，　，　　，　　，　，　

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，　新疆 石河子 832003)

青稞亦稱裸大麥，是生長在我國西北、西南的一種重要的谷類作物。淀粉是青稞籽粒的主要成分之一，占籽粒干重的65%左右。淀粉又可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，兩者的比例是決定淀粉理化特性的重要指標，而淀粉的理化特性與青稞食品的質(zhì)地和表觀性狀密切相關(guān)[1]。

青稞通過光合作用生成光合產(chǎn)物，光合產(chǎn)物從源器官通過一系列的維管系統(tǒng)以蔗糖的形式運輸?shù)綆炱鞴伲笤俳?jīng)過相關(guān)酶催化生成淀粉。淀粉代謝相關(guān)酶主要有腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase，AGPP)、可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase，SSS)、束縛態(tài)淀粉合成酶(granule bound starch synthase，GBSS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)[2-4](合成方向)、α-淀粉酶[5](EC 3.2.1.1)和β-淀粉酶[6](EC 3.2.1.2)(降解方向)。有關(guān)淀粉積累和淀粉代謝酶的關(guān)系已經(jīng)進行了許多研究[4,7]，但關(guān)于青稞灌漿期內(nèi)籽粒的淀粉積累特征、淀粉代謝酶活性的動態(tài)變化及二者的關(guān)系報道相對較少。本實驗以3個不同品種青稞為材料，對籽粒灌漿過程中淀粉積累的特征和淀粉代謝酶活性進行系統(tǒng)研究，旨在探索青稞籽粒灌漿期淀粉積累特征和代謝酶學(xué)機制，為新品種的選育及品質(zhì)鑒定提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與設(shè)計

選取青稞品種北青6號(淀粉含量為97.95%±1.34%[8])、昆侖12號(總淀粉含量為95.57%±0.56%[8])和甘墾5號(支鏈淀粉含量高達98.94%[9])為研究對象。2015年4—7月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗站種植，人工條播，行距20 cm，株距2 cm，小區(qū)面積5 m2，3次重復(fù)。青稞開花期，掛牌、標記穗子中上部穎花在同一天開花的穗子，于花后5，10，15，20，25，30，35 d取樣。每個小區(qū)取40穗，分為兩部分，一部分用于淀粉含量的測定，處理方法：先將籽粒在105 ℃恒溫下殺青30 min，然后將溫度調(diào)至70 ℃恒溫烘干至恒質(zhì)量；另一部分用于酶活性測定，處理方法：將剝?nèi)〉淖蚜Ｓ缅a箔紙包裹，侵入液氮中冷激，取出放入-80 ℃低溫下備用。

1.2　測定項目與方法

1.2.1酶活性與淀粉含量的測定

參照程方民等[10]的方法進行青稞籽粒粗酶液提??；用Nakamura等[11]的方法測定AGPP、SSS和GBSS的活性變化；用李太貴等[12]的方法測定SBE的活性變化；參照何照范等[13]的雙波長比色法測定淀粉含量；α-淀粉酶與β-淀粉酶活性的測定參照DNS還原糖法。

1.2.2淀粉積累特征參數(shù)的計算

根據(jù)淀粉積累量(y)與開花后天數(shù)(t)建立Logistic方程y=k/(1+eA+Bt)，式中，A、B為參數(shù)，K為生長終值量。采用Curve Expert 1.4對籽粒支鏈淀粉和直鏈淀粉積累過程進行擬合[14]，通過對方程求一階導(dǎo)數(shù)可以得到淀粉積累速率方程，并可得出淀粉積累特征參數(shù)。積累速率最大時的日期Tmax=-A/B；積累活躍生長期(大約完成淀粉總積累量的90%)D=[ln(1/9)-A]/B；平均積累速率Vmean=K/D；最大積累速率Vmax=-KB/4；積累起始勢C0=K/(1+eA)[14]。

2　結(jié)果與分析

2.1　青稞籽粒灌漿期淀粉合成酶活性

從圖1 a可看出，3個青稞品種的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性均呈單峰曲線變化。北青6號的最大腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性峰值和達到最大酶活性峰值的時間與昆侖12號和甘墾5號存在差異，北青6號在花后25 d達到峰值外，昆侖12號和甘墾5號均在花后20 d達到峰值；酶活性峰值表現(xiàn)為北青6號>昆侖12號>甘墾5號。

