陳濤?張善磊?趙凌?張亞?wèn)|?朱鎮(zhèn)?趙慶勇?周麗慧?姚姝?趙春芳梁文化?王才林,*

?

ALS抑制劑類除草劑抗性水稻功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證

陳濤1, 2張善磊1趙凌1張亞?wèn)|1朱鎮(zhèn)1趙慶勇1周麗慧1姚姝1趙春芳1梁文化1王才林1,*

(1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國(guó)家水稻改良中心 南京分中心，南京 210014；2揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；)

【目的】培育具有乙酰乳酸合酶(ALS)抑制劑類除草劑抗性的品種是防治水稻直播田雜草危害最經(jīng)濟(jì)、有效的途徑之一，而利用分子標(biāo)記輔助選擇有助于提高其品種選擇效率?！痉椒ā吭诿鞔_除草劑抗性突變體黃華占M-1基因編碼區(qū)堿基差異的基礎(chǔ)上，利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)技術(shù)，設(shè)計(jì)引物對(duì)不同品種(品系)和淮稻5號(hào)/黃華占M-1的F2群體進(jìn)行基因型檢測(cè)，并結(jié)合除草劑的田間試驗(yàn)對(duì)標(biāo)記的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】基因編碼區(qū)序列比對(duì)分析表明，盡管秈、粳稻之間具有多處差異堿基，但只有第1642和1643堿基TG到AT的變異能導(dǎo)致位于高度保守域的第548位編碼氨基酸由色氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?，進(jìn)而使水稻產(chǎn)生對(duì)ALS抑制劑類除草劑的抗性。依據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶型，可以準(zhǔn)確區(qū)分出3種不同的基因型，其基因型與苗期除草劑抗性的表型完全一致?！窘Y(jié)論】利用Tetra-primer ARMS-PCR技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兩個(gè)連續(xù)變異堿基位點(diǎn)基因型的快速檢測(cè)，從而加快ALS抑制劑類除草劑抗性水稻品種的選育進(jìn)程。

乙酰乳酸合酶基因；除草劑抗性；堿基突變；四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR

直播稻作為水稻輕簡(jiǎn)栽培的一種重要方式，由于省工節(jié)本效果明顯，深受廣大農(nóng)戶的歡迎，種植面積迅速擴(kuò)大。近年來(lái)，隨著機(jī)插秧技術(shù)的快速推廣以及嚴(yán)控直播稻盲目發(fā)展措施的落實(shí)，其迅猛增長(zhǎng)的趨勢(shì)有所緩和，但仍是水稻種植的重要方式。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年全國(guó)有超過(guò)30%的水稻種植面積采用直播技術(shù)[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，田間雜草危害一直是困擾直播稻生產(chǎn)的技術(shù)難題，盡管除草劑能有效防治草害發(fā)生，但施用不當(dāng)常常會(huì)對(duì)水稻造成不同程度的藥害。因此，培育具有除草劑抗性的水稻品種是防治直播田雜草危害最經(jīng)濟(jì)、有效的途徑。

近年來(lái)，各種以乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase, ALS)為靶標(biāo)的除草劑，如咪唑啉酮類(Imidazolinones, IMs)、磺酸脲類(Sulfonylureas, SUs)、三唑并嘧啶類(Triazolopyrimidines, TPs)、嘧啶硫代苯甲酸酯類(pyrimidinyhhiobenzoate, PTBs)、磺酰胺羰基三唑啉酮類(sulfonylamino carbonyl triazolinone, SCTs)除草劑等，由于除草譜廣、低毒高效、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于防除各種作物種植田的雜草[2]。該類除草劑的作用機(jī)理主要是通過(guò)與植物體內(nèi)的乙酰乳酸合酶形成復(fù)合物阻斷底物進(jìn)入酶活性位點(diǎn)通路，抑制ALS活性，使支鏈氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸的合成受阻，導(dǎo)致植物死亡?？剐詸C(jī)制研究表明，植物基因保守區(qū)發(fā)生錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象發(fā)生變化，降低對(duì)除草劑的親和力，進(jìn)而產(chǎn)生抗性[3]。

