代 迪, 字洪標(biāo), 楊有芳, 阿的魯驥, 陳 焱, 羅雪萍, 王長(zhǎng)庭

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 成都 610041)

自19世紀(jì)工業(yè)革命以來，人類活動(dòng)正日益改變著全球氮循環(huán)，化石燃料的大量燃燒、肥料在農(nóng)田系統(tǒng)中的過度使用以及固氮植物的大量種植皆導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)中的氮儲(chǔ)量迅速增加[1]。外源氮的輸入不僅影響陸地生態(tài)系統(tǒng)可利用氮素的狀況，還會(huì)導(dǎo)致土壤生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的改變，進(jìn)而產(chǎn)生諸如土壤富營(yíng)養(yǎng)化等一系列環(huán)境問題[2]。而青藏高原高寒草甸遠(yuǎn)離工業(yè)區(qū)，因此受到N素破壞相對(duì)較少，從而成為研究N素對(duì)生態(tài)系統(tǒng)影響的理想?yún)^(qū)域。目前已有一些研究報(bào)道，如：王長(zhǎng)庭等[3]研究發(fā)現(xiàn)過高氮肥(≥40 g/m2)的添加會(huì)使草地生態(tài)系統(tǒng)達(dá)到氮飽和狀態(tài)，從而降低草地生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和物種組成；王偉等[4]研究發(fā)現(xiàn)外源氮(硫酸銨、尿素、硝酸鈣)的輸入會(huì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)力，且當(dāng)硫酸銨施肥量為20 g/m2時(shí)增產(chǎn)效果最明顯；宗寧等[5]研究發(fā)現(xiàn)施N肥會(huì)改變地下生物量分配模式；曹文俠等[6]研究發(fā)現(xiàn)不同氮肥梯度的添加是通過改變土壤養(yǎng)分含量等特性，來改變植物群落物種的組成及生產(chǎn)力，使對(duì)氮肥敏感的植物個(gè)體增大，群落密度降低。因此，氮肥添加不僅影響地上植物群落結(jié)構(gòu)和功能，而且顯著改變了地下生態(tài)系統(tǒng)特別是土壤微生物群落，如：Compton等[7]發(fā)現(xiàn)草地土壤微生物量在施N后呈降低趨勢(shì)；Clegg等[8]研究發(fā)現(xiàn)放線菌的磷脂脂肪酸(PLFA)在添加氮肥后升高，而真菌的磷脂脂肪酸(PLFA)對(duì)氮肥響應(yīng)卻很小。Yao等[9]研究表明，隨著氮沉降速率增加土壤微生物的多樣性降低。但是就青藏高原高寒草甸不同梯度施肥處理對(duì)土壤微生物多樣性和組成的影響研究比較缺乏，限制了施肥對(duì)高寒草甸土壤生態(tài)功能和過程的認(rèn)識(shí)，也不利于地上和地下部分相互關(guān)系的深入探討。

因此，本研究以連續(xù)2 a施氮肥的川西北高寒草甸為研究對(duì)象，并運(yùn)用Biolog法對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)、觀測(cè)，試圖解決以下科學(xué)問題：(1) 施加不同梯度氮肥CO(NH2)2對(duì)高寒草甸土壤微生物群落代謝功能多樣性有何影響？(2) 在不同的施氮肥梯度中最適宜的施肥量是多少？(3) 造成這一結(jié)果的影響機(jī)制是什么？旨在為高寒草地生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物功能多樣性對(duì)N肥添加的響應(yīng)提供一定數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　研究區(qū)概況

