費用低廉，特別適合用于大規(guī)模藥物篩選等許多優(yōu)點。近年來已較多地被用于抗菌藥物篩選，以及對特定病原菌毒力基因/毒力因子/與宿主相互作用/及致病機(jī)制方面的研究[4-9]。

近2年來，以CRISPR/Cas9為代表的最新的基因組編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于秀麗線蟲的基因組靶向改造，成為后基因組時代的功能基因組研究、疾病模型建立以及基因治療等不同領(lǐng)域研究與應(yīng)用的利器[10-15]。由于秀麗線蟲模式動物本身具有的各種特性，比如遺傳背景清晰、基因操作簡單快速、可在顯微鏡下直接進(jìn)行基因的表型分析及表達(dá)部位分析，生命周期短，很容易凍存和復(fù)蘇轉(zhuǎn)基因線蟲及突變線蟲等等[4-9]，所以CRISPR技術(shù)在秀麗線蟲上的應(yīng)用可謂強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，具有強(qiáng)大的應(yīng)用開發(fā)前景[9-15]。

而另一方面，使用秀麗線蟲進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選，卻始終存在人力耗費大的缺點，如果使用全進(jìn)口的秀麗線蟲自動計數(shù)和分選系統(tǒng)，價格非常昂貴，本課題組試制觀察箱光源從側(cè)面射入，關(guān)閉底部背景光源并用黑紙墊于6孔板下方，制作黑色背景的時候線蟲對比度可以大幅提升，觀察箱光源選用12 V直流供電的LED燈帶，排除頻閃干擾；燈箱內(nèi)壁噴黑漆，減少箱內(nèi)雜散光散射；φ(32×1) mm的PVC管、攝像頭的正面部分涂黑漆，避免攝像頭、PVC管倒映在培養(yǎng)基的表面上形成鏡像干擾。攝像頭選用帶有自動對焦功能的光學(xué)玻璃鏡攝像頭，獲得最佳觀測效果。使用攝像頭錄像軟件Debut Video Capture Software Professional進(jìn)行記錄，以5幀/s默認(rèn)幀率記錄存儲。

現(xiàn)有的線蟲培養(yǎng)技術(shù)主要以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，6孔板由于線蟲數(shù)目多，對培養(yǎng)基的透明度要求高，難于實時觀察計數(shù)。本研究在半透明培養(yǎng)基配制時適當(dāng)更改配方，減少半透明物質(zhì)如蛋白胨的用量，并過濾除去雜質(zhì)。經(jīng)上述多項參數(shù)優(yōu)化措施，可實現(xiàn)對6孔板中線蟲的運動軌跡進(jìn)行清晰、連續(xù)地采集記錄。并可以實現(xiàn)對線蟲長時間、大范圍運動軌跡自動化統(tǒng)計分析。

本研究組基于Matlab編寫的圖像處理程序，主要用于提取線蟲的運動活躍程度的數(shù)據(jù)，包括存活與否的判斷、蟲體扭動頻率，蟲體累計移動路程，以及線蟲存活率的自動統(tǒng)計。本文通過對秀麗線蟲行為模式的視頻內(nèi)容進(jìn)行采集、記錄、智能理解與統(tǒng)計分析，建立病原菌/藥物/生物體三位一體的多重視頻指標(biāo)的耐藥菌敏感的藥物篩選評估研究體系。

5　結(jié)　語

本研究建立的秀麗線蟲抗菌藥物篩選評估研究體系，可應(yīng)用于抗菌藥物的快速簡便篩選，及相應(yīng)的作用機(jī)制研究，具有較好的前景和臨床應(yīng)用價值。

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