馮路瑤，程顯好**，董洪新，李維煥，陸賀港，李 寅，劉 靜

（1.魯東大學農(nóng)學院，山東 煙臺 264025；2.煙臺市中醫(yī)院腫瘤科，山東 煙臺 264000）

牛樟芝（Antrodia camphorata） 又名牛樟菇、樟窟內(nèi)菇、紅樟芝，隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱 （Hymenomycetes） 多孔菌科 （Polyporaceae） 薄孔菌屬（Antrodia），是原產(chǎn)于臺灣的珍稀藥用真菌[1]。牛樟芝含有豐富的生物活性物質(zhì)，三萜類物質(zhì)為牛樟芝的主要活性成分之一[2]，具有多種生物活性，如保肝、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化、降血壓等[3]，近年來已逐漸成為國內(nèi)外研究和開發(fā)的熱點[4]。

研究表明，牛樟芝液體發(fā)酵培養(yǎng)可以在較短時間內(nèi)獲得大量的菌絲體和發(fā)酵液，能極大地提高產(chǎn)量，以彌補牛樟芝生長緩慢的缺點，但是其活性產(chǎn)物的含量較低[5]。

中藥發(fā)酵技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，真菌在代謝過程中有可能對中藥中的萜類、黃酮類、皂苷類等某些活性物質(zhì)進行生物轉(zhuǎn)化，消除中藥的副作用，甚至形成新的成分或是生物活性更高的物質(zhì)[6-8]，從而增強發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性和藥理作用。食（藥）用菌發(fā)酵過程中，中藥也可能會對發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性和藥理功能產(chǎn)生影響[9]。

趙艷[10]等將板藍根、銀杏葉、金銀花、枸杞、連翹五味中藥的水提物和醇提物加入靈芝的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連翹水提物和枸杞醇提物均能促進靈芝胞內(nèi)三萜的形成。中藥中的某些成分能促進藥用真菌的生長或活性產(chǎn)物的產(chǎn)生[11]。

雖然，關(guān)于提高牛樟芝液體發(fā)酵產(chǎn)三萜類物質(zhì)含量的方法有不少報道，但大多是改變提取方法和提取時間。通過添加中藥提取物來提高牛樟芝液體發(fā)酵產(chǎn)物中三萜類物質(zhì)的含量，目前尚未見報道。本試驗通過向牛樟芝液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同種類、不同濃度的水提物和醇提物，研究中藥提取物對牛樟芝液體發(fā)酵生物量和三萜類物質(zhì)含量的影響。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌種

牛樟芝菌種，由魯東大學農(nóng)學院保存于PDA培養(yǎng)基上。

1.1.2培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基：胡蘿卜200 g L-1（煮汁）、葡萄糖20 g L-1、瓊脂15 g L-1，pH自然。

液體種子培養(yǎng)基：麥芽50 g L-1（煮汁），pH自然。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麥芽50 g L-1（煮汁），pH自然。

1.1.3中藥材

枸杞（Lycium chinenseMill.）、陳皮（Pericarpiumcitri Reticulatae）、薏苡仁（Coix lachrymal-jobi）、連翹[Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl]、當歸 （Radix angelicaSinensis）、蒲公英 （Herba taraxaci）均購自于煙臺中醫(yī)藥世家藥品超市。

1.1.4試劑

95%乙醇、齊墩果酸、高氯酸、冰醋酸、甲醇、香草醛，其中試劑類為國產(chǎn)分析純或化學純。

1.2　方法

1.2.1接種培養(yǎng)

（1） 菌種活化

采用胡蘿卜培養(yǎng)基對保存的菌種進行活化。將低溫保藏菌種在無菌條件下接入胡蘿卜培養(yǎng)基，28℃，暗培養(yǎng)15 d。

（2） 液體種子制備

配制液體菌種培養(yǎng)基，在121℃條件下滅菌30 min，取出培養(yǎng)基，自然冷卻至室溫；在無菌條件下每瓶接入2粒（黃豆粒大小）活化好的菌種，封口。置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，在轉(zhuǎn)速120 r·min-1、溫度28℃條件下培養(yǎng)10 d，即為牛樟芝液體種子。