研究區(qū)位于四川省阿壩州紅原縣西南民族大學(xué)生態(tài)保護(hù)與畜牧業(yè)高科技研發(fā)基地(32°49.823′N,102°35.237′E)，海拔3 494 m，該區(qū)氣候?qū)儆诖箨懶愿咴疁貛О霛駶?rùn)季風(fēng)氣候，日溫差大，霜凍期長(zhǎng)，四季變化不明顯，年平均氣溫1.1℃，最高溫度在7月，平均為10.9℃，最低溫度在1月，平均為-10.3℃。干濕季節(jié)分明，年降水量為650～800 mm，長(zhǎng)日照時(shí)期主要集中在5—9月，年平均日照2 417.9 h。草甸類型主要是矮嵩草草甸，其蓋度在80%以上，其中莎草科主要有四川嵩草(Kobresiasetchwanensis)和高山嵩草(Kobresiapygmaea)等，有關(guān)植物群落組成等詳見文獻(xiàn)[10]。

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

試驗(yàn)樣地選擇地勢(shì)相對(duì)平坦、植被分布均勻的未退化矮嵩草草甸(冬春草場(chǎng))區(qū)域，且四周用圍欄保護(hù)。于2012年5月下旬在圍欄內(nèi)選擇面積為100 m×100 m地勢(shì)平坦樣區(qū)，分成4個(gè)30 m×20 m的試驗(yàn)樣區(qū)，樣區(qū)間距為3 m，各樣區(qū)四角用木樁標(biāo)記。以隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)施N肥處理，施肥水平為0 g/m2(CK)，10 g/m2(N10)，20 g/m2(N20)，30 g/m2(N30)4個(gè)施肥水平，每個(gè)施肥水平有6個(gè)3 m×3 m的小樣方，共計(jì)24 (4×6)個(gè)小樣方，小樣方之間間隔2 m作為緩沖區(qū)。所施肥料為尿素CO(NH2)2，含氮量為46%。從2012年5月下旬開始第一次施肥，此后每年5月下旬施肥1次。施肥在多云的陰天進(jìn)行(因?yàn)樵诙嘣频年幪焓┓?，施肥?dāng)天或次日會(huì)有降雨，這就保證了所施肥料在短期內(nèi)能溶于土壤中)，用手將肥料均勻地灑在小樣區(qū)。

于2014年8月中旬，在3 m×3 m的樣方內(nèi)，分層(0—10 cm和10—20 cm)鉆取土壤樣品，土鉆內(nèi)徑為5 cm，2個(gè)3 m×3 m中的土壤樣品共計(jì)2×5鉆均勻混合為一個(gè)土壤樣品，重復(fù)3次，做好標(biāo)記，把土壤樣品分成兩部分，一部分風(fēng)干后測(cè)定土壤養(yǎng)分，另一部分揀去石頭和草根等雜物做好標(biāo)記，迅速放入保鮮盒，保存于4℃的冰箱，測(cè)定土壤微生物功能多樣性。

1.3　測(cè)定方法

1.3.1土壤理化性質(zhì)測(cè)定土壤含水量(soil moisture content,SMC)測(cè)定采用TDR土壤水分測(cè)定儀(Time Domain Reflectometry,Midwest-G,JZZ1-TDR-3,Peking,China)，單位為%，即體積含水量。土壤有機(jī)質(zhì)(soil organic matter,SOM)含量測(cè)定采用重鉻酸法(外加熱法)，土壤全氮(total nitrogen,TN)含量測(cè)定采用凱氏定氮法，土壤速效氮(available nitrogen,AN)含量測(cè)定采用擴(kuò)散皿法[11]，鉬銻抗比色法測(cè)定土壤全磷(total phosphorus,TP)含量，土壤速效磷(available phosphorus,AP)含量測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法[12]。采用土鉆法測(cè)定根土重量比，在每個(gè)觀測(cè)樣方用內(nèi)徑5 cm土鉆在0—20 cm土層每10 cm為1層取樣，共2層，每層“V”字型取10鉆，重復(fù)5次，不同土層樣品過篩得到土壤樣品并稱重，清水沖洗得到根系樣品，分別在60℃和105℃烘至恒重，稱干重質(zhì)量，根土重量比=根重量/土壤重量[13]。養(yǎng)分測(cè)定均進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.2土壤微生物多樣性的測(cè)定與計(jì)算土壤微生物多樣性的測(cè)定采用Biolog-ECO(Biolog Inc,USA)板，具體操作步驟見向澤宇等[14]描述。平均顏色變化率(Average well color development,AWCD)和微生物多樣性計(jì)算公式如下：