美國(guó)是最早開(kāi)展ALS抑制劑類除草劑抗性品種選育的國(guó)家。1993年路易斯安那州立大學(xué)農(nóng)業(yè)中心利用甲磺酸乙酯(Ethyl Methanesulfonate, EMS)誘變水稻品種AS3510，M2代噴灑咪唑乙煙酸，篩選出具有咪唑啉酮類除草劑抗性的突變系93AS3510，并進(jìn)一步與品種Cocodrie和MayBelle雜交，選育出抗性品種CL121與CL141，并于2002年首次在美國(guó)進(jìn)行商業(yè)化種植[4]。為進(jìn)一步提高品種的豐產(chǎn)性，該中心利用相同的方法對(duì)美國(guó)優(yōu)質(zhì)秈稻品種Cypress進(jìn)行誘變，篩選出抗性品系PWC16，系統(tǒng)選育出品種CL161，并逐步取代CL121和CL141[5]。此后，阿根廷學(xué)者也從當(dāng)?shù)仄贩NIRGA 417的EMS誘變后代中篩選出抗性材料并育成品種Puita’ Intacl[6]。分子生物學(xué)研究表明，雖然AS3510、PWC16和Puita’ Intacl等材料都具有相似的除草劑抗性，但基因的變異位點(diǎn)則完全不同。AS3510的抗性源自基因第628位甘氨酸(Gly, G)轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?Glu, E)；PWC16的抗性是由第627位絲氨酸(Ser, S)突變?yōu)樘於彼?Asp, D)造成的；而Puita’ Intacl出現(xiàn)抗性則是由第96位纈氨酸(Val, V)到蘇氨酸(Thr, T)的變異所致[6]。目前，由于上述位點(diǎn)均已申請(qǐng)相關(guān)專利，而我國(guó)想在此基礎(chǔ)上開(kāi)展商業(yè)化育種，不僅會(huì)受到國(guó)外研究機(jī)構(gòu)的諸多限制，而且還必須承擔(dān)昂貴的專利使用費(fèi)。深圳興旺生物種業(yè)有限公司利用化學(xué)誘變的方法處理廣東優(yōu)質(zhì)常規(guī)秈稻品種黃華占，通過(guò)苗期大規(guī)模咪唑啉酮類除草劑的篩選，獲得了一批抗性突變植株。其中一個(gè)突變體的基因在編碼區(qū)第1642和1643堿基發(fā)生TG到AT的突變，導(dǎo)致第548位編碼氨基酸由色氨酸(Trp, W)突變?yōu)榧琢虬彼?Met, M)，進(jìn)而產(chǎn)生抗性。這是我國(guó)首次在水稻中發(fā)現(xiàn)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗ALS抑制劑類除草劑新位點(diǎn)和新材料[7]。

利用目標(biāo)基因存在的堿基差異，開(kāi)發(fā)共顯性的功能標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇可以提高ALS抑制劑類除草劑抗性品種選育的效率。四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)(Tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, Tetra-primer ARMS-PCR)是近年來(lái)在等位基因特異擴(kuò)增PCR基礎(chǔ)之上發(fā)展起來(lái)的，專門針對(duì)單核苷酸突變的一種新的檢測(cè)方法。通過(guò)四條引物的一次PCR擴(kuò)增、電泳即可達(dá)到區(qū)分不同基因型的目的，具有快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低等特點(diǎn)，并在水稻分子育種中得到廣泛應(yīng)用[8-9]。其技術(shù)原理是依據(jù)DNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，對(duì)于3′末端錯(cuò)配的引物，以低于正常末端配對(duì)引物的速度延伸，當(dāng)錯(cuò)配堿基的數(shù)目達(dá)到一定程度或者條件達(dá)到一定的嚴(yán)謹(jǐn)程度時(shí)，3′末端堿基則因磷酸二酯鍵的形成困難而不能繼續(xù)延伸，反應(yīng)終止，不能得到特異長(zhǎng)度的擴(kuò)增條帶[10]。因此，從理論上講，該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)兩個(gè)連續(xù)單核苷酸變異的檢測(cè)。

