倪海峰，肖穎彬

免疫功能失調(diào)是導(dǎo)致體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）創(chuàng)傷及術(shù)后并發(fā)癥的原因之一，對其致病機制、臨床救治的研究是心外科領(lǐng)域的重要課題。T細胞是機體重要的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)細胞，CPB對Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞功能亞群分化狀態(tài)的影響目前研究尚少。筆者對臨床CPB病例T細胞Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞功能亞群變化及與機體致炎/抗炎反應(yīng)變化關(guān)系進行觀察，報告如下。

1　資料與方法

1.1研究對象 2015年3月—2016年12月，選取二尖瓣瓣膜病患者20例作為試驗組，年齡31～55歲，男10例，女10例；動脈導(dǎo)管未閉患者20例作為對照組，年齡20～39歲，男10例，女10例。納入標準：（1）年齡＞18 歲；（2）診斷明確，欲行 CPB 下二尖瓣置換術(shù)或非CPB下動脈導(dǎo)管結(jié)扎術(shù)；（3）患者知情同意接受該研究。排除標準：（1）有高血壓、冠心病、糖尿病病史，或患有梅毒、乙型肝炎、丙型肝炎者；（2）有活動性感染、風濕活動期、肝腎疾病、慢性阻塞性肺部疾病者；（3）非首次心臟手術(shù)患者；（4）術(shù)前左心室射血分數(shù)＜40%；24 h內(nèi)發(fā)生心絞痛、心肌酶譜升高者；1個月內(nèi)發(fā)生心肌梗死患者；（5）術(shù)前1周內(nèi)服用過影響免疫功能的藥物者。

試驗組于CPB下行二尖瓣置換術(shù)，轉(zhuǎn)流時間62～91 min；對照組于非CPB下行動脈導(dǎo)管結(jié)扎術(shù)，手術(shù)時間65～98 min。于術(shù)前、CPB或手術(shù)開始20 min、停機前或手術(shù)結(jié)束時、術(shù)后4 h、術(shù)后24 h、術(shù)后72 h抽取靜脈血。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，受試對象及親屬簽署知情同意書，研究過程符合倫理學原則。

1．2 方法 濃度梯度法分離單個核細胞，尼龍柱濾除B細胞，獲取T細胞。提取T細胞RNA，－70℃保存。RNA印跡法檢測T細胞IFN－γ/IL－4mRNA表達。細胞內(nèi)因子染色、免疫熒光標記檢測T細胞IFN－γ、IL－4蛋白表達。放射免疫試劑盒檢測血清中IL－6、IL－10 濃度變化。

1.3數(shù)據(jù)處理 GDS8000圖像分析量化，SPSS16．0軟件數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差 （x±s）表示。符合正態(tài)分布，采用配對t檢驗比較組內(nèi)差異；不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)分析；重復(fù)測量采用方差分析比較組間差異。p＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1T細胞IFN-γmRNA蛋白表達變化 與術(shù)前相比，試驗組CPB停機前IFN－γmRNA蛋白表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0．05）；術(shù)后 4 h回升，至術(shù)后 24 h 基本恢復(fù)到術(shù)前水平（P＞0．05）。對照組各時相點IFN－γmRNA蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。 見圖1～4。

圖1　RNA印跡法檢測T細胞內(nèi)IFN-γmRNA表達變化

圖2　T細胞內(nèi)IFN-γmRNA表達變化

圖3　表達IFN-γ蛋白的T細胞數(shù)量變化（激光共聚焦顯微鏡，400×）

圖4　T細胞內(nèi)IFN-γ蛋白表達變化

2.2T細胞IL-4 mRNA蛋白表達變化 與術(shù)前相比，試驗組CPB停機前IL－4 mRNA蛋白表達水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0．05）；術(shù)后 4 h下降，至術(shù)后 24 h 基本恢復(fù)到術(shù)前水平（P＞0．05）。對照組各時相點IL－4 mRNA蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。 見圖5～8。

