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(貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，　貴州 貴陽 550025)

黨參為我國著名的常用大宗藥材，為桔?？泣h參屬植物黨參(Codonopsispilosula)、川黨參(C.tangshen)和素花黨參(C.pilosulavar.modesta)的干燥根[1]。因黨參藥食兩用和獨特的功效越來越受到世人的青睞，近年來已成為用量最多的中藥材品種之一。黨參屬(Codonopsis)植物種類繁多，分類鑒定較為困難。除了藥典規(guī)定的3個來源，同屬多種植物的根也常?；鞛辄h參使用，甚至是金錢豹屬(Campanumoea)植物的根在貴州等地區(qū)也作為“土黨參”使用[2]。黨參藥材常常被加工炮制成飲片或以粉末入藥，其性狀特征發(fā)生了較大變化，采用傳統(tǒng)鑒定方法進行準(zhǔn)確鑒別較為困難。

自2003年Hebert[3]首次提出DNA條形碼(DNA barcoding)概念以來，該技術(shù)已成為近年來發(fā)展最快，研究最熱的一門新興技術(shù)。其通過對所獲得的一條或幾條DNA片段進行大范圍地掃描，構(gòu)建DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫[4]，通過比較物種中的一條或少數(shù)幾條通用的DNA片段就能夠?qū)ξ锓N進行快速、準(zhǔn)確的識別和鑒定，具有簡便、快速、可信的巨大優(yōu)勢。Kress和Erickson研究認為，rbcL和psbA-trnH適合植物鑒定[5]。同年，Chase和Cowan等提出，rpoC1、rpoB和matK組合或rpoC1、matK與psbA-trnH組合可用于植物鑒定[6]。Lahaye[7]對蘭科植物進行了研究，提出了matK可以鑒定隱藏新物種的觀點。2009年P(guān)lant Working Group[8]提出matK和rbcL組合鑒定植物。2010年Chen等對6 000余份植物樣品進行了DNA條形碼篩選，結(jié)果表明，ITS 2鑒定效率優(yōu)于matK和rbcL組合[9]。鑒于黨參類藥材鑒定較為困難，對黨參屬和金錢豹屬11個物種53份樣品的psbA-trnH、rbcL、matK及ITS 2序列進行PCR擴增、測序和Barcoding gap分析，比較各序列的擴增和測序效率，種內(nèi)和種間變異，并采用BLAST 1和Nearest Distance方法評價不同序列的鑒定能力，以期為該類植物及藥材的分類鑒定提供新的參考依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1　實驗儀器

PCR儀(9700，美國ABI公司)；低溫高速離心機(Centrifuge 5810 R，德國Eppendof公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GGM/D 2，英國SYNGENE)；電泳儀(DYY-6 C，北京六一儀器廠)；自動蒸汽滅菌鍋(ES-315，深圳市博大精科技實業(yè)有限公司)；微型漩禍混合儀(WH-1，常州易晨儀器制造有限公司)。

1.2　實驗試劑

新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP-320離心柱型，Tiangen公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)；2×TapPCR MasterMix(KT 201，Tiangen公司)；Marker(D 2000，Tiangen公司)；5×TBE電泳緩沖液(SD 8102，上海生工生物工程有限公司)；Goldview I型核酸染色試劑(D 0125，Solarbio)；瓊脂糖(SunShineBio，南京生興生物技術(shù)有限公司)。

1.3　實驗樣品

本研究所有樣品均采集于貴州省、云南省、四川省，共53份，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定，憑證標(biāo)本存放于貴陽中醫(yī)學(xué)院生藥實驗室，實驗材料見表1。

表1樣品來源

種名產(chǎn)地采集日期(年/月/日)憑證標(biāo)本黨參黨參Codonopsispilosula貴州威寧縣2013/05/10ZY130510管花黨參C．tubulosa貴州赫章縣2013/05/31ZY130531雞蛋參C．convolvulacea云南宣威縣2013/08/03ZY130803銀背葉黨參C．a(chǎn)rgentea貴州江口縣2014/08/20ZY140820川黨參C．tangshen貴州威寧縣2013/08/01ZY130801素花黨參C．pilosulavar．modesta貴州威寧縣2013/08/02ZY130802小花黨參C．micrantha貴州威寧縣2013/08/02ZY140802羊乳C．lanceolata四川峨眉山2014/06/10ZY140610大花金錢豹Campanumoeajavanica貴州紫云縣2014/09/20ZY140920金錢豹Cam．javanicasubsp．japonica貴州貴陽市2014/09/14ZY140914長葉輪鐘草Cam．lancifolius貴州貴陽市2013/05/20ZY130520

