，　，　　，　，　

(1.遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所，　遼寧 遼陽 111000；　2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，　沈陽 110161)

種子作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵材料，通常具有一個(gè)生命體、一個(gè)營養(yǎng)供應(yīng)體和一個(gè)保護(hù)結(jié)構(gòu)[1]，生命體的活性、自身營養(yǎng)供應(yīng)、保護(hù)結(jié)構(gòu)的完整性，三者共同決定了種子的發(fā)芽、出苗和成苗能力。1977年，國際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA)將種子在發(fā)芽和出苗期間的活性強(qiáng)度及特征的綜合表現(xiàn)定義為種子活力[2-3]。

種子生理成熟后便進(jìn)入貯藏或休眠階段，該階段種子會(huì)發(fā)生老化或劣變，發(fā)芽率和活力等隨之降低。Gove等[4]將種子老化和劣變定義為：種子的生活力、品質(zhì)及其性能從一個(gè)較高水平下降至較低水平的不可逆的變化過程。種子的老化或劣變包含一系列的變化。從外表看，包括種皮變色，光澤度降低，油脂種子“走油”等[5]。從內(nèi)部結(jié)構(gòu)看，主要表現(xiàn)為細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的變化，突出表現(xiàn)為膜系統(tǒng)受損，膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生轉(zhuǎn)變[5-6]，滲漏加速。從生理方面看，丙二醛(MDA)、抗壞血酸(AsA )、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等物質(zhì)含量或酶活性升高或較低，呼吸作用與ATP含量變化，核酸與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)合成能力明顯下降，甚至染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生畸變、DNA斷裂等[4]。從萌發(fā)情況上看，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和整齊率下降，生長緩慢[6]，抗逆性下降，弱苗、白化苗、畸形苗增多，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致生活力喪失[7]，從而造成難以估計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失[5,8]。

種子劣變受多方面因素影響，包括內(nèi)部因素和外部因素。種子劣變的機(jī)理目前認(rèn)為與膜損傷、大分子物質(zhì)變化、有毒物質(zhì)積累和內(nèi)源激素不平衡有關(guān)[9]。影響種子老化或劣變的因素以及種子老化過程中的生理生化變化是前人研究所關(guān)注的問題，研究范圍包括玉米[10]、大豆[11]、小麥[12]、花生[13]、大麥[14]等主要農(nóng)作物，也包括苜蓿[15,25]、羅布麻[16,23]、中草藥[17]等，但迄今為止，尚無棉花種子此類研究的報(bào)道。

棉花作為我國主要的農(nóng)作物，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)乎國計(jì)民生。棉花種子分2類：一類為毛籽，即經(jīng)過初步軋花后，表面附有短絨的種子；一類為光籽，即脫去短絨后的光滑種子。經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，毛籽耐貯藏，耐播種期的不利條件(如低溫等)；而光籽出苗快，易于操作，尤其適于機(jī)械播種。棉籽含油量較高，為探討光籽和毛籽的老化過程差異以及對(duì)種子活力的影響，2016年進(jìn)行了棉花種子人工老化試驗(yàn)，以期為棉花種子的貯藏和利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1　試材及處理

以2015年收獲的棉花品種遼棉23號(hào)和遼棉31的種子為試材。將所選試材分成2部分，一部分不脫絨為毛籽，另一部分利用硫酸脫絨成光籽。選取適量的飽滿種子，分別裝在網(wǎng)袋中，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行老化處理。條件設(shè)置為溫度T=40 ℃、濕度R=100%，避光，處理時(shí)間分別為2，4，6，8 d，以未經(jīng)老化處理的種子為對(duì)照(ck)。處理結(jié)束后，將樣本置于室溫下1～2 d，恢復(fù)正常溫濕度。為避免短絨對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響，將毛籽用硫酸脫絨成光籽。

1.2　種子生理指標(biāo)的測定

將各處理種子在室溫條件下用蒸餾水浸泡24 h，種子激活后，即可進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

采用DDBJ-350型電導(dǎo)率儀測定并計(jì)算種子外滲液電導(dǎo)率值，采用TBA比色法測定種子丙二醛(MDA)含量，采用愈創(chuàng)木酚法測定種子過氧化物酶(POD)含量，采用紫外吸收法測定種子過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)含量。具體操作方法參考李玲等編寫的《植物生理學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)技術(shù)》。因?yàn)楸驹囼?yàn)試材為種子材料，樣品含水量較少，因此在研磨時(shí)，將研磨緩沖液加倍。

