周蓓蓓，陳小雷，鮑俊杰

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱為淡水小龍蝦（Freshwater c rawfish），原產(chǎn)于美國東南部，成體長 5.6～11.9 cm，屬于雜食性淡水經(jīng)濟蝦類。 小龍蝦適應能力強，在水溫為10～30℃時均可正常生長發(fā)育。亦能耐高溫嚴寒，可耐受40℃以上的高溫，也可在氣溫為－14℃以下的情況下安然越冬。小龍蝦生長速度快，剛離開母體的幼蝦生長2～3個月即可成熟并達到商品蝦規(guī)格，其壽命一般為1年。目前，小龍蝦在中國特別是長江中下游地區(qū)已經(jīng)成為重要的淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖品種，其養(yǎng)殖面積覆蓋皖江流域、淮河流域。截至2015年，全國小龍蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量達到 72.32 萬 t，比 2014 年增長 9.63%，其中安徽省2015年小龍蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達到9.72萬t，僅次于湖北省，位居全國第二［1］，小龍蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達到歷史高峰，為小龍蝦加工的發(fā)展提供了優(yōu)厚的條件。

油脂氧化是自由基鏈反應，自由基的高反應活性能夠?qū)е聶C體損傷、細胞破壞、人體衰老等現(xiàn)象，油脂過氧化產(chǎn)物與食品中成分反應，不僅破壞食品外觀、營養(yǎng)和品質(zhì)導致劣變，還會產(chǎn)生致癌物質(zhì)，同時，油脂過氧化物及其降解產(chǎn)物（醛、酮、酮酸等）還可與蛋白質(zhì)發(fā)生反應，使其氧化。蛋白質(zhì)氧化包括蛋白質(zhì)肽鏈斷裂、蛋白質(zhì)分子相互間交聯(lián)聚合、蛋白質(zhì)氨基酸發(fā)生氧化脫氨反應、自由基攻擊蛋白質(zhì)還原性基團、脂類氧化裂解所產(chǎn)生的丙二醛與蛋白質(zhì)上的氨基產(chǎn)生分子間交聯(lián)等［2］。上述氧化損傷和修飾造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，并參與了氧化應激、衰老和多種疾病的發(fā)生和發(fā)展［3，4］。如熱處理等一些加工保藏方法可能促進蛋白質(zhì)氧化而影響肉品食用品質(zhì)、加速肉類劣變［5］。

添加抗氧化劑是一種使用廣泛、有效簡便防止食品氧化的方法。研究表明，常規(guī)抗氧化劑BHT、BHA和TBHQ會引起肝腫大，BHT還會使肺和肝微粒體酶的活性增加，使人體攝入的其他物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸疚锘蛑掳┪铮?］。目前，美國、歐共體等已經(jīng)禁止使用人工合成抗氧化劑［7］，因此，開發(fā)天然抗氧化劑成為必要?？寡趸难芯考性谟椭寡趸鞍踪|(zhì)的氧化涉及甚少?，F(xiàn)有研究表明，除了常規(guī)天然抗氧化劑抗壞血酸、維生素E之外，一些天然香料、藥物等植物中也含有大量抗氧化活性物質(zhì)，其中包括黃酮類、苯酚類（多酚）、皂苷類、鞣質(zhì)類、生物堿類、多糖類等化合物［8］，包括迷迭香、丁香等香料植物提取物，茶多酚類化合物、精油類化合物、丹酚酸等多酚類化合物等，天然抗氧化劑除了植物性成分外，還包含從蝦頭、動物蛋白質(zhì)等組織中提取的肌肽、多肽等抗氧化肽動物性成分，不僅如此，天然抗氧化劑常常會多種成分復配使用，以期達到更好的效果［9－13］。

現(xiàn)有天然抗氧化劑研究集中在抗油脂氧化，研究對象多為魚、豬等肉類，對小龍蝦的天然抗氧化劑研究鮮見報道。本試驗選取6種天然藥食同源植物及香料植物，這些植物均可以在烹飪過程中直接加入，通過制得的抗氧化液對小龍蝦仁進行處理，以蝦仁的脂肪及蛋白質(zhì)雙重氧化程度作為指標，考察不同天然抗氧化劑對小龍蝦仁脂肪和蛋白質(zhì)的不同抗氧化效果，以期為開發(fā)水產(chǎn)品天然無害抗氧化劑提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑與儀器