AWCD值的計(jì)算：

(1)

Shannon-Weiner指數(shù)(H):

H=-∑PilnPi

(2)

Pielou均勻度指數(shù)(J):

J=(-∑PilnPi)/lnS

(3)

McIntosh指數(shù)(U):

(4)

式中：Ci為第i孔的590，750 nm下的吸光值之差；R為對(duì)照孔的吸光值；n為Biolog微平板的碳源種類的數(shù)目(n=31)；Pi為第i孔的相對(duì)吸光度值與整個(gè)平板相對(duì)吸光度值總和的比率；S為產(chǎn)生顏色變化的孔的數(shù)目；ni為第i孔的相對(duì)吸光度值[15]。

1.4　數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 software (SPSS Inc.,version 19.0)和CANOCO for Windows 4.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　施N肥對(duì)高寒草甸土壤養(yǎng)分的影響

施N肥后土壤養(yǎng)分發(fā)生了改變(表1)。在0—10 cm土層，土壤水分在N30處理顯著增加，而N10和N20處理顯著降低；AP含量表現(xiàn)為N30和N20處理顯著大于N10和CK；AN含量表現(xiàn)為N30>N20>CK>N10，且存在顯著差異；TP含量顯著提高，但TN含量無顯著變化；根土比表現(xiàn)為N20>N30>N10>CK，且存在顯著差異。在10—20 cm土層，AP，TP和TN的含量無顯著影響；土壤水分在N10和N20處理顯著降低；AN含量在N20和N30處理顯著增加；根土比表現(xiàn)為N20>N10>N30>CK，且在N10和N20處理顯著提高。

表1　施N肥對(duì)高寒草甸土壤養(yǎng)分的影響

注：CK—10，N10—10，N20—10，N30—10分別代表不同施肥梯度樣地0—10 cm土層；CK—20，N10—20，N20—20，N30—20分別代表不同施肥梯度樣地10—20 cm土層。括號(hào)里面的數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，小寫字母代表不同施肥梯度間差，下表同。

2.2　施N肥后高寒草甸土壤微生物功能多樣性的變化

由圖1可知，在0—10 cm土層，從接種開始到培養(yǎng)24 h，AWCD值在不同施N肥梯度下無明顯變化；但培養(yǎng)24～148 h內(nèi)，AWCD值均在不同施肥梯度下快速增加，且表現(xiàn)為CK最大，N10最低；在148～172 h時(shí)段內(nèi)，CK和N20增長(zhǎng)緩慢，趨于停止，N10和N30仍在增長(zhǎng)(圖1A)。在10—20 cm土層，在0～24 h時(shí)段不同施肥梯度的AWCD值均無明顯變化，但在24～172 h時(shí)段內(nèi)，各梯度的AWCD值均呈現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，且表現(xiàn)出施肥處理顯著高于CK，其中N20處理最大，N10和N30的增長(zhǎng)速度趨于一致(圖1B)。

圖1不同N肥梯度高寒草甸土壤微生物AWCD值

由表2可知，不同施N肥梯度高寒草甸土壤微生物群落功能多樣性存在顯著差異。在0—10 cm土層，培養(yǎng)72 h的Pielou指數(shù)在不同施肥梯度下無顯著差異，但是McIntosh指數(shù)在N10處理顯著降低；Shannon指數(shù)在N10和N20處理顯著降低(p<0.05)。在10—20 cm土層中，McIntosh指數(shù)表現(xiàn)為N20>N30>N10>CK且N20處理顯著高于其他處理；Shannon指數(shù)和Plelou指數(shù)均表現(xiàn)為施肥顯著增加其多樣性，且均在N20處理下最大。

