孫月婷，李　敏，潘騰飛，曾志芳，盧小草，張鴻娟，邱棟梁

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002； 2.古田縣經(jīng)作站，福建 古田 352200)

柿樹科(Ebenaceae) 柿屬(DiospyrosL.)中的柿(DiospyroskakiL.)是落葉喬木，原產(chǎn)東亞，主要分布在溫帶、亞熱帶和熱帶，柿屬中以柿種質(zhì)資源最為豐富[1]。中國是柿的主要原產(chǎn)國之一，柿栽培品種數(shù)量已達(dá)1058個(gè)[2-5]。柿樹在中國種植面積廣泛，遺傳多樣性高，栽培歷史已有 3000 多年，是中國主要的栽培果樹之一[6]。柿的果實(shí)成熟后顏色根據(jù)品種呈淺橘黃色到紅色不等，鮮麗悅目，風(fēng)味獨(dú)特，含有多種礦質(zhì)元素、維生素和糖類等。至今為止，已發(fā)現(xiàn)多種活性物質(zhì)，其中包括類胡蘿卜素、黃酮類、脂肪酸、酚類和多種氨基酸、微量元素等。柿在園林中既能觀葉、觀果又能結(jié)合生產(chǎn)，是很好的栽培及綠化造林果樹。根據(jù)在成熟前能否自然脫澀，柿可以分為澀柿和甜柿2類。古田栽培柿已有300多年的歷史，當(dāng)?shù)卦耘嗥贩N大多為澀柿，部分為甜柿。甜柿成熟時(shí)已經(jīng)自然脫澀，可以直接食用，我國上市的柿子大部分是澀柿，采摘后須經(jīng)人工脫澀后方可食用。

ISSR(Inter simple sequence repeat)分子標(biāo)記是類似 RAPD(Random amplified polymorphic DNA)標(biāo)記的一種簡單重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)[7]，是最近幾年在 SSR 微衛(wèi)星分子標(biāo)記(simple sequence repeat)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[8-9]；ISSR 分子標(biāo)記相比于其他標(biāo)記技術(shù)具有快速、靈敏、高效的特點(diǎn)，而且樣品用量少，可重復(fù)性好，方便操作，成本較低，已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性研究，進(jìn)而分析其系統(tǒng)分化規(guī)律，研究群體遺傳結(jié)構(gòu)[10-11]。本文應(yīng)用 ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對古田縣境內(nèi)主要柿子種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為柿子的種質(zhì)資源的收集、鑒定和栽培利用提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

供試材料甜柿(TS)、大粒黃柿(DLH)、雍菜籽柿(YCZ)、小盤柿(XPS)、野生甜柿(YST)、長炮彈柿(CPD)、無名柿(WM)、烏柿(WS)、長尖柿(CJ)、小葉柿(XY)、鴨蛋柿(YD)、棗柿(ZS)、炮彈柿(PD)、八月黃柿(BYH)、猴柿(HS)，均在2016年采集于福建省寧德市古田縣利洋村(編號(hào)、名稱以及來源見表1)。采集新鮮嫩葉，和變色硅膠一同放進(jìn)自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2　方法

1.2.1儀器與試劑高速冷凍離心機(jī)、DK-S22電熱恒溫水浴鍋(上海精宏)、電子天平、DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、電泳槽、梳子、Biometra PCR擴(kuò)增儀(德國耶拿)、Eppendorf BioSpectrometer紫外分光光度計(jì)、JS-3000全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)。

表1　供試材料的編號(hào)、名稱及來源

*：括號(hào)中字母為樣品名稱拼音簡稱，下同。

CTAB提取液(0.1mol·L-1Tris-Hcl pH 8.0，1.5 mol·L-1EDTA，2% CTAB，2% β-巰基乙醇)、β-巰基乙醇、可溶性PVPP、氯仿-異戊醇(24∶1)、無水乙醇、TE緩沖液(10 mmol·L-1Tris-Hcl pH 8.0，0.1mmol·L-1EDTA pH 8.0)、雙蒸水、6×DNA Loading Buffer(福州都拜特生物技術(shù)有限公司)、瓊脂糖、TAE、ISSR引物(上海捷瑞生物科技有限公司)、Gelstain、2×easy taq PCR SuperMix(+dye)(北京全式金生物科技有限公司)、Trans2K PlusDNA Marker(福州都拜特生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2基因組DNA的提取采用植物基因組DNA提取試劑盒和改良的CTAB法提取DNA，DNA試劑盒法提取參照試劑盒說明書進(jìn)行，改良CTAB法參照易慶平[12]的方法進(jìn)行改進(jìn)。比較2種方法提取DNA效果的差異，結(jié)果由圖1可以看出，植物基因組DNA提取試劑盒法提取DNA的效果不理想，濃度過小，DNA不純；而改良CTAB法比植物基因組DNA提取試劑盒法更加高質(zhì)高效，最終全部采取改良CTAB法提取DNA。DNA質(zhì)量及濃度用Cayr-50紫外分光光度計(jì)檢測其完整性，選擇OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，且無拖尾、清晰的DNA于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3、10為供試材料的編號(hào)；S為試劑盒法；C為CTAB法　　圖1　試劑盒與CTAB法提取DNA的差異比較

