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(內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，　內(nèi)蒙古 包頭 014010)

活性氧(Reactive oxygen species，ROS) 是植物有氧代謝過程中的副產(chǎn)物，包括超氧陰離子 (O2-)、羥自由基 (·OH)、單線態(tài)氧和過氧化氫 (H2O2) 等[1]。正常情況下，植物體內(nèi)活性氧的含量呈現(xiàn)動態(tài)平衡狀態(tài)，不會對植物產(chǎn)生傷害。當(dāng)病原菌、昆蟲侵染植物時，會打破活性氧在植物體內(nèi)的動態(tài)平衡，產(chǎn)生大量的活性氧，形成氧化逆境[2]?；钚匝醯拇罅糠e累會引發(fā)或加劇細(xì)胞膜的膜脂過氧化和膜脂作用，造成膜系統(tǒng)的損傷，并能引起細(xì)胞大分子的氧化損傷，從而對植物造成傷害[3]。

然而，在植物抵御病蟲害侵染過程中，活性氧的作用是雙方面的，有益或有害取決于它在植物體內(nèi)的濃度[4]。低濃度的活性氧既可作為毒性分子殺死病原，又可以作為信號分子誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)，通過引起細(xì)胞木質(zhì)化、胼胝體合成等加固細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，阻礙病原的繼續(xù)入侵[5]。高濃度的活性氧則會給植物體帶來極大的危害。當(dāng)ROS水平超出防御機(jī)制所及范圍，細(xì)胞就處于氧化脅迫狀態(tài)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、核酸損傷和酶失活，并能激活程序性細(xì)胞死亡[6]。

為了消除或降低這種危害，植物體內(nèi)存在著抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，通過降低植物逆境狀態(tài)下的活性氧水平，以減少逆境對植物產(chǎn)生的危害[7]。因此，活性氧的積累與及時清除對植物抗病蟲害性能的提高具有同等重要的意義。過氧化氫(H2O2)作為活性氧家族中的一員，在植物抵御病蟲害侵染過程中扮演著重要角色[8]。本研究利用高粱蚜抗性品種HN 16 (包含RMES1基因[9]) 和感蚜突變體作為研究材料，通過熒光定量PCR的方法，對蚜蟲取食過程中活性氧途徑關(guān)鍵基因——抗壞血酸過氧化物酶基因(Sb 002 G 431100)的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以探明活性氧途徑相關(guān)基因在高粱抗蚜反應(yīng)中可能發(fā)揮的作用。

1　材料和方法

1.1　材　料

本研究以高粱抗蚜品種HN 16和感蚜突變體作為研究材料。高粱蚜由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供，并接種到感蚜品種BTx 623上進(jìn)行蚜蟲的繁殖培養(yǎng)。

RNA 提取試劑TransZol Up和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自transgen公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；DNaseⅠ和SYBR?PremixExTaqTM均購自Takara公司。

1.2　方　法

1.2.1材料處理

在花盆中種植2種高粱材料，待植株長至2葉1心期進(jìn)行接蚜處理。平均每株苗接蚜20只，選取接蚜0，24，48，72 h和96 h的葉片進(jìn)行基因表達(dá)量分析。所有實(shí)驗(yàn)均在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為：16 h光照，8 h黑暗，溫度28～30 ℃，相對濕度60%。

1.2.2總RNA提取

總RNA 的提取使用TransZol Up試劑。為避免來自基因組DNA的污染，所有的 RNA樣品在提取時都要進(jìn)行DNaseⅠ消化。具體操作如下：取高粱葉片100 mg，放在預(yù)冷的研缽中，液氮研磨，迅速轉(zhuǎn)入無RNase 的2.0 mL 離心管，立即加入1 mL TransZol Up提取緩沖液，冰浴5 min；加入200μL氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫放置3 min；4 ℃ 10 000 r/min離心15 min后，取上清到新的離心管；每使用1 mL TransZol Up加入500μL異丙醇，顛倒混勻，室溫孵育10 min；4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，在管側(cè)和管底形成沉淀；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫將沉淀晾干；加入50～100μL RNase-Free水溶解。檢測RNA的質(zhì)量和濃度，在-70 ℃保存樣品。

1.2.3引物設(shè)計與合成

從高粱基因組數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載抗壞血酸過氧化物酶基因(Sb 002 G 431100)的基因組序列和CDS序列，設(shè)計兩對跨內(nèi)含子引物，即引物1(1 F:5′-CTCAGGCAGGTTTTCTCCACA-3′，1 R:5′-GCAAAGAAAGCGTCCTCATCC-3′)和引物2(2 F:5′-GCCTCATCGCTGAGAAGAACT-3′和2 R:5′-GCATAGGATAGGATGGGGAACT-3′)。內(nèi)參基因引物[10]為(actin F:5′-ACATTGCCCTGGACTACGAC-3′和actin R:5′-AATGAAGGATGGCTGGAAGA-3′)。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA的合成。10μL反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為Total RNA 5μL；Anchored Oligo(dT)primer (0.5μg/μL)1μL；2×TS Reaction Mix 10μL；TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1μL；Gdna Remover 1μL；RNase-free Water 2μL。將RNA模板，引物與RNase-free Water混勻，65 ℃孵育5 min后，冰浴2 min，然后加入其他反應(yīng)組分，42 ℃孵育反轉(zhuǎn)錄30 min；85 ℃加熱5s失活TransScriptRT/RI與gDNA Remover。反轉(zhuǎn)錄獲得的CDNA分裝20μL小管，每個樣品分裝5份，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PCR反應(yīng)