2.3　土壤微生物碳源利用特征的變化

根據(jù)化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)，將ECO板上的31種碳源分成糖類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類和酸類。發(fā)現(xiàn)不同施肥梯度下土壤微生物對(duì)6類碳源類型利用不同。在0—10 cm土層，土壤微生物對(duì)糖類的利用表現(xiàn)為N30>CK>N20>N10，且N10處理顯著降低；胺類為N20>N30>CK>N10，且N20顯著增加；氨基酸類和醇類表現(xiàn)為N30處理顯著降低，而酯類、酸類的利用無顯著變化(圖2A)。在10—20 cm土層，N肥的添加明顯提高了糖類、氨基酸類、酯類、胺類和酸類的利用，且均表現(xiàn)為在N20處理下最高，醇類在施肥處理下無顯著變化(圖2B)。

表2　不同施N肥梯度高寒草甸土壤微生物群落功能多樣性

注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(p<0.05),下圖同。

圖2不同施N肥梯度高寒草甸土壤微生物對(duì)不同碳源利用圖譜

2.4　土壤微生物利用碳源的主成分分析

采用PCA(Principal component analysis)對(duì)添加不同梯度氮素的高寒草甸樣地培養(yǎng)72 h的土壤微生物的每孔吸光值進(jìn)行主成分分析。結(jié)果表明，在0—10 cm土層，主成分1，2對(duì)土壤微生物功能多樣性的貢獻(xiàn)率分別為51.3%和15.9%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為67.2%(圖3A)。PCA圖中代表不同N肥梯度處理的土壤微生物群落分布存在差異，N30和CK樣品主要分布集中在一、四象限，而N20和N10樣品集中在二、三象限，說明N30和CK與N10和N20土壤微生物對(duì)利用碳源種類、水平和代謝多樣性方面存在差異(圖3A)。在10—20 cm土層中，主成分1對(duì)土壤微生物功能多樣性的貢獻(xiàn)率為45.1%，主成分2的貢獻(xiàn)率為18.1%，累積貢獻(xiàn)率為63.2%(圖3B)。同時(shí)，CK，N10，N20和N30分布在不同區(qū)域中，說明不同施N處理，土壤微生物群落發(fā)生改變，其中N20和N30之間無顯著差異(圖3B)。綜上所述，不同施N肥梯度處理下土壤微生物群落發(fā)生改變，說明土層深度也是影響土壤微生物的一個(gè)主要因素。

荷載因子分析(表3)表明在0—10 cm土層，β-甲基-D-葡萄糖苷、i-赤藻糖醇、肝糖、D-氨基葡萄糖酸、衣康酸、D-纖維糖與PC1軸相關(guān)性較大，其中i-赤藻糖醇l和衣康酸與PC1軸呈正相關(guān)，β-甲基-D-葡萄糖苷、肝糖、D-氨基葡萄糖酸和D-纖維糖與PC1軸呈顯著正相關(guān)；D-半乳糖醛酸、吐溫40、D-木糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露醇、苯乙基胺、腐胺與PC2相關(guān)性較大，其中D-木糖、D-半乳糖醛酸與PC2軸呈負(fù)相關(guān)，苯乙基胺與PC2軸呈顯著負(fù)相關(guān)，D-半乳糖醛酸與PC2軸呈正相關(guān)，吐溫40和D-甘露醇和PC2軸呈顯著正相關(guān)。在10—20 cm土層中，與PC1軸具有較高相關(guān)性的碳源有14個(gè)，且都為正相關(guān)，其中D-半乳糖酸γ內(nèi)酯、N-乙酰基-D-葡萄胺、a-環(huán)狀糊精、r-羥基丁酸、吐溫80、甘氨酰-L-谷氨酸和D-蘋果酸與PC1軸呈正相關(guān)，吐溫40、2-羥苯甲酸、L-苯基丙氨酸、4-羥基苯甲酸、D-纖維二糖、α-D-葡萄糖-1-磷酸鹽和D,L-a-甘油與PC1軸呈顯著正相關(guān)；與PC2軸有高相關(guān)性的碳源有4個(gè)，均為正相關(guān)，其中L-絲氨酸、肝糖和甘氨酰-L-谷氨酸與PC2軸呈正相關(guān)，丙酮酸甲酯與PC2軸呈顯著正相關(guān)。