從圖1 b可看出，非糯性青稞品種北青6號和昆侖12號分別在花后20 d和花后25 d左右達到酶活性峰值；顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)灌漿前期的酶活性變化在昆侖12號和北青6號中差異并不顯著，而在灌漿后期兩者之間的GBSS酶活性差異變大，昆侖12號的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶活性明顯大于北青6號，昆侖12號的直鏈淀粉最終積累量也較北青6號高。另外，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)活性在糯性青稞品種甘墾5號中未檢測到。由此推斷，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)活性與青稞籽粒直鏈淀粉合成有關(guān)，決定直鏈淀粉積累量。

從圖1 c可看出，昆侖12號、北青6號和甘墾5號的SSS活性均在花后20 d左右達到峰值，然而在不同類型的青稞品種中，SSS的活性變化之間存在明顯的差異。青稞品種北青6號在整個灌漿期SSS活性變化比較平緩，酶活性峰值也較小。SSS主要參與支鏈淀粉的合成，不同支鏈淀粉含量的青稞品種可溶性淀粉合成酶酶活性峰值表現(xiàn)為甘墾5號>昆侖12號>北青6號。這是因為甘墾5號的淀粉主要組成成分為支鏈淀粉，其百分含量可達98.94%，從而在整個灌漿過程中，甘墾5號的可溶性淀粉合成酶活性均大于另外2個青稞品種。

由圖1 d可看出，3個青稞品種淀粉分支酶活性均呈單峰曲線，且各品種均在花后20 d左右達到峰值。各品種青稞淀粉分支酶活性大小為甘墾5號>北青6號>昆侖12號，支鏈淀粉含量較高的青稞品種淀粉分支酶活性峰值也較大。

2.2　籽粒灌漿期淀粉降解酶活性

圖1　3個青稞品種籽粒灌漿期淀粉合成酶的活性變化

圖2　3個青稞品種籽粒灌漿期淀粉分解酶的活性變化

本實驗測定了3個青稞品種灌漿期淀粉降解酶(α-淀粉酶)的活性變化，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，3個青稞品種的α-淀粉酶活性呈現(xiàn)降—升—降的趨勢，且3個品種之間無顯著差異?；ê?0 d左右最高，北青6號在花后15 d酶活性達到峰谷，而甘墾5號和昆侖12號在花后20 d達到峰谷，這可能是由于品種之間的差異造成的；3個品種的α淀粉酶活性均在花后25 d達到峰值，然后隨灌漿時間延長而逐漸下降。3個品種的β-淀粉酶活性也呈降—升—降的趨勢，品種之間無顯著差異?；ê?0 d達到峰谷，花后30 d再次達到峰值，之后隨灌漿時間的延長逐漸升高。

2.3　3個青稞品種籽粒直、支鏈淀粉和淀粉的積累

從表1可看出，青稞籽粒灌漿過程中直、支鏈淀粉的積累過程符合Logistic方程y=k/(1+eA+Bt)的擬合。由圖3 a和表1可知，昆侖12號的直鏈淀粉最終積累量、起始勢C0、最大灌漿速率Vmax、最小灌漿速率Vmin均高于北青6號，積累速率最大時日期Tmax和積累活躍生長期D值在2個品種之間差異較小。說明相對于北青6號，昆侖12號在籽粒灌漿期時直鏈淀粉的積累起始時間較早，且在整個灌漿過程中昆侖12號的直鏈淀粉積累速率快于北青6號，因此最終積累量高于北青6號。由此推斷，直鏈淀粉最終積累量是由積累啟動時間的早晚和積累速率的快慢決定的。另外，甘墾5號淀粉的主要組成成分是支鏈淀粉，在本實驗中未檢測到甘墾5號的直鏈淀粉。