為提高ALS抑制劑類除草劑抗性品種的選育效率，有效解決水稻直播田的雜草危害，本研究在分析Tetra-primer ARMS-PCR原理的基礎(chǔ)上，根據(jù)突變位點(diǎn)的堿基差異，設(shè)計(jì)相關(guān)引物對(duì)基因的變異進(jìn)行快速檢測(cè)，并結(jié)合除草劑的田間試驗(yàn)對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，以期為ALS抑制劑類除草劑抗性品種的高效選育提供技術(shù)手段。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試水稻材料包括廣東常規(guī)秈稻品種黃華占及其ALS抑制劑類除草劑抗性突變材料(簡(jiǎn)稱黃華占M-1)，江蘇常規(guī)粳稻新品種(品系)南粳2728、淮稻5號(hào)、鎮(zhèn)稻99，分離群體是以淮稻5號(hào)為母本，黃華占M-1為父本進(jìn)行雜交、自交獲得的280個(gè)F2單株。2016年5月將上述材料浸種催芽后，將親本和F2群體分別均勻點(diǎn)播在長(zhǎng)、寬、高規(guī)格分別為60 cm×30 cm×15 cm的塑料周轉(zhuǎn)箱中，并放置在露天網(wǎng)室。當(dāng)葉齡為1葉心和3葉1心期時(shí)，按10 g/m2施用尿素，同時(shí)，為直觀反映F2群體基因型與其除草劑抗性表型是否一致性，在4葉1心期時(shí)將F2群體單株按基因的3種基因型分類移栽在同一周轉(zhuǎn)箱中。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?除草劑抗性鑒定

當(dāng)水稻在塑料周轉(zhuǎn)箱中生長(zhǎng)到5葉1心期，將5%咪唑乙煙酸水劑(山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司)稀釋1000倍，使用小型噴霧瓶按300 L/hm2的用量進(jìn)行噴霧處理，10 d后調(diào)查除草劑抗性，無(wú)明顯癥狀的記為抗，葉片全部黃化枯死的記為感。

1.2.2?序列對(duì)比和引物合成

從水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://rice. plantbiology.msu.edu/)下載粳稻品種日本晴位于第4染色體基因的編碼區(qū)序列(Coding Sequence, CDS)，與深圳興旺生物種業(yè)有限公司提供的抗ALS抑制劑類除草劑秈稻突變體黃華占M-1及其野生型的CDS序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)編碼區(qū)第1642和1643位點(diǎn)發(fā)生的突變，采用Tetra-primer ARMS-PCR技術(shù)并結(jié)合Primer Premier 5.0軟件(http://www.premierbiosoft.com/)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(表1)[11]。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3?DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

水稻3葉1心期F2群體分類移栽前，收集水稻品種(品系)、F1雜種、F2群體的微量新鮮葉片，按CTAB法提取基因組DNA[12]。PCR根據(jù)Chen等[13]的報(bào)道進(jìn)行，略作修改。20 μL PCR體系包括DNA (10 ng/μL) 2.0 μL，四條引物(4 pmol/μL)各0.5 μL，10×緩沖液(含MgCl2) 2.0 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 0.4 μL，(5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 13.1 μL。反應(yīng)程序如下：95℃下預(yù)變性5min；95℃下變性30 s，59℃下復(fù)性30 s，72℃下延伸1 min，循環(huán)35次；72℃下延伸7 min，10℃冷卻10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物加溴酚藍(lán)指示劑后備用。反應(yīng)產(chǎn)物用加入DuRed核酸染料3%的瓊脂糖凝膠130V電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記載。

2?結(jié)果與分析

2.1?ALS基因序列分析和引物設(shè)計(jì)