所有指標(biāo)的測定均重復(fù)3次，最終結(jié)果取平均值。

1.3　種子發(fā)芽率測定

參照標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)，將經(jīng)過老化處理的光籽及經(jīng)過脫絨的毛籽用5%硼酸消毒5 min，選取50粒，放在墊好濾紙的培養(yǎng)皿中，添加足量蒸餾水；將培養(yǎng)皿置于人工氣候箱內(nèi)，溫度設(shè)置為28 ℃，每天光照12 h。第4天和第7天檢查發(fā)芽情況并計(jì)算發(fā)芽率。

2　結(jié)果與分析

2.1　種子滲出液電導(dǎo)率比較分析

由圖1可見，隨著種子老化程度加深，種子滲出液電導(dǎo)率值也在提高。說明種子的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)在老化過程中被破壞，滲出量增加，這一點(diǎn)與前人的研究結(jié)果相符合。

圖1　種子滲出液電導(dǎo)率

遼棉23號(hào)種子滲出液電導(dǎo)率值低于遼棉31種子，說明其細(xì)胞膜受破壞程度要輕一些。以往的經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，毛籽由于有短絨保護(hù)，比光籽更耐貯存，但本試驗(yàn)中毛籽的滲出液電導(dǎo)率卻高于光籽，這個(gè)現(xiàn)象有待進(jìn)一步探討。

2.2　種子丙二醛(MDA)含量比較分析

由圖2可見，種子丙二醛(MDA)含量的變化表現(xiàn)比較復(fù)雜，曲線呈波動(dòng)狀態(tài)。

光籽的MDA含量呈上升—下降—再上升的趨勢(shì)，而且遼棉31的表現(xiàn)要平穩(wěn)一些，遼棉23號(hào)在老化4 d時(shí)有一個(gè)明顯的飛躍，之后再進(jìn)入平穩(wěn)狀態(tài)。毛籽的MDA含量首先明顯下降，之后遼棉23號(hào)持續(xù)下降，到老化8 d時(shí)有所上升；而遼棉31號(hào)呈上升—下降—再上升的波動(dòng)狀態(tài)。遼棉23號(hào)光籽的MDA含量要高于遼棉31，但毛籽的MDA含量由于波動(dòng)較大，不宜進(jìn)行比較。

圖2　種子丙二醛(MDA)含量

2.3　種子過氧化物酶(POD)活性比較分析

由圖3可見，種子過氧化物酶(POD)活性的變化表現(xiàn)比較復(fù)雜，但是除遼棉31光籽呈現(xiàn)較強(qiáng)烈波動(dòng)狀態(tài)外，總體下降—上升—再下降的趨勢(shì)。

圖3　種子過氧化物酶(POD)活性

遼棉23號(hào)無論是光籽還是毛籽，其種子內(nèi)POD活性都呈先下降—后上升—再下降的趨勢(shì)，光籽的波動(dòng)較大。遼棉31號(hào)光籽的POD活性總體曾上升趨勢(shì)，但在老化4 d時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰值；而毛籽的POD活性呈現(xiàn)平穩(wěn)上升趨勢(shì)。

2.4　種子過氧化氫酶(CAT)活性比較分析

由于具體原因，本試驗(yàn)只得到了遼棉23號(hào)種子的過氧化氫酶(CAT)活性值。由圖4可見，種子CAT活性表現(xiàn)為先升高、后降低的趨勢(shì)。毛籽的CAT活性明顯高于光籽?？梢哉J(rèn)為，毛籽有短絨保護(hù)，受老化影響較小，所以激活后，其CAT活性較高。

2.5　種子超氧化物歧化酶(SOD)活性比較分析

由于具體原因，本試驗(yàn)只得到了遼棉31種子超氧化物歧化酶(SOD)活性值。由圖5可見，光籽的SOD活性表現(xiàn)為先明顯升高、后迅速降低、到處理6 d時(shí)趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。毛籽的SOD活性表現(xiàn)輕微下降、再緩慢上升、到老化6 d時(shí)明顯下降的趨勢(shì)。光籽的SOD活性高于毛籽，這一點(diǎn)與預(yù)期結(jié)果相悖，需要進(jìn)一步試驗(yàn)加以印證。

圖4　遼棉23號(hào)種子過氧化氫酶(CAT)活性

圖5　遼棉31種子超氧化物歧化酶(SOD)活性

圖6　種子發(fā)芽率(第4天，第7天)