從圖3 b可以看出，在灌漿前期，3個青稞品種支鏈淀粉積累量表現(xiàn)為昆侖12號>北青6號>甘墾5號；而在灌漿后期，各青稞品種支鏈淀粉積累量表現(xiàn)為北青6號>昆侖12號>甘墾5號。主要是因為灌漿前期昆侖12號的C0大于北青6號和甘墾5號，而北青6號的Vmax、Vmin均大于昆侖12號和甘墾5號，且達到最高速率的時間較晚，而相對積累時間較長，因此北青6號的最終積累量相對較高。甘墾5號的C0、Vmax、Vmin相對較小，在整個灌漿過程中，甘墾5號的支鏈淀粉積累量相對較低。支鏈淀粉最終積累量也是由積累時間的早晚和積累速率的快慢決定的。

圖3　3個青稞品種籽粒灌漿期淀粉(包括直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉)積累量的變化

表13個青稞品種支鏈淀粉和直連淀粉積累特征參數(shù)

淀粉組分品種logistic方程：y=k/(1+e(A+Bt))R2Tmax(d)D(d)Vmean[mg/(g·d)]Vmax[mg/(g·d)]C0支鏈淀粉甘墾5號y=9．3580/(1+e(3．7796-0．1942X))0．982319．467430．78450．3040．45420．2089Amylopectin北青6號y=19．0082/(1+e(4．1391-0．1770X))0．980923．388535．80410．53090．8410．2982昆侖12號y=16．3885/(1+e(3．3795-0．1681X))0．97720．107733．18080．49390．68860．5399直連淀粉北青6號y=5．8343/(1+e(11．5215-0．4972X))0．989623．170527．58930．21150．72530．0001Amylose昆侖12號y=7．0463/(1+e(10．5734-0．4536X))0．982323．312428．15690．25030．7990．0002

注：Tmax為速率最大時的日期；D為活躍生長期(完成淀粉總積累量的90%)；Vmean為平均積累速率；Vmax為最大積累速率；C0為積累起始勢。

從圖3 c可看出，籽粒灌漿期北青6號與昆侖12號從開花到花后20 d淀粉的積累量與花后25 d以后淀粉的積累量呈極顯著差異。而支鏈淀粉含量較高的甘墾5號在整個灌漿過程中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，但是淀粉積累量不存在時期上的顯著差異。這可能是由于品種之間的差異造成的。

2.4　淀粉代謝酶活性與淀粉積累速率的相關(guān)性分析

前人研究表明，在4個淀粉合成酶中除AGPP活性與淀粉積累速率極顯著正相關(guān)外，SSS、GBSS和SBE等單一酶活性的與淀粉積累速率并無必然聯(lián)系[15]。由表2可知，青稞籽粒灌漿期淀粉合成酶AGPP、SSS、GBSS和SBE活性與總淀粉積累速率和支鏈淀粉積累速率均呈極顯著或顯著正相關(guān)。而直鏈淀粉積累速率與 AGPP、GBSS和SBE呈顯著正相關(guān)，而SSS未呈現(xiàn)顯著性相關(guān)，可能是由于SSS主要參與支鏈淀粉合成導(dǎo)致的。而灌漿期總淀粉積累速率、直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率與3個青稞品種的α-淀粉酶呈負相關(guān)，與3個青稞品種的β-淀粉酶呈顯著或極顯著負相關(guān)。α-淀粉酶與β-淀粉酶均為淀粉降解酶，說明β-淀粉酶活性對灌漿期總淀粉積累速率、直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率的調(diào)節(jié)作用較α-淀粉酶的調(diào)節(jié)作用強。

表2代謝酶活性與淀粉積累速率的相關(guān)性分析

酶品種直鏈淀粉積累速率支鏈淀粉積累速率淀粉積累速率AGPP甘墾5號-0．878??0．878??北青6號0．829?0．983??0．925??昆侖12號0．6680．934??0．871?SSS甘墾5號-0．857?0．857?北青6號0．5560．848?0．838?昆侖12號0．570．886??0．841?GBSS甘墾5號-0．952??0．592??北青6號0．748?0．854?0．924??昆侖12號0．751?0．993??0．970??SBE甘墾5號---北青6號0．765?0．878??0．935??昆侖12號0．760?0．966??0．944??α?淀粉酶甘墾5號--0．0066-0．0066北青6號-0．0627-0．3668-0．2725昆侖12號-0．187-0．2947-0．3272β?淀粉酶甘墾5號--0．8621?-0．8621?北青6號-0．7543?-0．7687?-0．8522?昆侖12號-0．9601??-0．9355??-0．9601??