小龍蝦仁購于合肥市四里河路與北二環(huán)路交口永輝超市，挑選大小均一、較為活潑且體色發(fā)青的鮮活小龍蝦，開水燙漂2 min后剝殼去蝦線、蝦黃，取蝦仁進行試驗。

三氯乙酸（TCA）、EDTA、氯化鈉、2－硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、2、4－二硝基苯肼（DNPH）、乙酸乙酯、鹽酸胍、鹽酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、 三羥甲基氨基甲烷 （Tris）、5，5′－二硫代雙（2－硝基苯甲酸）（DTNB）分析純，購于合肥君德生物科技有限公司。

CR22GIII型高速冷凍離心機 （日本Hitachi公司）；HC－3018型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；754型紫外可見分光光度計 （上海洪紀儀器設備有限公司）；FA25型高速勻漿機［FLUCO弗魯克（上海）公司］。

1.2　方法

1.2.1組分篩選法制取浸漬液及樣品處理 選取丁香、迷迭香、肉桂、鼠尾草、香茅草和紫蘇6種（可能）具有抗氧化效果的藥食同源植物或香料植物，采用組分篩選法［14］對這6種植物進行組合并制浸漬液，以白開水浸泡的樣品為空白，以6種植物全加制浸漬液處理的樣品為參照，其他樣品為5種（扣除1種）植物制浸漬液處理的樣品。浸漬液制取及樣品處理方法：每種植物取10 g，加1 000 mL水，大火煮開后小火燉煮15 min左右，篦去植物并以開水補足1 000 mL，晾涼至 50 ℃以下以 1∶2 的料液比（g∶mL）浸泡龍蝦肉4 h以上，之后4℃冷藏5 d后進行下一步試驗，樣品的組合見表1。

按照表1中的設計對選擇的6種天然藥食同源植物或香料植物（簡稱天然植物）進行組合，按照不同組合制取腌漬液對樣品進行處理。經(jīng)過不同設計的天然植物腌漬液處理后的小龍蝦仁樣品編號與天然植物組分篩選設計編號相同。

表1　6種天然植物組分篩選設計

1.2.2TBARS 測定 脂肪氧化程度根據(jù)文獻［15，16］的方法測定并稍有改動，取3.00 g蝦仁樣品加入30 mL 7.5%（m／V） 的三氯乙酸 （含 0.1%EDTA），15 000 r／min 勻漿 60 s，4 ℃的條件下 6 000 r／min 離心 10 min，過濾，532 nm處測吸光度A1，濾液5 mL加入5 mL 0.02 mol／L 2－硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴40 min，冷卻至室溫，532 nm處測吸光度A2。

1.2.3肌原纖維蛋白提取 肌原纖維蛋白提取按照文獻［16，17］的方法并作一定改動，稱取4 g龍蝦仁加入 60 mL緩沖溶液 A（0.02 mol／L磷酸鹽緩沖液，含 0.1 mol／L NaCl，0.001 mol／L EDTA，pH 7.0），混勻后 15 000 r／min 勻漿 60 s，4 ℃下 6 000 r／min 離心10 min，取沉淀，再加入6倍體積的緩沖液A，相同的條件下離心取沉淀，沉淀即為肌原纖維蛋白提取物。

1.2.4蛋白質(zhì)羰基含量測定 蛋白質(zhì)羰基含量根據(jù)文獻［16，18］的方法并稍作改動，取 0.2 g 肌原纖維蛋白溶于 10 mL 磷酸鹽緩沖溶液 B（0.025 mol／L 磷酸鹽緩沖液，含 0.6 mol／L NaCl，pH 7.0），冰浴 2 h溶解，6 000 r／min離心10 min，取上清液在370 nm處測定吸光度A1，之后取2 mL相同濃度肌原纖維蛋白溶液加入 2 mL 0.01 mol／L 的 DNPH（對照組加入2 mol／L HCl），室溫下黑暗處靜置 1 h（每個 10 min振蕩一次），然后加入2 mL 20%的TCA，10 000 r／min離心 15 min，再用 5 mL 乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）洗滌沉淀2次，取沉淀加入5 mL鹽酸胍溶液（6 mol／L，溶于 0.02 mol／L 磷酸鈉緩沖液，pH 6.5），37 ℃條件下溶解沉淀20 min，10 000 r／min離心 5 min， 取上清液在370 nm處測定吸光度A2。