2.6　種子發(fā)芽率比較分析

由圖6可見，發(fā)芽第7天時(shí)的發(fā)芽率稍高于第4天時(shí)的發(fā)芽率。對(duì)于經(jīng)過老化處理6 d和老化處理8 d的種子，光籽的發(fā)芽率低于20%，毛籽的發(fā)芽率低于10%，并且第4天和第7天時(shí)差別不大，已經(jīng)基本喪失發(fā)芽能力。比較來說，遼棉23號(hào)基本表現(xiàn)為毛籽的發(fā)芽率高于光籽的發(fā)芽率，而遼棉31在發(fā)芽第7天時(shí)明顯表現(xiàn)光籽的發(fā)芽率高于毛籽的發(fā)芽率，發(fā)芽第4天時(shí)這個(gè)趨勢(shì)不明顯。

2個(gè)品種的發(fā)芽率都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。遼棉23號(hào)表現(xiàn)活躍一些，其對(duì)照處理發(fā)芽率較高，老化處理2 d的發(fā)芽率最高，老化處理4 d的發(fā)芽率急劇下降，到老化處理6 d和老化處理8 d，其發(fā)芽能力已經(jīng)基本喪失。遼棉31的表現(xiàn)要遲鈍一些，其發(fā)芽率的峰值出現(xiàn)在老化處理4 d，總體來說，發(fā)芽率低于遼棉23。

3　結(jié)論與討論

3.1　種子老化過程中的一系列生理反應(yīng)

關(guān)于種子老化過程中的生理生化指標(biāo)變化，前人進(jìn)行了大量的研究。周國棟等關(guān)于芒麥種子的研究表明，老化后種子細(xì)胞膜的透性增加，浸出液電導(dǎo)率也隨之增加，有毒害作用的丙二醛(MDA)含量增加[18]。李雪峰等關(guān)于辣椒種子的研究得出同樣的結(jié)果，即隨著種子老化程度加深，種子浸出液電導(dǎo)率升高，丙二醛(MDA)含量增加[19]。同樣的結(jié)論也出現(xiàn)在麻黃[20]、實(shí)葶蔥[21]、結(jié)球白菜[22]等種子的研究上。在酶活性方面，劉霞等關(guān)于藍(lán)萼香茶菜種子的研究表明，種子老化會(huì)導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)能力降低，過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性都會(huì)降低[23]。張永娟等在羅布麻種子老化機(jī)理研究的過程中也發(fā)現(xiàn)，隨著種子老化程度的加深，過氧化氫酶(CAT)和脫氫酶活性隨之降低，并且這2個(gè)比較敏感的指標(biāo)可以作為測定種子活力的生化指標(biāo)來檢驗(yàn)種子的劣變程度[24]。

本試驗(yàn)中，隨著種子老化程度的加深，種子滲出液電導(dǎo)率呈升高趨勢(shì)，這一點(diǎn)與前人的研究結(jié)果相符；丙二醛(MAD)含量方面，除毛籽老化處理2 d的有明顯下降外，其余處理呈緩慢上升趨勢(shì)；過氧化物酶(POD)活性也呈波動(dòng)狀態(tài)，但波動(dòng)幅度較小，基本呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)；過氧化氫酶(CAT)活性在老化處理2 d時(shí)有一個(gè)峰值，之后微幅波動(dòng)，總體呈下降趨勢(shì)；超氧化物歧化酶(SOD)活性與其類似，只是毛籽的峰值出現(xiàn)在老化處理6 d。總體來說，該試驗(yàn)在種子滲出液電導(dǎo)率和丙二醛(MAD)含量2個(gè)指標(biāo)上所得到的結(jié)論與前人的研究結(jié)果基本相符；在酶活性方面，過氧化氫酶(CAT)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性所得結(jié)論基本相符，但過氧化物酶(POD)活性變化趨勢(shì)還有待進(jìn)一步印證。

3.2　不同棉花品種之間、光籽與毛籽之間對(duì)老化處理的反應(yīng)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)品種對(duì)老化處理的反應(yīng)有明顯的區(qū)別?？傮w來說，遼棉31的耐貯藏能力相對(duì)較差，因?yàn)槠錆B出液電導(dǎo)率、丙二醛(MAD)含量都較高，而過氧化物酶(POD)活性卻較低，而且，隨著老化程度加深，差距也會(huì)越來越大。光籽和毛籽對(duì)老化處理的反應(yīng)也有區(qū)別，滲出液電導(dǎo)率、過氧化氫酶(CAT)活性2個(gè)指標(biāo)，毛籽要高于光籽；而過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性2個(gè)指標(biāo)，光籽要高于毛籽；丙二醛(MAD)含量本試驗(yàn)中趨勢(shì)不明顯。由此可見，棉花種子貯藏過程中，不同品種、不同處理的種子要分別對(duì)待，以保證種子的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3.3　種子滲出液電導(dǎo)率變化情況與預(yù)期相反