注：“*”、“**”分別代表0.05和0.01顯著性水平。

3　討　論

關(guān)于AGPP、SSS、GBSS和SBE這幾種淀粉合成的關(guān)鍵酶，前人在水稻[12]、小麥[13]、玉米[14]等多種籽粒淀粉中淀粉合成酶作用的研究相對較多，且不同外界環(huán)境條件[15](包括溫度、水分、氮肥)、不同品質(zhì)[16]中淀粉合成酶的活性也不盡相同。本試驗結(jié)果(表2)表明，青稞籽粒灌漿期支鏈淀粉積累速率和總淀粉積累速率與4種淀粉合成酶的活性變化均呈顯著或極顯著正相關(guān)。本試驗中所用青稞材料根據(jù)總淀粉含量排序依次是北青6號>昆侖12號>甘墾5號，相關(guān)性分析表明，AGPP的酶活性變化與淀粉的積累速率(包括支鏈淀粉積累速率、直鏈淀粉積累速率及總淀粉積累速率)呈顯著或極顯著正相關(guān)，從而說明較高的AGPP活性為淀粉積累量的增加提供了更強的供給能力。因此，AGPP酶在提高青稞淀粉含量中起著關(guān)鍵性的作用，這與曹穎妮[2]的研究結(jié)果相一致。

鄧萬洪等研究發(fā)現(xiàn)，小麥籽粒直鏈淀粉含量與Waxy蛋白含量呈高度正相關(guān)，利用反義RNA技術(shù)沉默GBSS基因得到GBSS轉(zhuǎn)基因植株的高代品系，其GBSS酶活性與直鏈淀粉含量均極低[16]。本研究結(jié)果與前人的研究一致，GBSS酶活性與直鏈淀粉合成密切相關(guān)，與直鏈淀粉合成密切相關(guān)，與直鏈淀粉積累速率顯著相關(guān)，且直鏈淀粉含量較高的青稞GBSS酶活性較高。

王月福等認為，如果SSS酶活性越高，利用底物ADPG合成支鏈淀粉的能力就越強[17]。本試驗中支鏈淀粉含量高的甘墾5號其SSS活性也較高，相關(guān)性分析表明， SSS的酶活性變化與支鏈淀粉積累速率呈極顯著正相關(guān)，同時AGPP和SBE的酶活性變化也同樣與支鏈淀粉積累速率呈顯著正相關(guān)，從而可以推斷，支鏈淀粉的合成可能是由AGPP、SSS、SBE 3個酶協(xié)同完成的，而SSS酶是支鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶。

谷類作物籽粒中的支鏈淀粉是在SBE與SSS共同作用下形成的，并且對支鏈淀粉結(jié)構(gòu)形成起重要作用[18]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，青稞籽粒灌漿期SBE活性與直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率均呈顯著正相關(guān)，這說明SBE不僅參與支鏈淀粉的合成，也參與直鏈淀粉的合成。且SBE的活性值接近或滯后于SSS活性峰值，由此推斷，SSS酶活性在最終支鏈淀粉積累量的過程中起著決定性的作用，而SBE主要參與支鏈淀粉精細結(jié)構(gòu)的形成。

谷類中α-淀粉酶與β-淀粉酶在籽粒灌漿期的重要性已經(jīng)有比較普遍的闡述[19]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，灌漿期總淀粉積累速率、直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率與3個青稞品種的α-淀粉酶呈負相關(guān)，與3個青稞品種的β-淀粉酶呈顯著或極顯著負相關(guān)。α-淀粉酶與β-淀粉酶均為淀粉降解酶，說明β-淀粉酶活性對灌漿期總淀粉積累速率、直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率的調(diào)節(jié)作用較α-淀粉酶的調(diào)節(jié)作用強。