2　方法與結(jié)果

2.1　實驗方法

2.1.1總DNA提取、凝膠電泳、PCR擴增及測序

選取硅膠干燥的植物葉片約20 mg，采用試劑盒提取總DNA。PCR反應(yīng)體系50μL，體系包含2μL總DNA(約30 ng)、26μL 2×TapPCR MasterMix、引物2μL(2.5μmol/L)和20μL ddH2O。各個標(biāo)記的擴增引物及擴增程序見表2。取5μL PCR擴增產(chǎn)物，以Marker作為標(biāo)記于1.2%的凝膠板上電泳30 min檢測，于凝膠圖像分析系統(tǒng)下觀察，拍照(見圖1)，將獲得的單一明亮條帶產(chǎn)物送生工生物工程有限公司進行測序。

2.1.2數(shù)據(jù)處理

測序峰圖采用序列拼接軟件CodonCode AlignerV 5.12(CodonCode Co.，USA)校對拼接，去掉引物區(qū)及低質(zhì)量區(qū)，所得各序列經(jīng)MEGA 5.0軟件進行多序列比對、查錯；采用 PCR 擴增效率和測定成功率評價各個分子標(biāo)記的擴增及測序情況；利用Song等[10]的方法，計算遺傳距離K 2 P值，比較不同標(biāo)記基因在種間、種內(nèi)變異幅度，最后采用Ross等[11]的比對法和最小距離法考察標(biāo)記基因的鑒定效率。

表2各引物名稱、擴增程序及反應(yīng)體系

標(biāo)記基因引物名引物序列5′?3′擴增條件反應(yīng)體系ITS22FGCGATACTTGGTGTGAAT3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃45s，40cycles，72℃10minMix13μL，引物1μL，總DNA1μL，ddH2O9μLpsbA?trnHfwdGTTATGCATGAACGTAATGCTCrevCGCGCATGGTGGATTCACAATCC94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃45s，30cycles，72℃1minMix13μL，引物1μL，總DNA1μL，ddH2O9μLmatK3F＿KIMCGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG1R＿KIMACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC95℃4min，94℃30s，56℃45s，72℃45s，35cycles，72℃10minMix13μL，引物1μL，總DNA3μL，ddH2O7μLrbcLLACGTAGCTTATCCTTTAGACCHTGGCATAGAGACCCAATCTT94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃45s，30cycles，72℃1minMix13μL，引物1μL，總DNA3μL，ddH2O7μL

圖1　DNA序列部分電泳圖

2.2　結(jié)　果

2.2.1PCR擴增及測序率、序列長度及GC含量

PCR擴增率和測序率是評價DNA條形碼序列的一個重要指標(biāo)。各序列擴增率均為100%。測序率除了matK為96.5%外，其余測序率為100%。序列長度考察發(fā)現(xiàn)，matK最長，其余依次是rbcL、ITS 2和psbA-trnH。同時ITS 2和psbA-trnH序列長度在種間和種內(nèi)差異較大。rbcL在種間和種內(nèi)有一定變化，matK序列長度幾乎無變化，詳見表3。

2.2.2種內(nèi)及種間變異分析

最理想的條形碼是種內(nèi)最大遺傳變異應(yīng)小于種間最小遺傳變異，并且兩者之間有顯著差異。分析序列種間和種內(nèi)變異情況，結(jié)果表明，ITS 2種間變異最大，其余依次是matK、psbA-trnH和rbcL，且ITS 2和matK明顯大于psbA-trnH和rbcL。種內(nèi)變異不大，依次是matK、rbcL、ITS 2和psbA-trnH，詳見表4。

2.2.3不同序列Barcoding gap分析

一條理想的DNA條形碼是種間差異足夠大，種內(nèi)差異盡量小，并且在兩者間形成一個間隔區(qū)。從Barcoding gap種間、種內(nèi)的分布圖來看，4條DNA條序列的Barcoding gap均不明顯，種間、種內(nèi)變異分布呈一邊分散趨勢，不利于該類植物鑒定，見圖2。