2.3IL-6水平變化 與術(shù)前相比，對照組手術(shù)開始20 min后，IL－6水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0．01）；手術(shù)結(jié)束后 4 h 達到高峰，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0．01）；術(shù)后 72 h 基本恢復(fù)術(shù)前水平（P＞0．05）。試驗組雖同樣出現(xiàn) IL－6一過性上調(diào)，峰值位于術(shù)后4 h，但升高幅度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0．05）；術(shù)后 72 h 基本恢復(fù)到術(shù)前水平（P＞0．05）。 見圖9。

2.4IL-10水平變化 與術(shù)前相比，試驗組CPB開始20 min后，IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；停機前達到高峰，差異有統(tǒng)計學意義 （p＜0.01）； 術(shù)后24 h基本恢復(fù)到術(shù)前水平 （P＞0.05）。對照組各時相點IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見圖10。

圖5　RNA印跡法檢測T細胞內(nèi)IL-4mRNA表達變化

圖6　T細胞內(nèi)IL-4mRNA表達變化

圖7　表達IL-4蛋白的T細胞數(shù)量變化（激光共聚焦顯微鏡，400×）

圖8　T細胞內(nèi)IL-4蛋白表達變化

圖9　外周血IL-6表達水平變化

圖10　外周血IL-10表達水平變化

3　討論

CPB創(chuàng)傷及并發(fā)癥是重癥心血管外科手術(shù)患者面臨的危險因素之一，其致病機制、預(yù)防干預(yù)與救治研究是心外科領(lǐng)域的重要課題。1999年德國一項對6萬例CPB手術(shù)病例的統(tǒng)計分析顯示：CPB術(shù)后各種感染性、非感染性并發(fā)癥是導(dǎo)致危重患者術(shù)后死亡的重要原因之一［1］。

以往研究表明，CPB可引起機體免疫功能發(fā)生改變，推測CPB創(chuàng)傷及并發(fā)癥與機體免疫功能失調(diào)有關(guān)。T細胞作為機體重要的免疫調(diào)節(jié)、效應(yīng)細胞，可能參與其發(fā)生與演變過程，但對CPB中T細胞分類及功能的變化情況，目前研究尚少。

研究認為，輔助 T細胞（Th）由 Th1、Th2兩個細胞亞群組成，具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，Th1/Th2失衡與多種疾病發(fā)生有關(guān)系［2-6］。臨床研究也觀察到CPB過程中，由Thl細胞分泌的致炎因子IFN-γ以及Th2細胞分泌抗炎因子IL-10水平發(fā)生了顯著變化［7，8］。

進一步研究發(fā)現(xiàn)：細胞毒性T細胞（Tc）也可根據(jù)分泌的細胞因子譜，分為 Tc1和Tc2兩種細胞亞群。Tc1/Tc2細胞亞群具有類似于Th1/Th2細胞亞群的生物學特征：誘導(dǎo)因素、產(chǎn)生的細胞因子種類、參與的免疫應(yīng)答類型、分化調(diào)節(jié)機制等［9，10］。 研究表明：在CD4＋與CD8＋T細胞中，均存在能發(fā)揮同樣雙向調(diào)節(jié)與免疫效應(yīng)的功能亞群。Tc1與Th1淋巴細胞、Tc2與Th2淋巴細胞，雖然細胞表面標志不同，但從功能和生物學效應(yīng)上卻可以分別歸為同一個功能亞群。而隨著對T細胞表面標志與生物學效應(yīng)分子機制的逐步深入研究，以往以細胞表面標志或“效應(yīng)性T細胞/調(diào)節(jié)性T細胞”“輔助性T細胞/抑制性T細胞”等傳統(tǒng)方法進行的分類，已因為不能準確反映真實情況而受到挑戰(zhàn)；而根據(jù)調(diào)節(jié)效應(yīng)、生物學效應(yīng)進行功能亞群分類，則是描述T細胞功能分類的新方法。