灌漿初期淀粉合成酶(AGPP、GBSS、SSS、SBE)活性較小，而淀粉降解酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶)活性較強，淀粉合成能力較弱，合成的淀粉部分被α-淀粉酶和β-淀粉酶分解為葡萄糖、麥芽糖、α-1,6糖苷鍵的糊精和極限糊精，淀粉的合成速率較低，淀粉的積累量相對較少；隨著籽粒的灌漿進行，淀粉合成酶AGPP、GBSS、SSS和SBE活性均逐漸增大，淀粉合成速率也隨之上升，從而使得淀粉快速積累，淀粉分解酶α-淀粉酶和β-淀粉酶分解方向活性緩慢下降，籽粒中淀粉的合成速率大于分解速率，淀粉整體合成速率加快，導(dǎo)致淀粉大量積累；乳熟期以后，α-淀粉酶和β-淀粉酶分解方向活性有所回升，AGPP、GBSS、SSS和SBE合成方向活性下降，籽粒內(nèi)的合成速率小于分解速率，淀粉整體合成速率減慢，但淀粉繼續(xù)積累。青稞籽粒灌漿過程中淀粉含量積累是由于淀粉合成酶活性的增強，而不是分解酶活性的減弱。因此，青稞籽粒中淀粉積累是淀粉代謝酶(合成和分解方向)綜合作用的結(jié)果。

參考文獻：

[1]鄒弈星,潘志芬,鄧光兵,等.青藏高原青稞的淀粉特性[J].麥類作物學(xué)報,2008,28(1):74-79.

[2]曹穎妮.小麥籽粒灌漿期淀粉合成酶學(xué)機制及基因表達模式的研究[D]:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012.

[3]王自布,李衛(wèi)華,齊軍倉,等.小麥籽粒胚乳淀粉合成酶基因表達及酶活性分析[J].核農(nóng)學(xué)報,2010,24(6):1 117-1 123.

[4]Radchuk VV,Borisjuk L,Sreenivasulu N,et al.Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain[J].Plant physiology,2009,150(1):190-204.

[5]張海萍,閻長生.小麥遲熟α-淀粉酶的研究進展[J].麥類作物學(xué)報,2003,23(1):81-85.

[6]Zanella M,Borghi GL,Pirone C,et al.β-amylase 1(BAM 1) degrades transitory starch to sustain proline biosynthesis during drought stress[J].Journal of experimental botany,2016,67(6):1819-1826.

[7]趙俊曄,于振文.小麥籽粒蛋白質(zhì)和淀粉代謝及其與品質(zhì)形成關(guān)系的研究進展[J].麥類作物學(xué)報,2005,25(3):106-111.

[8]張文會,強小林.青藏區(qū)主要青稞品種淀粉理化特性分析[J].食品研究與開發(fā),2014,35(4):14-18.

[9]李潤喜,李學(xué)才,毋玲玲.黑裸大麥甘墾5號的營養(yǎng)功能特性及利用[J].甘肅科技,2012,28(18):169-170.

[10]程方民,蔣德安.早秈稻籽粒灌漿過程中淀粉合成酶的變化及溫度效應(yīng)特征[J].作物學(xué)報,2001,27(2):201-206.

[11]Nakamura Y,Yuki K,Park S-Y,et al.Carbohydrate metabolism in the developing endosperm of rice grains[J].Plant and Cell Physiology,1989,30(6):833-839.

[12]李太貴,沈波.Q酶在水稻籽粒堊白形成中作用的研究[J].作物學(xué)報,1997,23(3):338-344.

[13]何照花.谷物中直.支鏈及總淀粉雙波長測定法[J].生物化學(xué)與生物物理進展,1981(1):70-72.

[14]李世清,邵明安,李紫燕,等.小麥籽粒灌漿特征及影響因素的研究進展[J].西北植物學(xué)報,2004,23(11):2 031-2 039.

[15]劉霞,姜春明,鄭澤榮,等.藁城8901和山農(nóng)1391淀粉合成酶活性和淀粉組分積累特征的比較[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(5):897-903.

[16]鄧萬洪,晏本菊,任正隆.糯性小麥研究進展[J].麥類作物學(xué)報,2007(1):166-171.

[17]王月福,于振文.小麥籽粒灌漿過程中有關(guān)淀粉合成酶的活性及其效應(yīng)[J].作物學(xué)報,2003,29(1):75-81.

[18]Smith AM,Denyer K,Martin CR.What controls the amount and structure of starch in storage organs[J].Plant physiology,1995,107(3):673.

[19]Barrero JM,Mrva K,Talbot MJ,et al.Genetic,hormonal,and physiological analysis of late maturity α-amylase in wheat[J].Plant physiology,2013,161(3):1 265-1 277.