1.2.5蛋白質(zhì)巰基含量測定 蛋白質(zhì)巰基含量根據(jù)文獻［19，20］的方法并稍作改動，取 0.25 g 肌原纖維蛋白加入 10 mL 0.1 mol／L Tris 緩沖溶液（含 5%SDS，pH 8.0），80 ℃水浴 2 h，之后 4 500 r／min 離心15 min，取上清液 0.5 mL 加入 2 mL 5%SDS／Tris緩沖溶液，在412 nm處測定其吸光度A1，之后加入0.5 mL 0.01 mol／L DTNB （溶于上述緩沖溶液），搖勻后避光反應30 min，在412 nm處測量吸光度A2。1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用 SPSS17.0軟件對多組數(shù)據(jù)之間的差異顯著性進行分析，結(jié)果采用平均值±標準差的形式表示，用F檢驗里的Duncan′s多重檢驗進行差異顯著性分析，P取0.05。

由于浸漬液系植物原株煮制而成，帶有不同程度的顏色，因此為除去顏色干擾，在TBARS、蛋白質(zhì)羰基和蛋白質(zhì)巰基含量的測定中采用吸光度變化幅度（A1－A2和 A2－A1）來表示樣品脂肪氧化及蛋白質(zhì)氧化程度。

2　結(jié)果與分析

2.1　小龍蝦仁TBARS比較分析

TBARS與脂肪的氧化程度有良好的正相關性，因此TBARS常被用于評價水產(chǎn)品品質(zhì)變化的指標［21］，其原理是不飽和脂肪酸氧化降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）與硫代巴比妥酸（TBA）反應并生成穩(wěn)定的紅色化合物［22］，以此化合物測定的吸光度大小表示脂肪氧化程度。以添加TBA反應前后的吸光度差值作為不同腌漬液處理樣品的抗脂肪氧化能力的大小，A1－A2的數(shù)值越大表示抗脂肪氧化能力越強（表2）。

由表 2 可知，A1－A2的大小順序為 5≈1＞2＞3＞4＞7＞6＞8，樣品 7是 6種植物全加的參照，樣品 8是空白樣，由以上抗脂肪氧化的排序得知樣品7（參照）排序靠后，說明6種植物之間存在較為強烈的拮抗作用，而根據(jù)其他樣品與參照樣7的對比可知，腌漬液缺少紫蘇會削弱樣品抗脂肪氧化能力，而腌制液缺少丁香、迷迭香、肉桂、鼠尾草和香茅草會增強樣品的抗脂肪氧化能力。因此，說明紫蘇在6種植物中具有最好的抗脂肪氧化效果。

2.2　小龍蝦仁蛋白質(zhì)羰基含量比較分析

羰基的形成是蛋白質(zhì)氧化的一個明顯標志，蛋白質(zhì)側(cè)鏈上帶有NH－或NH2－基團的氨基酸對自由基非常敏感，蛋白質(zhì)氧化過程中，這些基團可轉(zhuǎn)化成羰基基團；活性氧會導致蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，在斷裂處也可能形成羰基［20，23］。 肌原纖維蛋白一般占肉類全蛋白質(zhì)含量的60%～70%，因此，肌原纖維蛋白中羰基含量是評價肉制品蛋白質(zhì)氧化程度的有力指標［20，24，25］。羰基含量越高，說明蛋白質(zhì)氧化程度越深。以添加DNPH反應前后的吸光度差值作為不同腌漬液處理樣品的抗蛋白質(zhì)氧化能力的大小，A1－A2的數(shù)值越大表示抗蛋白質(zhì)氧化能力越強（表3）。

表2　小龍蝦仁抗氧化處理前后原始TBARS變化

蛋白質(zhì)羰基含量的數(shù)值越大，表示蛋白質(zhì)氧化程度越高，因此吸光度變化情況（A1－A2）的數(shù)值越大，表示蛋白質(zhì)羰基含量下降越多，也就是說抗蛋白質(zhì)氧化能力越強。由表3可知，A1－A2的大小順序為1＞7＞3＞2＞4＞5＞6＞8，6 種植物全加的參照樣品 7 排序靠前，說明6種植物間存在較小的拮抗作用，根據(jù)其他樣品與參照樣品7的對比可知，腌漬液缺少丁香會增強樣品抗蛋白質(zhì)氧化能力，而腌制液缺少迷迭香、肉桂、鼠尾草、香茅草和紫蘇會削弱樣品的抗蛋白質(zhì)肪氧化能力。因此，說明組合1即迷迭香、肉桂、鼠尾草、香茅草和紫蘇具有最強的抗蛋白質(zhì)氧化能力。