因此，筆者采用免疫印跡雜交、細胞內(nèi)因子染色、免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡等分子生物學試驗方法，觀察CPB對T細胞內(nèi)IFN-γ/IL-4mRNA蛋白表達水平影響，了解CPB對Th1、Tc1/Th2、Tc2功能亞群影響。結(jié)果顯示：CPB過程中，T細胞內(nèi)由Th2、Tc2細胞亞群分泌的標志性抗炎介質(zhì)IL-4 mRNA蛋白表達升高，由Th1、Tc1細胞亞群分泌的標志性致炎介質(zhì)IFN-γmRNA蛋白表達下調(diào)，對照組未觀察到類似變化。這種變化說明CPB中T細胞功能亞群發(fā)生變化：分泌致炎因子、誘導(dǎo)細胞免疫的Th1、Tc1細胞減少；分泌抗炎因子、誘導(dǎo)體液免疫的Th2、Tc2細胞增加；T細胞功能亞群分化向Th2、Tc2方向偏移。

筆者從免疫調(diào)節(jié)角度出發(fā)，觀察Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群變化同時，對致炎因子IL-6、抗炎因子IL-10變化進行對照研究。結(jié)果表明：對照組IL-6上調(diào)，IL-10與 Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群無明顯變化；試驗組有不同表現(xiàn)：（1）IL-6雖較術(shù)前仍有升高，但明顯低于對照組表達水平；（2）IL-10明顯上調(diào)；（3）T細胞功能亞群分化向Th2、Tc2方向偏移。分析觀察結(jié)果：對照組致炎因子IL-6表達上調(diào)，是機體非特異性免疫系統(tǒng)（中性粒細胞、補體等）的一種非特異性應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致炎性細胞活化、炎性介質(zhì)表達上調(diào)，對抗手術(shù)創(chuàng)傷；特異性免疫系統(tǒng)Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群未產(chǎn)生變化，抗炎因子IL-10未隨之改變。試驗組中，CPB中低溫、非生理性灌注等因素導(dǎo)致機體內(nèi)環(huán)境變化，機體免疫系統(tǒng)、免疫細胞與CPB管道等各種變應(yīng)原充分接觸，誘導(dǎo)特異性免疫系統(tǒng)Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群產(chǎn)生變化，向Th2、Tc2方向偏移，抗炎因子IL-10上調(diào)，介導(dǎo)機體抗炎反應(yīng)上調(diào)。雖然手術(shù)創(chuàng)傷也活化非特異性免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致炎性介質(zhì)IL-6上升，但由于主導(dǎo)致炎反應(yīng)的Th1、Tc1細胞減少以及介導(dǎo)抗炎反應(yīng)的IL-10的抑制效應(yīng)，表達水平明顯低于對照組。

其他研究結(jié)果顯示：CPB致細胞免疫功能下降、IL-10 等抗炎因子水平升高［8，11］，結(jié)合對炎癥介質(zhì)觀察結(jié)果［12，13］可看出，CPB 對機體非特異性、特異性免疫系統(tǒng)均有影響。這種變化是機體對CPB的一種防御性反應(yīng)，有助于機體平安渡過手術(shù)期。在一些因素作用下，如果對Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群的影響超出防御反應(yīng)范圍，則可能演變成為致病因素：Th2、Tc2細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過度，會引起細胞免疫功能抑制，削弱機體防御能力，易繼發(fā)病原微生物感染，甚至引發(fā)敗血癥、多臟器功能不全、多臟器功能衰竭等一些嚴重并發(fā)癥；Th1、Tcl細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過度，可能引發(fā)全身非特異性炎性反應(yīng)（SIRS），導(dǎo)致各種非感染性并發(fā)癥，亦可損害器官功能，導(dǎo)致嚴重并發(fā)癥?？梢酝茰y，Th1、Tc1/Th2、Tc2淋巴細胞功能亞群的失衡可能與CPB術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)。

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