1.2.2中藥水提物制備

將烘干后的中藥研磨成粉末，加10倍水浸泡0.5 h，用電磁爐煎熬，調(diào)整適當?shù)募訜釡囟?，保持溫和的沸騰狀態(tài)，煮沸30min，過濾，收集提取液，重復提取1次，進行抽濾，濾液合并后蒸發(fā)濃縮，備用。

1.2.3中藥醇提物制備

烘干后的中藥研磨成粉末，稱取梯度濃度的量加入燒杯中，然后加入100 mL95%的乙醇溶液，用封口膜封住杯口，浸提48 h，期間適當?shù)倪M行震蕩。浸提完畢后，進行抽濾，得到的濾液再進行蒸發(fā)濃縮，備用。

1.2.4液體發(fā)酵

在500mL錐形瓶中，分別加入牛樟芝液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基150 mL，分別添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%的枸杞、薏苡仁、陳皮、連翹、當歸、蒲公英的水提物、醇提物。用封口膜封好，放入滅菌鍋中，121℃滅菌30min。冷卻后，接入牛樟芝液體菌種，接種量為1 mL搖床中，溫度28℃，轉(zhuǎn)速120 r·min-1，暗培養(yǎng)20 d。每個樣品設(shè)3個重復，對照不加中藥。

1.2.5生物量測定

用2層200目的尼龍網(wǎng)過濾發(fā)酵液，獲得菌絲體，菌絲體用蒸餾水沖洗2次，然后置于烘箱中60℃干燥至恒重，測定牛樟芝菌絲的干重。

1.2.6總?cè)坪繙y定

取不同中藥培養(yǎng)基中生長的過濾烘干后的牛樟芝菌絲體，研磨成粉末，測定總?cè)频暮俊?/p>

樣品溶液：取菌絲體粉沫狀樣品0.5 g于50mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，超聲波（40 kHz） 提取2 h[12]，提取過程中需要經(jīng)常搖動，3200 r·min-1離心10min，取上清液備用。

標準溶液：精確稱取齊墩果酸10 mg，置于50 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，配置成濃度為0.2 mg·mL-1的標準溶液。

標準曲線的制作：準確量取濃度為0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標準溶液0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL，分別放入具塞磨口試管中，然后沸水浴加熱揮發(fā)去溶劑。在每個試管中加入0.10mL的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，加塞。于60℃水浴恒溫加熱20 min，取出后立即用冰水冷卻，再分別加冰醋酸5mL，搖勻，在550 nm處分別測定吸光度。以吸光度為縱坐標，齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標作圖，得到標準曲線[13]。

樣品溶液的測定：取樣品溶液各0.3 mL，置于3個磨口試管中，沸水蒸干溶劑，按照制作標準曲線的方法測定吸光度值，計算不同培養(yǎng)基不同時期牛樟芝菌絲中總?cè)坪俊?/p>

2　結(jié)果與分析

2.1　不同濃度中藥水提物對生物量的影響

中藥水提物的添加對牛樟芝菌絲體的生長會有促進作用，添加量過大或過小都會產(chǎn)生抑制作用。不同濃度中藥水提物對菌絲體生物量的影響見圖1。

圖1　不同濃度中藥水提物對牛樟芝生物量的影響Fig.1　Effects ofwater extracts of different Chinese herbmedicine on production of biomass

圖1中（a）結(jié)果表明，枸杞水提物和陳皮水提物的添加對牛樟芝菌絲體的生長均有促進作用，在枸杞水提物濃度為1.5%時，菌絲體生物量有所下降，在陳皮水提物濃度為2.1%時，菌絲體生物量有所下降，但對菌絲體生長仍然有促進作用。薏苡仁水提物的添加，在低濃度和較高濃度時對牛樟芝菌絲體的生長產(chǎn)生抑制作用，其余均為促進作用。