2.3　小龍蝦仁蛋白質(zhì)巰基含量比較分析

巰基是蛋白質(zhì)分子中具有較高反應活性的基團，巰基的硫外層具有很多孤對電子，具有強烈的親核性［20，26］。巰基對氧化反應比較敏感，蛋白質(zhì)在氧化過程中，巰基轉(zhuǎn)換成二硫鍵是初期的一個反應產(chǎn)物，巰基的含量變化可顯示出蛋白質(zhì)的變性程度［20，27，28］。巰基含量越低表示蛋白質(zhì)氧化程度越高。以添加DTNB反應前后的吸光度差值作為不同腌漬液處理樣品的抗蛋白質(zhì)氧化能力的大小，A2－A1的數(shù)值越大表示抗蛋白質(zhì)氧化能力越強（表4）。

蛋白質(zhì)巰基含量的數(shù)值越大，表示蛋白質(zhì)氧化程度越低，因此吸光度變化情況（A2－A1）的數(shù)值越大，表示蛋白質(zhì)巰基含量上升越多，也就是說抗蛋白質(zhì)氧化能力越強。由表4可知，A2－A1的大小順序為6＞8＞1＞4＞2＞5＞7＞3，參照樣 7 排位靠后，空白樣排在第二，幾種組合之間的差異不明顯。通過其他樣品與空白樣8的比較可知：腌漬液中缺少紫蘇能夠增強樣品的抗蛋白質(zhì)氧化能力，也就是說組合6即丁香、迷迭香、肉桂、鼠尾草和香茅草具有最強的抗蛋白質(zhì)氧化能力，與蛋白質(zhì)羰基含量的分析結(jié)果進行組合分析，組合迷迭香、肉桂、鼠尾草和香茅草具有較好的抗蛋白質(zhì)氧化效果。

表3　小龍蝦仁抗氧化處理前后原始蛋白質(zhì)羰基含量變化

表4　小龍蝦仁抗氧化處理前后原始蛋白質(zhì)巰基含量

3　討論

以6種天然藥食同源植物和香料植物為研究對象，采用不同組合制取腌漬液對小龍蝦仁進行處理，選取TBARS、蛋白質(zhì)羰基含量和巰基含量為指標，考察其對小龍蝦仁脂肪及蛋白質(zhì)的不同抗氧化效果，結(jié)果表明，紫蘇具有6種植物中最好的抗脂肪氧化效果，這可能解釋了為什么烹飪魚的過程中添加紫蘇能夠有效祛除腥味，紫蘇在一定程度上防止脂肪分解氧化產(chǎn)生小分子腥味化合物；丁香對抗蛋白質(zhì)氧化的效果破壞最大，組合迷迭香、肉桂、鼠尾草和香茅草具有最好的抗蛋白質(zhì)氧化效果；以蛋白質(zhì)羰基含量為考察指標能夠較為明確地指示各植物組分的抗蛋白質(zhì)氧化效果，各組合之間存在顯著差異（P＜0.05），以蛋白質(zhì)巰基含量為考察指標各組合之間相似度較高，不能夠明確指示抗蛋白質(zhì)氧化效果。

天然植物含有的活性成分復雜多樣，一些黃酮類、酚酸類、苯丙素類等化合物由于其特殊結(jié)構(gòu)，具有不同程度的抗氧化活性，如迷迭香中的迷迭香酸、鼠尾草中的鼠尾草酸。值得注意的是，紫蘇具有最好的抗脂肪氧化效果，而丁香具有明顯的促進蛋白質(zhì)氧化的效果，這可能與植物本身所含有的活性物質(zhì)有關，需要更深層次的研究。

脂肪和蛋白質(zhì)氧化原理不盡相同，一般來說，脂肪氧化是由于不飽和脂肪酸雙鍵的易氧化性，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較為復雜，氧化包括含N、含S基團的活潑易變特性。因此，本研究選取的6種天然藥食同源植物或香料植物在抗脂肪氧化和抗蛋白質(zhì)氧化的效果特性上并不相同，在實際生產(chǎn)過程中，需要根據(jù)產(chǎn)品本身的特性（脂肪、蛋白質(zhì)含量多寡）來選用合適的天然抗氧化劑。

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