1.2.3ISSR-PCR擴(kuò)增2×easy taq PCR Super Mix(+dye)為預(yù)混的含有優(yōu)化濃度的高純度的Taq DNA聚合酶、dNTPS、Mg2+、反應(yīng)緩沖液和穩(wěn)定劑等成分的即用型2倍濃度的PCR溶液以及引物、DNA模板和ddH2O混合構(gòu)成20 μL體系，由于引物和模板濃度對實(shí)驗(yàn)影響未知，因此設(shè)計(jì)引物和DNA模板這2種因素的梯度組合進(jìn)行正交試驗(yàn)，以優(yōu)化ISSR體系。將這2種因素分別設(shè)置5個(gè)水平，其中引物水平為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol·L-1，DNA 模板水平為 10、20、30、40、50、60 ng·μL-1，在整個(gè)梯度設(shè)置試驗(yàn)中，隨著各種因素水平的變化，要相應(yīng)調(diào)整ddH2O的量，以保證20 μL體系不變。

綜合考慮各種因素，最終確定最合適的20 μL體系總體積中包括：2×easy taq PCR Super Mix(+dye) 10 μL，引物濃度 0.3 μmol·L-1，DNA 模板 30 ng·μL-1，ddH2O 8.4 μL。PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：預(yù)變性 94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s；退火溫度52 ℃(因引物不同而有所不同)45 s；延伸72 ℃ 90 s；循環(huán)35次；后72 ℃延伸7 min；最后4 ℃ 保存。吸取7 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和2 μL 6×Loading Buffer 混合，以Marker DL 2000 為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在1.5%的瓊脂糖凝膠中用1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳分離，電泳電壓與電流設(shè)置為1∶1(110 V∶110 A)，之后用JS-3000全自動(dòng)凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照分析。

1.2.4引物篩選根據(jù)已經(jīng)優(yōu)化好的體系，選用DNA純度較高的樣品為模板，參照哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套引物序列進(jìn)行篩選，根據(jù)前人實(shí)驗(yàn)，選擇45條引物進(jìn)行篩選，用退火溫度范圍內(nèi)較為合適的溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，先用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步檢測，篩選條帶清晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物作為15個(gè)樣品的鑒定引物。

1.2.5數(shù)據(jù)處理與分析ISSR-PCR擴(kuò)增之后的電泳譜帶結(jié)果中，采用Clark[13]的方法，對DNA條帶的有無進(jìn)行標(biāo)記，有條帶記為1，無條帶記為0，建立二元矩陣。用Ntsys-pc 2.10e軟件進(jìn)行分析，使用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類樹狀圖[14]。

2　結(jié)果與分析

2.1　引物篩選與多態(tài)性分析

篩選出200～2000 bp之間的條帶建立0-1矩陣，最終14條引物共擴(kuò)增出113條DNA條帶，其中多態(tài)帶93條，多態(tài)百分率為82.30%，ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果及其多態(tài)性見表2。不同引物擴(kuò)增條帶數(shù)不等，條帶最少的是UBC853，6條；條帶最多的是UBC855，11條。14條引物平均跑出條帶8.07條，條帶片段大小分布在250～2500 bp之間。其中UBC810和UBC813的多態(tài)性占比為42.86%，相對較低。引物UBC860的擴(kuò)增結(jié)果見圖2。表明寧德市古田縣柿屬種質(zhì)資源遺傳多樣性比較豐富，個(gè)體間遺傳差異較大。

表2　ISSR引物擴(kuò)增及其多態(tài)性

2.2　聚類分析

使用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，得到15份材料的聚類樹狀圖(圖3)，以0.70為閥值的遺傳相似系數(shù)，可將這些材料分為5組。其中第1組為甜柿、大粒黃柿、雍菜籽柿、無名柿、長炮彈柿，第2組為烏柿、小葉柿、猴柿、八月黃、長尖柿、鴨蛋柿、炮彈柿，第3組小盤柿，第4組野生甜柿，第5組棗柿；說明后3組在分子水平上與其它柿屬植物差異較大。

圖2　引物UBC860擴(kuò)增15份柿種質(zhì)資源的電泳結(jié)果圖3　古田柿屬的UDPGM聚類分析樹狀圖

2.3　遺傳相似系數(shù)分析

采用Ntsys-pc 2.10e軟件計(jì)算古田柿種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)，結(jié)果見表3。古田15個(gè)柿種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)范圍為0.8230～0.5841，平均遺傳相似系數(shù)為0.6929。其中，小葉柿、猴柿的遺傳相似系數(shù)最大(0.8230)，說明這2個(gè)材料親緣關(guān)系很近，遺傳差異較小；甜柿、棗柿的遺傳相似系數(shù)最小(0.5841)，表明這2個(gè)材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異較大。