表3　31種碳源主成分載荷因子

注：*代表相關(guān)，**代表顯著相關(guān)。

2.5　土壤微生物功能多樣性的冗余分析

首先對(duì)不同施N肥梯度下培養(yǎng)72 h的Boilog 數(shù)據(jù)進(jìn)行降趨對(duì)應(yīng)分析，得到第一軸最大梯度長(zhǎng)度為0.3，因此選擇線性冗余分析(Redundancy analysis,RDA)對(duì)環(huán)境梯度進(jìn)行直接排序分析，探討不同施N肥處理下土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤微生物代謝特征的影響。在0—10 cm土層，RDA分析的軸1和軸2的解釋變量分別為56.6%和12.6%，表明土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤微生物碳源代謝有較大的影響(圖4A)。其中，SMC，AP和AN對(duì)碳源利用類型具有顯著影響(p<0.05)，SMC與糖類和酯類呈顯著正相關(guān)，AP和AN與糖類呈顯著正相關(guān)，與氨基酸呈顯著負(fù)相關(guān)(圖4A)。在10—20 cm土層，軸1和軸2的解釋變量分別為61.6%和8.5%，前2軸的解釋變異達(dá)到了70.1%，說明土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤微生物碳源利用類型影響較大(圖4B)。其中，SMC，R∶S和AN對(duì)碳源利用有顯著影響(p<0.05)，AN和R∶S與6種碳源利用類型呈正相關(guān)，SMC與糖類、酸類和氨基酸類呈明顯負(fù)相關(guān)(圖4B)。

3　討 論

3.1　不同N肥梯度對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤理化性質(zhì)是土壤質(zhì)量的重要組成，它不僅影響土壤保持和供應(yīng)水分能力，而且對(duì)土壤通氣狀況、水分滲入、以及地表徑流均有重要的作用[3]。施肥改變土壤的物理和化學(xué)性質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，施N肥后土壤水分含量發(fā)生顯著變化，不同梯度下存在顯著差異。這是因?yàn)榉柿闲枰值娜芙獠拍苓M(jìn)入土壤[16]，經(jīng)過一系列的化學(xué)過程，轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌虮恢参镂绽玫乃傩юB(yǎng)分，因此，施肥在一定程度能夠降低土壤含水量[17]。此外，中高水平氮肥的添加顯著增加土壤速效養(yǎng)分，但是對(duì)全量養(yǎng)分無顯著影響。這與王長(zhǎng)庭[3]和張杰琦[18]等研究結(jié)果相似。因?yàn)镹肥的添加改變了土壤的有效養(yǎng)分，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高了草地生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)力，從而增加凋落物的數(shù)量，導(dǎo)致土壤有機(jī)成分增加[19]。另一方面，土壤C，N，P，K等養(yǎng)分的有效性及其在地上、地下的生態(tài)循環(huán)受到土壤微生物分解和調(diào)控[20]，微生物活性強(qiáng)弱顯著影響著土壤養(yǎng)分含量的高低[21]，而施肥刺激土壤生物的活性，加快了土壤有機(jī)氮磷的分解，同時(shí)植物快速生長(zhǎng)消耗了土壤的無機(jī)氮磷，從而對(duì)全量養(yǎng)分無顯著增加[22]。根土比能夠反映出高寒草甸植物根系生物量變化和空間分布規(guī)律[23]，本研究發(fā)現(xiàn)施氮肥顯著增加了根土比，說明施肥刺激了植物根系生長(zhǎng)，從而表現(xiàn)出較高的根系生物量。而根系生物量增加可以為土壤提供更多的養(yǎng)分含量，從而使土壤中有效養(yǎng)分含量增加[24-25]。