以DNA和反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用引物1和引物2進(jìn)行PCR程序擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，10 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖檢測。

1.2.6實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)

采用Takara公司的SYBR?PremixExTaqTM進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測反應(yīng)液中SYBR Green I 的熒光強(qiáng)度，達(dá)到監(jiān)控PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。在Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。按說明書合成20μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；58 ℃，34 s，進(jìn)行40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s進(jìn)行溶解曲線分析。

2　結(jié)　果

2.1　RNA質(zhì)量檢驗(yàn)

由圖1可以看出，所提取RNA的28 S、18 S和5 S條帶清晰，且條帶間沒有拖尾現(xiàn)象，說明RNA質(zhì)量良好，且沒有降解。

RNA的質(zhì)量檢測

2.2　反轉(zhuǎn)錄cDNA的質(zhì)量檢測

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，取HN 16的基因組DNA作為對照，利用內(nèi)參基因actin進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增條帶單一，亮度適中，說明反轉(zhuǎn)錄cDNA的質(zhì)量較好(圖2)。

注：M為marker，1為DNA對照，2～6 為HN 0～96 h的cDNA，7～11為Mutant 0～96 h的cDNA。圖2　反轉(zhuǎn)錄cDNA的質(zhì)量檢測

2.3　特異引物的篩選

利用高粱cDNA和DNA作為模板，對抗壞血酸過氧化物酶基因(Sb 002 G 431100) 的2對跨內(nèi)含子引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，2對引物都具有清晰的擴(kuò)增條帶(圖3)，均可用于下一步的熒光定量PCR檢測，最終選擇引物1進(jìn)行該基因的表達(dá)量分析。

圖3　引物的篩選

2.4　抗壞血酸過氧化物酶基因(Sb 002 G 431100) 的表達(dá)模式分析

利用熒光定量PCR的方法，對蚜蟲取食過程中抗壞血酸過氧化物酶基因 (Sb 002 G 431100) 的表達(dá)量進(jìn)行分析，無論是HN 16還是突變體中，該基因的表達(dá)模式均呈現(xiàn)先上升后降低的變化規(guī)律。在蚜蟲取食的最初24 h，該基因在HN 16和感蚜突變體間沒有明顯差異，但當(dāng)蚜蟲取食48 h后，HN 16中的表達(dá)量顯著高于突變體，蚜蟲取食72 h后突變體中的表達(dá)量顯著下降，但在HN 16中則始終維持在相對穩(wěn)定的水平，說明該基因在RMES1介導(dǎo)的抗蟲反應(yīng)中發(fā)揮著積極作用。

圖4　抗壞血酸過氧化物酶基因 (Sb 002 G 4311001)的表達(dá)模式分析

3　討　論

活性氧(ROS) 對病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，能使植株產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)[11]，關(guān)于ROS在抗病中的研究已有諸多報道[12]，然而，對 ROS 在植物抗蟲中所起作用的研究，目前尚不多見。已有研究表明，活性氧在水稻抗亞洲稻癭蚊(Orseoliaoryzae)[13]和灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)[14]，以及小麥抗黑森癭蚊(Mayetioladestructor)[15]中起著重要作用。

本研究選取高粱抗蚜品種HN 16 (包含RMES1基因) 和感蚜突變體(RMES1突變) 作為研究材料，對蚜蟲取食過程中活性氧途徑關(guān)鍵基因——抗壞血酸過氧化物酶基因 (Sb 002 G 431100) 的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)在2種材料中均呈現(xiàn)先上升后降低的規(guī)律。在蚜蟲未侵染及侵染程度較低時 (0～24 h)，該基因在2種材料間的表達(dá)量沒有明顯差異，但當(dāng)蚜蟲取食較為嚴(yán)重時 (48 h后)，HN 16中的表達(dá)量顯著高于突變體，特別是蚜蟲取食72 h后，突變體中的表達(dá)量顯著下降，但在HN 16中則始終維持在相對穩(wěn)定的水平，說明該基因在RMES1介導(dǎo)的抗蟲反應(yīng)中發(fā)揮著積極作用。為了準(zhǔn)確全面探明活性氧在高粱抗蚜反應(yīng)中的作用機(jī)制，下一步還需對活性氧途徑中的多個關(guān)鍵基因及抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)研究。

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