表3DNA序列長度及GC含量

項目ITS2psbA?trnHmatKrbcLPCR擴增率(%)100100100100測序率(%)10010096．5100序列范圍(均值)bp437～508(479)336～450(376)820～837(829．2)677～716(708．2)GC含量范圍(均值)%56．3～60．4(58．5)33．8～39．1(37．2)34．7～36．2(35．5)20．1～23．4(21．2)

表44個序列種間種內(nèi)差異

項目ITS2psbA?trnHmatKrbcL種內(nèi)變異0．2325±0．31540．1087±0．20930．2770±0．24620．2338±0．2452θ0．5041±0．65560．2174±0．39620．5657±0．48250．5862±0．5566平均溯祖度0．1427±0．40190．0867±0．26470．3383±0．44810．2558±0．4525種間變異0．6862±0．30960．2214±0．15810．4383±0．23630．1949±0．2738θ’0．0205±0．02540．0206±0．02670．0132±0．01660．0068±0．0069種間最小變異0．7627±0．63580．1890±0．35430．4099±0．45200．2991±0．4638

圖2　DNA條序列的Barcoding gap

2.2.4候選序列鑒定率評價

采用對比法和最小距離法評價4條序列的鑒定率，結(jié)果表明，rbcL鑒定率最高，其余依次是ITS 2、matK和psbA-trnH。詳見表5。

3　討　論

3.1　序列篩選

DNA條形碼是利用基因組中一條公認的、標(biāo)準(zhǔn)的、相對較短的DNA片段來進行物種鑒定的分子鑒定技術(shù)。線粒體基因組進化最慢，對植物分辨率較低，適合動物分子鑒定，不適合植物分子鑒定。相對于線粒體基因，葉綠體基因進化相對較快，適合植物分子鑒定。核基因組進化最快，也適合植物分子鑒定，所以葉綠體基因組和核基因組常用于植物分子鑒定。但葉綠體基因組和核基因組不同序列對各個植物類群又有差異。因此尋找適合各科屬植物鑒定的DNA條形碼成為現(xiàn)階段研究的焦點。本實驗選擇目前認為在各個科屬通用性較好的條形碼來考察黨參屬及其近緣屬的分子鑒定方法。ITS 2為核基因組，是rDNA上位于5.8 S和26 S之間的一段進化速度很快的非編碼區(qū)，物種間變異位點較多，長度很短，具有較高的擴增效率和物種鑒定效率。matK、rbcL和psbA-trnH位于葉綠體基因組，由于其進化速率較快，并且有較多的變異位點，常用于植物的分子鑒定，但3條序列側(cè)重點不同，rbcL適合分類階元較高的類類群，matK和psbA-trnH則恰好相反?？紤]到實驗材料涉及到不同屬，所以選擇了3條葉綠體基因作為黨參屬金錢豹的分子鑒定。

3.2　PCR擴增及測序率

PCR擴增及測序率是進行后續(xù)分類鑒定的前提。本實驗中，4條序列的PCR擴增及測序率較高，基本達100%，說明所選序列在黨參屬和金錢豹屬植物中擴增及測序較好，這為后面的序列分析提供了可能。

表5對比法和最小距離法分析4條候選序列的鑒定效率

序列鑒定方法樣品數(shù)鑒定成功率rbcL對比法4397．9最小距離法43100．0matK對比法5389．7最小距離法5387．9ITS2對比法5182．1最小距離法51100．0psbA?trnH對比法5382．8最小距離法5360．3

3.3　種間、種內(nèi)變異及Barcoding gap評估

一條好的DNA條形碼應(yīng)具有足夠高的種間多樣性，用于區(qū)分不同物種。種間變異、θ’及最小種間距離用于測定種間差異[12-13]。分析結(jié)果表明，ITS 2種間變異最大，顯示出其種間最高的多樣性，其次是matK，最小的是rbcL。種內(nèi)變異、θ及最大種內(nèi)距離用于種內(nèi)差異，matK種內(nèi)變異最大，psbA-trnH種內(nèi)變異最小。