3.2　不同N肥梯度對(duì)土壤微生物碳源利用的代謝活性的影響

AWCD能夠反映土壤微生物代謝活性，微生物代謝活性的變化能夠反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和健康水平[26]。研究表明，N肥添加會(huì)刺激土壤微生物活性。本研究發(fā)現(xiàn)，N肥降低了0—10 cm土層土壤微生物活性。這可能是N肥添加增加了土壤中可利用氮數(shù)量，導(dǎo)致0—10 cm土壤養(yǎng)分含量增加，促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)，而植物根系與微生物對(duì)養(yǎng)分存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，根系大量繁殖分泌化學(xué)物質(zhì)抑制了土壤微生物的活動(dòng)、數(shù)量與活性[27-28]。而10—20 cm土層，施氮肥增加了土壤微生物活性。在自然狀況下，青藏高原高寒草甸土壤中雖然儲(chǔ)藏大量的TN，TP，但由于受到低溫限制，其礦化速率非常低，可供利用的有效N，P僅占總量的1%左右[29]，使土壤微生物利用養(yǎng)分受限，當(dāng)施加氮肥后，快速補(bǔ)充了速效N，經(jīng)過淋溶作用達(dá)到土壤深層，解除了土壤的N限制，促進(jìn)了土壤的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而增強(qiáng)了土壤微生物的活性[19]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在N20(20 g/m2)處理下土壤微生物活性最佳，即土壤微生物活性，生物量以及功能多樣性的增加不是隨著施肥量的增加而不斷增加的，施肥量存在一個(gè)最大值，超過其最大值反而會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制作用[3,30-31]。

注:A2：β-甲基-D-葡萄糖苷；A3：D-半乳糖酸-γ-內(nèi)脂；A4：L-精氨酸；B1：丙酮酸甲酯；B2：D-木糖；B3：D-半乳糖醛酸；B4：L-天門冬酰胺酸；C1：吐溫40；C2：i-赤蘚糖醇；C3∶2-羥基苯甲酸；C4：L-苯基丙氨酸；D1：吐溫80 ；D2：D-甘露醇；D3：4-羥基苯甲酸；D4：L-絲氨酸；E1：α-環(huán)式糊；E2：N-乙酰-D-葡萄糖；E3：γ-羥基丁酸；E4：L-蘇氨；F1：肝糖；F2：D-葡萄糖胺酸；F3：衣康酸；F4：甘氨酰-L-谷氨酸；G1：D-纖維二糖；G2：α-D-葡萄糖-1-磷酸；G3：α-丁酮酸；G4：苯乙胺；H1：α-D-乳糖；H2：D,L-α-磷酸甘油；H3：D-蘋果酸；H4：腐胺。

圖3不同施N肥梯度高寒草甸土壤微生物功能多樣性主成分分析

注：SMC:土壤含水量；TN:全氮；TP:全磷；AN:速效氮；AP:速效磷；R:S:根土比；糖類：Carbohydrates；氨基酸類：Amino acids；酯類：Esters；醇類：Alcohols；胺類：Amines；酸類：Acids。