表3　古田柿種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)

3　結(jié)論與討論

ISSR分子標(biāo)記體系的穩(wěn)定性是準(zhǔn)確分析遺傳多樣性的重要條件，而影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的因素包括模版DNA濃度、引物濃度、Taq-DNA聚合酶、dNTP、循環(huán)數(shù)和退火溫度等方面。其中退火溫度影響較大，模板濃度、引物濃度影響較小，本實(shí)驗(yàn)從公司購置Mix，體系穩(wěn)定，簡單方便，省去較多時(shí)間。相較于RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)、RAPD、AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)、SSR(Simplesequencerepeat0)等遺傳標(biāo)記，ISSR具有多態(tài)性高、可靠、重復(fù)性高、方便快捷、成本較低、DNA用量小、安全性較高等優(yōu)點(diǎn)，因此在種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等方面應(yīng)用廣泛[15]。

用篩選到的14條引物對福建古田縣柿子種質(zhì)進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，最終14條引物共擴(kuò)增出113條DNA條帶，其中多態(tài)帶93條，多態(tài)百分率為82.30%。篩選出的引物較少，電泳條帶也較少，可能是由于柿種質(zhì)資源種間親緣關(guān)系較近，不易得到有多態(tài)性的引物。通過形態(tài)與分子層面的比較分析，發(fā)現(xiàn)炮彈柿與長炮彈柿外觀相似，但是口感差別較大，長炮彈柿肉質(zhì)軟而炮彈柿肉質(zhì)脆，雖然名字都為炮彈，但遺傳上沒有實(shí)質(zhì)關(guān)聯(lián)。小盤柿、野生甜柿和棗柿聚類分析后單獨(dú)聚為一類，說明古田縣柿子種質(zhì)資源基因差異較大，分子標(biāo)記能清晰反映基因組本質(zhì)差異[16]。此外在這些供試柿子材料中，炮彈柿外形美觀、極耐儲(chǔ)存，脫澀后風(fēng)味極佳。今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)古田縣柿子資源的管理及利用，以期利用其遺傳差異優(yōu)勢創(chuàng)造優(yōu)良品種，為柿種質(zhì)資源的收集、鑒定和栽培利用提供一些參考。

*：衷心感謝古田縣農(nóng)村聯(lián)動(dòng)服務(wù)中心的林永安高級(jí)農(nóng)藝師和福建農(nóng)林大學(xué)的本科生朱海燕同學(xué)的幫助！

參考文獻(xiàn)：

[1]傅建敏，張嘉嘉，李芳東.柿種質(zhì)資源葉片中黃酮和多酚含量多樣性研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，19(6)：134-139.

[2]楊勇，阮小鳳，王仁梓，等.柿種質(zhì)資源及育種研究進(jìn)展[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(2)：133-137.

[3]李高潮，楊勇，王仁梓.中國原產(chǎn)柿品種資源[J].中國種業(yè)，2006(4)：52-53.

[4]袁錄霞，張青林，郭大勇，等.中國甜柿及其在世界甜柿基因庫中的地位[J].園藝學(xué)報(bào)，2011，38(2)：361-370.

[5]羅正榮，蔡禮鴻，胡春根.柿屬植物種質(zhì)資源及其利用研究現(xiàn)狀[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，15(4)：381-388.

[6]李志民，劉永居，王文江，等.柿的綜合利用及展望[J].果農(nóng)之友，2003(12)：6-7.

[7]張起，安華明.貴州砂梨種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].果樹學(xué)報(bào)，2015，32(1)：6-12.

[8]謝佳燕，張知彬.ISSR標(biāo)記技術(shù)及其在遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J].獸類學(xué)報(bào)，2004，24(1)：71-77.

[9]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994(20)：176-183.

[10]Gupta M,Chyi Y S,Romero-Severson J,et al.Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats[J].Theor Appl Genet，1994(89)：998-1006.

[11]Charters YM，Robertson A，Wilkinson M J，et al.PCR analysis of oliseed rape cultivars (Brassica napus L.ssp.oleifers ) using 5′-anchored simple sequence repeat (SSR) primers[J].Theor Appl Genet，1996(92)：442-447.

[12]易慶平.柿屬植物DNA提取純化檢測技術(shù)體系的建立[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[13]CLARK M S.Plant molecular biology：a laboratory manual[M].Beijing：China Higher Education Press，1998：3-11.

[14]YONG L，DE-CHUN L，BO W，et al.Genetic diversity of pummelo (Citrus grandis Osbeck) and its relatives based on simple sequence repeat markers[J].Chinese Journal of Agricultural Biotechnology，2006，3(2)：119-126.

[15]張青林，羅正榮.ISSR 及其在果樹上的應(yīng)用[J].果樹學(xué)報(bào)，2004，21(1)：54-58.

[16]王志峰，孫日飛，孫小鐳，等.山東省黃瓜地方品種資源親緣關(guān)系的 AFLP 分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31(1)：103-105.