圖1中（b）結(jié)果表明，連翹、當歸和蒲公英的水提物對牛樟芝菌絲體生長均有促進作用，隨著濃度增大菌絲體生物量呈上升趨勢，但是在高濃度時菌絲體生物量有降低趨勢。

陳皮、蒲公英、當歸水提物對牛樟芝菌絲體的促進作用較明顯。薏苡仁水提物在濃度為2.1%時，對牛樟芝菌絲體的促進作用最明顯。

2.2　不同濃度中藥醇提物對菌絲體生物量的影響

不同濃度中藥醇提物對牛樟芝菌絲體生物量的影響見圖2。

圖2結(jié)果表明，連翹醇提物不同濃度梯度對牛樟芝菌絲體的生長均有促進作用。蒲公英醇提物對牛樟芝菌絲體生長的促進作用較連翹小，高濃度時促進作用減弱。枸杞醇提物濃度在1.5%時，對牛樟芝菌絲體的生長有明顯的抑制作用。陳皮醇提物濃度高于0.9%時，菌絲體不生長，產(chǎn)生明顯的抑制作用。當歸醇提物在1.2%時，對菌絲體生長產(chǎn)生抑制作用，菌絲體生物量下降，濃度高于1.2%時，菌絲體不生長，產(chǎn)生明顯的抑制作用。

圖2　不同濃度中藥醇提物對牛樟芝生物量的影響Fig.2　Effects of ethanol extracts of different Chinese herb medicine on production of biomass

2.3　不同濃度中藥水提物對牛樟芝菌絲體總?cè)坪康挠绊?/h3>

不同濃度中藥水提物對牛樟芝菌絲體總?cè)坪康挠绊懸妶D3。

圖3　不同濃度中藥水提物對牛樟芝菌絲體總?cè)坪康挠绊慒ig.3　Effects ofwater extracts of different Chinese herbmedicine on the triterpenoids production

從圖3可以看出，不同濃度中藥水提物均能不同程度提高牛樟芝菌絲體總?cè)坪?。連翹醇提物對總?cè)坪康脑黾佑忻黠@的促進作用，增加量可達3倍～4倍，而且隨著濃度的升高，促進作用增強。枸杞水提物對總?cè)坪烤写龠M作用，但是相較連翹來說促進作用較弱，而且隨著濃度升高，促進作用減弱。薏苡仁水提物只在濃度為0.3%、0.9%、2.1%、2.4%時，對總?cè)坪坑休^小的促進作用，其他濃度均產(chǎn)生抑制作用。而陳皮水提物只在濃度為2.1%時，對總?cè)坪坑写龠M作用，其他濃度均產(chǎn)生不同程度的抑制作用。當歸醇提物對總?cè)坪康拇龠M作用較小，但未產(chǎn)生明顯的抑制作用。蒲公英對總?cè)坪吭诘蜐舛葧r促進作用較為明顯。

2.4　不同濃度中藥醇提物對牛樟芝菌絲體總?cè)坪康挠绊?/h3>

不同濃度中藥醇提物對牛樟芝菌絲體總?cè)坪康挠绊懸妶D4。

由圖4可以看出，不同中藥各濃度的醇提物對牛樟芝總?cè)坪烤胁煌潭鹊拇龠M作用。連翹醇提物對總?cè)坪康拇龠M作用最大，在濃度為0.9%時，促進作用已經(jīng)達到了對照的4倍～5倍，濃度1.2%～2.4%時促進作用保持平穩(wěn)。蒲公英對牛樟芝總?cè)坪康拇龠M作用相較連翹來說較小，但是其也能達到對照的1倍～2倍，在濃度為0.6%時，促進作用最明顯，從濃度為1.2%時開始，產(chǎn)生穩(wěn)定的促進作用。其他中藥醇提物，除去菌絲體不生長的，所得到的樣品對總?cè)坪烤a(chǎn)生促進作用，但效果不是特別明顯。