水稻基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為1935 bp，僅有一個(gè)外顯子，編碼644個(gè)氨基酸[14]。通過(guò)比較粳稻品種日本晴和秈稻品種黃華占的相關(guān)序列，發(fā)現(xiàn)上述秈、粳稻編碼區(qū)序列存在29處核苷酸變異，其中絕大多數(shù)點(diǎn)突變?yōu)橥x突變，并不影響其編碼的氨基酸序列，僅有4處能導(dǎo)致氨基酸序列變異的錯(cuò)義突變，分別在第11、273、548和604位氨基酸位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)擬南芥、玉米、油菜、大豆編碼ALS蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)除第548位氨基酸位點(diǎn)比較保守外，其他3處位點(diǎn)都存在序列變化(數(shù)據(jù)未列出)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較黃華占野生型與黃華占M-1的相關(guān)序列，發(fā)現(xiàn)它們僅在編碼區(qū)第1642和1643位點(diǎn)存在TG到AT的變異，并導(dǎo)致第548位氨基酸由色氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?圖1)。該位點(diǎn)正好處于植物基因5個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域B(QWED)中，是目前已報(bào)道的能導(dǎo)致植物對(duì)ALS抑制劑除草劑產(chǎn)生抗性的20個(gè)重要氨基酸位點(diǎn)之一[15-19]。下載日本晴基因的全長(zhǎng)序列，根據(jù)Tetra-primer ARMS-PCR技術(shù)原理，先確定正向(-I-F)和反向內(nèi)引物(-I-R)，其中正向內(nèi)引物的3′末端與黃華占突變體M-1 1642位堿基相同，反向內(nèi)引物與黃華占野生型1643位堿基互補(bǔ)，同時(shí)為增強(qiáng)內(nèi)引物的特異性，在3′端第3位各引入一個(gè)人工錯(cuò)配堿基，即-I-F由A變?yōu)門，而反向內(nèi)引物則由C變?yōu)門。同時(shí)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)出多對(duì)正向和反向外引物，綜合考慮四條引物的m(Melting Temperature)值、引物之間的互補(bǔ)情況以及差異片段是否能在瓊脂糖凝膠電泳中得到有效區(qū)分等多種因素，選擇出最合適的外引物對(duì)進(jìn)行搭配(圖1、表1)。根據(jù)各引物在基因序列中的位置，從理論上講無(wú)論是否具有目標(biāo)位點(diǎn)的堿基變異都能被正反向外引物擴(kuò)增出具有陽(yáng)性對(duì)照作用的646 bp條帶。除此之外，含基因突變純合基因型的水稻還能擴(kuò)增出381 bp的特征條帶，不含基因突變純合基因型水稻則能擴(kuò)增出321 bp的特征條帶，而雜合材料能同時(shí)擴(kuò)增646 bp、381 bp以及321 bp三條特征條帶。

表1?四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)檢測(cè)水稻ALS基因堿基變異的引物序列

序列中黑色堿基表示外顯子, 藍(lán)色堿基表示基因的非編碼區(qū)序列, 紅色堿基表示引物序列, 陰影表示差異堿基, 陰影斜體表示產(chǎn)生ALS抑制劑類除草劑抗性的關(guān)鍵堿基。

Fig. 1. Strategy for Tetra-primer ARMS-PCR system to detect the two continuous base mutations forgene in rice.

2.2?不同品系A(chǔ)LS基因型檢測(cè)和除草劑抗性鑒定

在除草劑處理前3 d，提取黃華占、黃華占M-1、南粳2728、淮稻5號(hào)和鎮(zhèn)稻99等5個(gè)秈、粳稻品種(品系)的DNA進(jìn)行Tetra-primer ARMS-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳可顯示兩種類型的條帶(圖2)，被正向外引物-O-F和反向外引物-O-R擴(kuò)增起陽(yáng)性對(duì)照作用的646 bp的條帶在每個(gè)檢測(cè)材料中均出現(xiàn)，這表明所有樣本的DNA都得到了有效擴(kuò)增。除646 bp的條帶外，南粳2728、淮稻5號(hào)、鎮(zhèn)稻99和黃華占中還能檢測(cè)出一條約為321 bp的條帶，它是由正向外引物-O-F和反向內(nèi)引物-I-R擴(kuò)增產(chǎn)生的，其特異擴(kuò)增基因編碼區(qū)序列中第1643位核苷酸為G的等位位點(diǎn)。而突變體黃華占M-1雖不能擴(kuò)增出321 bp的條帶，卻能擴(kuò)增出一條381 bp的條帶，該條帶是由正向內(nèi)引物-I-F和反向外引物-O-R擴(kuò)增產(chǎn)生的，其特異擴(kuò)增基因編碼區(qū)第1642位核苷酸為A的等位變異位點(diǎn)。為驗(yàn)證基因型和表型是否具有一致性，當(dāng)上述品種(品系)生長(zhǎng)到5葉1心期時(shí)進(jìn)行除草劑噴霧處理。除黃華占M-1沒(méi)有表現(xiàn)出明顯癥狀外，其他材料葉片全部黃化枯死(圖3)。這說(shuō)明利用該方法可以對(duì)基因編碼區(qū)第1642和1643位點(diǎn)發(fā)生TG到AT突變的抗除草劑水稻進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定。