有研究表明，隨著老化程度的加深，細(xì)胞膜質(zhì)結(jié)構(gòu)受損程度會(huì)加深，種子滲出液電導(dǎo)率也會(huì)隨之升高[18-22]，這一點(diǎn)在本試驗(yàn)中得到了證實(shí)。但是，以往的經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，毛籽由于有短絨保護(hù)，比光籽更耐貯存。但本試驗(yàn)中毛籽的滲出液電導(dǎo)率高于光籽，說明其受破壞程度較重，這個(gè)現(xiàn)象與經(jīng)驗(yàn)相悖。

本試驗(yàn)中，毛籽老化后要經(jīng)過硫酸脫絨才能進(jìn)行試驗(yàn)，而光籽是約3個(gè)月前脫絨處理的。硫酸脫絨的過程中，種皮會(huì)遭到破壞(包括機(jī)械損傷和化學(xué)損傷)，但種子作為活體，有一定的自愈功能，通過油脂外滲、細(xì)胞修復(fù)等，種皮的損傷會(huì)得到一部分修復(fù)，從而抗老化程度有所恢復(fù)。推論認(rèn)為這是本試驗(yàn)中毛籽的滲出液電導(dǎo)率高于光籽的原因，還需要進(jìn)一步證實(shí)，尤其是種子對(duì)于損傷的修復(fù)機(jī)理，還有待研究。

3.4　老化處理對(duì)種子發(fā)芽率的影響

本試驗(yàn)中，無論是毛籽還是光籽、第4天還是第7天，其發(fā)芽率都表現(xiàn)為先上升、后下降的趨勢(shì)，即：與對(duì)照相比，老化處理2 d的種子發(fā)芽率最高，其后下降。老化處理6 d時(shí)，種子的發(fā)芽率已經(jīng)在10%以下，老化處理8 d的種子發(fā)芽率更低，根據(jù)通常概念，此時(shí)的種子已經(jīng)沒有應(yīng)用價(jià)值。

溫湯浸種是生產(chǎn)中常用的催芽方法，是種子熱擊處理的方法之一。該方法一般是在40～60 ℃的條件下將種子處理30 min，從而增強(qiáng)種皮的通透性，使氧氣順利進(jìn)入種子內(nèi)部，增強(qiáng)種子的代謝活動(dòng)，為種子萌發(fā)提供充足的物質(zhì)和能量。王旭明等將番茄種子在40 ℃條件下處理20 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種子發(fā)芽率得到顯著提高[25]?？琢铉鞯仍谘芯坷匣瘜?duì)苜蓿硬實(shí)種子的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，老化處理后種子的發(fā)芽率、浸出液電導(dǎo)率較處理前均有所提高[26]。劉旭歡等研究老化處理對(duì)春小麥種子活力的影響也認(rèn)為，從老化4 d開始，隨著老化時(shí)間增長，發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)均呈明顯下降趨勢(shì)，認(rèn)為種子在短時(shí)間內(nèi)受到高溫高濕脅迫傷害較輕，老化的時(shí)間越長，種子受到的傷害越深，劣變?cè)娇靃12]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，老化處理2 d時(shí)，種子在較高溫度和濕度條件下被激活，因此發(fā)芽率較高。隨著老化處理時(shí)間延長，種子內(nèi)含物發(fā)生變化，有毒有害物質(zhì)積累增加，影響了種子活力，降低了發(fā)芽率。這一點(diǎn)與前人的研究結(jié)論相符。但是，關(guān)于種子內(nèi)含物及生理生化指標(biāo)的變化與種子發(fā)芽率之間的關(guān)系，本試驗(yàn)并沒有得到可供參考的結(jié)論，還需要繼續(xù)深入研究。

總之，通過本試驗(yàn)得出結(jié)論，不同品種、不同處理的棉花種子抗老化能力有較明顯的差別，因此在加工貯藏過程中應(yīng)該區(qū)別對(duì)待。另一方面，老化處理2 d的種子發(fā)芽率提高，證明適當(dāng)?shù)母邷馗邼裉幚碛欣诜N子的激活和萌發(fā)。

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