3　討論

中藥中的一些成分可能促進牛樟芝菌絲體的生長，而另一些成分可能抑制牛樟芝菌絲體的生長。中藥本身含有多種活性成分，其中的一些成分可以提高牛樟芝菌絲體總?cè)坪俊?/p>

枸杞、陳皮、薏苡仁、連翹、當歸、蒲公英這六種中藥的水提物和醇提物對牛樟芝菌絲體的生長有不同程度的促進和抑制作用。除薏苡仁在較低和較高濃度時對菌絲體生長有抑制作用外，其他中藥均有不同程度的促進作用。連翹和蒲公英的醇提物對菌絲體生長有明顯促進作用，其余中藥在個別濃度有不同程度的抑制作用。中藥水提物和醇提物對菌絲體生長的促進作用無明顯的差別。中藥醇提物對總?cè)坪康挠绊懕人嵛镆螅B翹和蒲公英尤為明顯，產(chǎn)生明顯的促進作用，而其他中藥醇提物在不同程度均有較小的促進作用，這些試驗結(jié)果可能與中藥中含有促進總?cè)品置诘幕瘜W物質(zhì)有關(guān)，也可能與中藥中本身總?cè)坪枯^高有關(guān)，其作用機制需要進一步研究。

但是，中藥提取物的添加對于牛樟芝液體發(fā)酵提高三萜類物質(zhì)產(chǎn)量提供了創(chuàng)新性的方法，雖然其中的機理還有待進一步的研究，但是已經(jīng)有了合適的方法來解決液體發(fā)酵三萜含量低的問題。采用外源添加物來提高代謝產(chǎn)物的生物合成量或許將成為食（藥）用菌發(fā)酵的新策略和新方法[9]。

參考文獻：

[1]宋愛榮.臺灣樟芝對碳素營養(yǎng)源利用的研究[J].中國食用菌，2004，21（5）：41-43.

[2]劉華，賈薇，張勁松.樟芝菌絲體的不同提取方法及其抗腫瘤活性的研究[J].分離與提取，2008，34（12）：171-175.[3]Yan Geng,Zhe He,Zhen-Ming Lu,etal.Antrodia camphorataATCC 200183 sporulates asexually in submerged culture[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2013(97):2851-2858.

[4]賀元川，陳仕江，賀宗毅，等.樟芝三萜研究進展[J].重慶中草藥研究，2012，66：19-25.

[5]徐泰浩，林芳儀.臺灣地區(qū)樟芝研究概況與發(fā)展趨勢[J].食藥用菌，2011，19（6）：24-29.

[6]李國紅，沈月毛，王啟方，等.發(fā)酵三七中的皂苷成分研究[J].中草藥，2005，36（4）： 499-500.

[7]王身艷，陳建偉，張蔚學，等.雙向發(fā)酵對白芍HPLC指紋圖譜及芍藥苷含量的影響[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2009，23（2）：6-9.

[8]崔月花，楊艷彬,章克昌.幾種中藥對靈芝發(fā)酵影響的研究[J].食用菌學報，2008，15（1）：55-61.

[9]韋朝陽，賀亮，邵雙雙，等.外源添加物對食藥用菌液體發(fā)酵影響的研究進展[J].食品科學，2015，36（7）：245-250.

[10]趙艷，劉高強，朱朝陽，等.不同植物藥提取物對靈芝細胞生長和胞內(nèi)三萜產(chǎn)物形成的影響[J].菌物學報，2011，30（2）：249-254.

[11]楊海龍，吳天祥，章克昌.中藥提取液對靈芝深層發(fā)酵的影響[J].微生物學報，2003，43（4）：519-521.

[12]王光磊，洪華煒，王宮.幾種提取技術(shù)在樟芝總?cè)铺崛≈械膽?yīng)用和比較[J].海峽藥學，2014，26（8）：31-33.

[13]王紅梅，劉海燕，林淼，等.靈芝孢子粉中總?cè)坪繕藴蕼y定方法的改進[J].食用菌學報，2013，20（2）：42-45.