M－DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1－黃華占M-1；2－黃華占；3－南粳2728；4－淮稻5號(hào)；5－鎮(zhèn)稻99。

Fig. 2. Electrophoresis detection ofgenotypes by Tetra-primer ARMS-PCR in different rice varieties or lines.

A―黃華占M-1；B―南粳2728。

Fig. 3. Resistance test of different varieties or lines to ALS inhibitor herbicide imazethapyr.

2.3?F2分離群體ALS基因型檢測(cè)和除草劑抗性鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證Tetra-primer ARMS-PCR引物對(duì)雜合基因型的檢測(cè)效果，在4葉1心期時(shí)，提取淮稻5號(hào)/黃華占M-1 F2群體280個(gè)單株的DNA并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，所有F2單株的電泳產(chǎn)物只出現(xiàn)三種類型的條帶，其中67株能擴(kuò)增出646 bp和381 bp的條帶，60株能擴(kuò)增出646 bp和321 bp的條帶，其余153株則能擴(kuò)增出646 bp、381 bp和321 bp的條帶(圖4)。三種帶型對(duì)應(yīng)的基因型比例為1∶2∶1，符合1對(duì)基因的分離規(guī)律(χ2=2.764<χ20.05,2，0.25<<0.50)。為直觀反映基因型和表型是否一致，將群體單株按不同基因型進(jìn)行移栽，待苗恢復(fù)正常后進(jìn)行除草劑噴霧處理。除不含基因突變純合基因型水稻全部黃化枯死外，其他兩種基因型的單株都不出現(xiàn)除草劑危害的癥狀(圖5)。這不僅說(shuō)明該引物可以有效對(duì)雜合基因型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，同時(shí)也說(shuō)明突變所產(chǎn)生的除草劑抗性由一對(duì)顯性基因所控制。

M－DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1―黃華占M-1；2―淮稻5號(hào)；3―淮稻5號(hào)/黃華占M-1 F1；4~17―部分F2分離單株。

Fig. 4. Electrophoresis detection ofgenotype by Tetra-primer ARMS-PCR in F2population derived from Huaidao 5/Huanghuazhan M-1.

A－不含ALS基因突變純合基因型單株；B－含ALS基因突變純合基因型植株；C－含ALS基因突變雜合基因型單株。

Fig. 5. Resistance test of F2population derived from Huaidao 5/Huanghuazhan M-1 to ALS inhibitor herbicide imazethapyr.

3?討論

3.1?植物對(duì)ALS抑制劑類除草劑的抗藥性機(jī)理

自1990年Mallory-Smith首次報(bào)道毒萵苣對(duì)磺酰脲類除草劑出現(xiàn)抗藥性以來(lái)，國(guó)際上發(fā)表了大量關(guān)于植物對(duì)ALS抑制劑除草劑產(chǎn)生抗性的研究報(bào)道[20-21]。研究表明，植物在ALS抑制劑除草劑的選擇壓下，能進(jìn)化出不同機(jī)制的抗性。根據(jù)作用方式的不同，目前主要分為非靶標(biāo)抗性和靶標(biāo)抗性。非靶標(biāo)抗性機(jī)制是指植物通過(guò)降低ALS抑制劑除草劑的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，限制其到達(dá)作用部位以及提高與除草劑代謝相關(guān)酶類如谷胱甘肽還原酶、過(guò)氧化物歧化酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶等含量和活性，使除草劑代謝為無(wú)毒化合物的能力增強(qiáng)。此類抗性的產(chǎn)生一般是多基因共同作用的結(jié)果，其分子機(jī)制尚不明確；靶標(biāo)抗性則主要是通過(guò)基因作用位點(diǎn)突變、過(guò)量表達(dá)以及拷貝數(shù)增加導(dǎo)致靶標(biāo)蛋白有所修飾進(jìn)而產(chǎn)生抗性[22-24]。因此，靶標(biāo)抗性存在抗譜相對(duì)狹窄、抗藥性易于喪失等缺陷，但由于涉及基因單一、遺傳方式簡(jiǎn)單、抗性程度高等特點(diǎn)，便于除草劑開(kāi)發(fā)和抗性育種利用。