理想的DNA條形碼是遺傳變異種間和種內(nèi)變異明顯分開，不存在重疊現(xiàn)象。根據(jù)Barcoding gap圖，4條DNA序列重疊率均較大，不能將黨參屬及金錢豹屬植物分開。Meyer等[12]和Moritz等[14]用實驗證實了密切相關(guān)的種增加時種內(nèi)和種間的遺傳變異交叉重疊現(xiàn)象會增加，本實驗可能是由于黨參屬與金錢豹屬植物比較近緣，并且每個種數(shù)量較多，因此導(dǎo)致其無明顯的gap區(qū)。

3.4　鑒定率評估

DNA條形碼物種鑒定方法目前主要有對比法(BLAST 1)、最小距離法(Nearest distance)和建樹法(Tree-based method)。本實驗采用對比法、最小距離法用于評價各條序列的鑒定成功率，主要是為了更好地考察各條序列的鑒定能力。對比法[15]是基于相似度的方法將鑒定DNA序列與數(shù)據(jù)庫DNA序列進行兩兩局部比對或搜索短的核苷酸字符串來查找數(shù)據(jù)庫中與之最相似的DNA序列。4條DNA序列對比法鑒定結(jié)果顯示，rbcL鑒定率最高，其次是matK，最低的是psbA-trnH。最小距離法[15]是將鑒定DNA序列與參考DNA序列進行兩兩比對，當(dāng)參考DNA序列與鑒定DNA序列有最小的兩兩比對距離時，則可進行距離判定。4條序列最小距離法鑒定顯示，rbcL和ITS 2鑒定率最高，達到100%，psbA-trnH最低，僅60.3%。使用2種鑒定方法來評價4條序列的鑒定能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rbcL和ITS 2使用最小距離法鑒定效果較好，rbcL和matK使用對比法較佳。綜上所述，rbcL和ITS 2可用于黨參屬及其近緣屬的分子鑒定，matK可作為候選條形碼序列。

參考文獻:

[1]國家藥典委員會.中國藥典(2015年版一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技社,2015:281-282.

[2]孫慶文,黃敏,何順志.高效液相色譜法測定土黨參中黨參炔苷的含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(1):120-121.

[3]Hebert P D N,Ratnasingham S,deWaard J R.Barcoding animal life:cytochrome coxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proc R Soc Lond B Biol Sci,2003,270:96-99.

[4]Kress WJ,Erickson DL.DNA barcodes:Genes,genomics,and bioinformatics[J].Proceedings of the NationalAcademy NationalAcademy of Sciences,USA,2008,105:2 761-2 762.

[5]Kress W J,Erickson D L.A two-locus global DNA barcoding for land plants:the codingrbcLgene complements the non-codingtrnH-psbAspacer region[J].PLOS ONE,2007,2:e 508.

[6]Chase M W,Cowan R S,Hollingsworth P M,et al.A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants[J].Taxon,2007,56:295-299.

[7]Lahaye R,van der Bank M,Bogarin D,et al.DNA barcoding the floras of biodiversity hot spots[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105:2 923-2 928.

[8]CBOL Plant Working Group.A DNA barcoding for land plants[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:12 794-12 797.

[9]Chen S L,Yao H,Han J P,et al.Validation of the ITS 2 region as a novel DNA barcoding for identifying medicinal plant species[J].PLOS ONE,2010,5:e 8 613.

[10]Song J Y,Yao H,Li Y,et al.Authentication of the family Polygonaceae in Chinese Pharmaeopoeia by DNA barcoding technique[J].Journal of Ethnopharmacol,2009,124(3):434-439.

[11]Ross H A,Murugan S,Li W L.Testing the reliability of genetic methods of species ideniification via simulation[J].Syst Biol,2008,57:216-230.

[12]Meyer C P,Paulay G.DNA barcoding: error rates based on comprehensive sampling[J].PLOS Biol,2005,3:e 422.

[13]Meier R,Zhang G Y,Ali F.The use of mean instead of smallest interspecific distances Exaggerates the Size of the“Barcoding Gap”and Leads to Misidentification[J].Syst.Biol.2008,57(5):809-813.

[14]Moritz C,Cicero C.DNA barcoding: promise and pitfalls[J].PLoS Biol,2004,2:e 354.

[15]陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2012:19-20.