圖4不同施N肥梯度高寒草甸土壤養(yǎng)分與土壤微生物群落功能多樣性的冗余分析

3.3　不同N肥梯度對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響

土壤多樣性指數(shù)不僅能夠反映土壤微生物群落物種及其個(gè)體的均勻分布程度、豐富度均一性[32],而且還可以用來評(píng)價(jià)不同土壤微生物群落多樣性水平[28]。本研究表明，在0—10 cm土層，施氮降低了McIntosh指數(shù)、Shannon指數(shù)和Pielou指數(shù)。這一方面是氮肥的添加打破了植物與微生物原有的競(jìng)爭(zhēng)模式，提高了植物獲取土壤養(yǎng)分資源的能力，間接抑制了土壤微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而降低了土壤微生物多樣性[19,24]。另一方面，土壤微生物絕大多數(shù)適宜在中性環(huán)境中生存繁殖，但是N肥添加降低0—10 cm土層的pH值導(dǎo)致土壤酸化，從而導(dǎo)致微生物多樣性降低[9]。但在10—20 cm土層，N肥的添加對(duì)土壤微生物的多樣性有促進(jìn)作用。因?yàn)槭㎞肥促進(jìn)高寒草甸土壤有機(jī)氮素的礦化作用，增大深層氮的礦化量和礦化速率，從而對(duì)微生物群落的多樣性具有明顯的促進(jìn)作用[33-34]。此外，土壤微生物多樣性的變化也可能受到酶活性影響，喬江等[35]和裴海昆[36]認(rèn)為施氮肥顯著增強(qiáng)土壤酶活性。不同土層土壤微生物多樣性對(duì)氮添加響應(yīng)不一致，說明土層深度可能是影響微生物多樣性的一個(gè)重要因子，而引起差異主要因素可能是土壤間養(yǎng)分含量的差異所致。

3.4　土壤微生物與土壤養(yǎng)分的關(guān)系

土壤養(yǎng)分是維系地上和地下生物活動(dòng)最基本的營(yíng)養(yǎng)元素，也是影響群落組分和生物多樣性的重要因子[37]。土壤微生物是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)以及有機(jī)碳代謝的主要驅(qū)動(dòng)力，其參與土壤中有機(jī)質(zhì)的分解、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收釋放、物質(zhì)循環(huán)和成土過程，并將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為植物可利用的養(yǎng)分[38-41]。土壤微生物與養(yǎng)分間存在顯著相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)土壤含水量、根土比、速效氮、速效磷與土壤微生物碳源利用類型呈顯著相關(guān)。這與以前的研究結(jié)果相一致，即土壤物理和化學(xué)性質(zhì)與土壤微生物密切相關(guān)[42-43]。施N肥后土壤微生物對(duì)碳源的利用類型發(fā)生改變，土壤微生物對(duì)碳源利用的選擇性改變了土壤微生物的組成結(jié)構(gòu)和多樣性，從而影響土壤微生物碳源代謝活性和功能多樣性的變化[15]。尉建埔等[44]在帽兒山研究發(fā)現(xiàn)氮肥顯著改變了云杉人工林的土壤理化性質(zhì)，導(dǎo)致土壤微生物量、活性和群落結(jié)構(gòu)改變。此外，外源N素的輸入能夠迅速提高土壤中植物可利用氮的含量，導(dǎo)致植物葉片氮含量提高,從而光合作用增強(qiáng)，向地下輸入更多的光合產(chǎn)物，改變微生物對(duì)碳源的代謝活性[45]。因此，研究微生物多樣性對(duì)于認(rèn)識(shí)高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)功能過程具有重要意義。

4　結(jié) 論

本研究基于Biolog-ECO板法評(píng)價(jià)了川西北高寒草甸土壤微生物功能多樣性對(duì)不同N肥梯度的影響發(fā)現(xiàn)，施氮降低了表層(0—10 cm)土壤微生物活性而提高了深層(10—20 cm)土壤微生物活性；N10顯著降低表層微生物多樣性，而N20顯著增加了深層土壤微生物多樣性。施N肥后高寒草甸土壤微生物利用碳源類型主要是糖類、氨基酸類、酸類。綜合來看，20 g /m2N肥(N20)添加有利于生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定以及物種多樣性的維持。此外，隨著研究手段技術(shù)更替，今后的研究我們應(yīng)該采用16S rRNA的V4區(qū)和ITS的ITS2區(qū)分別評(píng)價(jià)不同施肥梯度下細(xì)菌和真菌群落組成和多樣性變化，以及從功能類群和基因方面入手，將有助于我們更好認(rèn)識(shí)高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)對(duì)N肥添加的響應(yīng)以及生態(tài)功能過程。

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