基因堿基突變?cè)斐砂被釟埢稽c(diǎn)變化，導(dǎo)致靶標(biāo)蛋白發(fā)生修飾，進(jìn)而引起除草劑與ALS 酶結(jié)合方式的變化是水稻產(chǎn)生靶標(biāo)抗性的重要方式之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，ALS蛋白中至少存在著20個(gè)能導(dǎo)致植物對(duì)ALS抑制劑除草劑產(chǎn)生抗性的氨基酸位點(diǎn)，以模式植物擬南芥基因氨基酸序列為標(biāo)準(zhǔn)分別為Gly 121、Ala 122、Met 124、Gly162、Val 196、Pro 197、Arg 199、Ala 205、Phe 206、Lys 256、Met 351、His 352、Asp 376、Arg 377、Met 570、Leu 571、Trp 574、Phe 578、Ser 653、Gly654[15-19]。目前，水稻中已報(bào)道的抗ALS抑制劑除草劑突變位點(diǎn)主要包括Gly 95、Ala 96、Pro 171、Trp 548、Ser 627、Gly 628，分別對(duì)應(yīng)擬南芥的Gly121、Ala 122、Pro 197、Trp 574、Ser 653和Gly 654[6,19,25]。這些位點(diǎn)大多分布在ALS蛋白5個(gè)不連續(xù)的高度保守區(qū)，結(jié)構(gòu)域A (AITGQVPRRMIGT)、結(jié)構(gòu)域B (QWED)、結(jié)構(gòu)域C (VFAYPGGASMEIHQALTRS)、結(jié)構(gòu)域D (AFQETP)和結(jié)構(gòu)域E (IPSGG)中。

由于不同ALS抑制劑除草劑在化學(xué)結(jié)構(gòu)上存在差異，不同取代位點(diǎn)、替換氨基酸類型以及物種間的差異均會(huì)導(dǎo)致其抗藥性范圍和強(qiáng)弱的變化。Ala 122的突變一般只產(chǎn)生對(duì)咪唑啉酮類的抗性，對(duì)磺酸脲類、三唑并嘧啶類、嘧啶羧酸類除草劑則不太敏感，當(dāng)其突變?yōu)門yr時(shí)則對(duì)三唑并嘧啶類、磺酸脲類和咪唑啉酮類都產(chǎn)生不同程度的抗性；Pro 197位點(diǎn)的突變類型較多，可突變成His、Arg、Leu、Gln、Ser、Ala、Ile、Thr、Asn等，主要產(chǎn)生對(duì)磺酸脲類的抗性，而突變成Glu后則會(huì)產(chǎn)生對(duì)4種除草劑的廣譜抗性[26]。在不同物種中同一位點(diǎn)同一氨基酸突變也會(huì)產(chǎn)生不同效果，如地膚中Pro197位點(diǎn)突變成Leu，僅產(chǎn)生磺酸脲類的抗性，而同樣突變?cè)诜粗η{中則可產(chǎn)生對(duì)磺酸脲類、咪唑啉酮類等多種除草劑的抗性[27-28]。本研究中所述Trp 548位點(diǎn)位于基因高度保守結(jié)構(gòu)域B中，主要產(chǎn)生Leu和Gly兩種突變類型，與上述4種類別的除草劑的抗性都密切相關(guān)[29]。綜上所述，基因與除草劑之間的作用方式和機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，一些新的抗除草劑位點(diǎn)、氨基酸替換類型以及與除草劑的抗性關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

3.2?Tetra-primer ARMS-PCR檢測(cè)堿基變異的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

利用分子標(biāo)記輔助選擇是提高ALS抑制劑類除草劑抗性水稻品種育種效率的重要手段?；虍a(chǎn)生抗性大多是其保守區(qū)域上發(fā)生單核苷酸突變導(dǎo)致氨基酸序列變化產(chǎn)生的。針對(duì)這些變異，Kadaru等、Roso等和Rosas等分別利用等位基因特異PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)和競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR的方法(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)，對(duì)造成G654E、S653D、A122T氨基酸變異的堿基位點(diǎn)開(kāi)發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了對(duì)上述差異位點(diǎn)準(zhǔn)確的鑒定[30-32]。然而，傳統(tǒng)AS-PCR雖然能夠避免CAPS(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences)標(biāo)記檢測(cè)過(guò)程中酶切等繁瑣的操作，但結(jié)果假陰性偏多，且不能對(duì)雜合基因型進(jìn)行一次性檢測(cè)；而KASP技術(shù)盡管具有高通量的特性，但對(duì)引物和檢測(cè)設(shè)備的要求較高，國(guó)內(nèi)大多數(shù)育種單位目前還難以應(yīng)用。與上述方法相比，Tetra-primer ARMS-PCR具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、易操作等特點(diǎn)，因而在實(shí)際應(yīng)用中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本研究根據(jù)ALS抑制劑類除草劑抗性水稻突變體黃華占M-1在基因編碼區(qū)存在兩個(gè)連續(xù)的變異堿基設(shè)計(jì)相應(yīng)的Tetra-primer ARMS-PCR引物，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同基因型快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于相關(guān)資源鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇育種工作。

3.3?抗ALS抑制劑類除草劑水稻存在的問(wèn)題和解決途徑

抗除草劑特性是水稻適合直播的一種重要性狀，對(duì)其進(jìn)行利用能有效解決直播田的草害問(wèn)題。由于種植水稻ALS抑制劑類除草劑抗性品種不僅具有省本節(jié)力的優(yōu)勢(shì)，而且其本身不屬于轉(zhuǎn)基因作物，其產(chǎn)品貿(mào)易和食品安全不受限制，因此具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。據(jù)統(tǒng)計(jì)，該類水稻在世界許多水稻生產(chǎn)國(guó)如美國(guó)、巴西、烏拉圭、阿根廷、意大利、馬來(lái)西亞等都有廣泛種植，其中美國(guó)超過(guò)76%的雜交水稻組合都具有ALS抑制劑類除草劑抗性[4]。然而，此類除草劑抗性水稻在生態(tài)、環(huán)境安全方面也存在一些問(wèn)題。首先，通過(guò)異花授粉產(chǎn)生的基因飄移和除草劑選擇壓的作用下，雜草稻也會(huì)產(chǎn)生抗性。自ALS抑制劑類除草劑水稻推廣以來(lái)，各種植國(guó)都有抗性雜草稻發(fā)生的報(bào)道。抗性雜草稻噴施除草劑不死亡，不僅能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)使水稻產(chǎn)量下降，而且嚴(yán)重影響稻米品質(zhì)，降低其商品性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2008年，美國(guó)水稻主產(chǎn)區(qū)阿肯色州62%的水稻田塊都出現(xiàn)抗性雜草稻，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失平均達(dá)300美元/hm2。而在意大利，在隨機(jī)抽查的種植過(guò)抗ALS類除草劑的9塊水稻田中，其中8塊也發(fā)現(xiàn)了抗性雜草稻[33-34]；其次，長(zhǎng)期單一施用同類型的除草劑產(chǎn)生的強(qiáng)選擇壓會(huì)導(dǎo)致雜草出現(xiàn)基因變異，產(chǎn)生抗藥性，降低除草效果。迄今，在159種雜草中都出現(xiàn)過(guò)ALS類除草劑抗性，包括97種雙子葉雜草和62種單子葉雜草，如常見(jiàn)的稗草、鴨舌草、千金子等[35]。此外，ALS抑制劑類除草劑在土壤中的降解期較長(zhǎng)，過(guò)量施用而造成的農(nóng)藥殘留極易造成后茬作物受害[36]。針對(duì)這些問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也提出了許多對(duì)策，比如加強(qiáng)種子繁育和直播田管理，避免雜草稻混入或萌發(fā)；開(kāi)發(fā)新的非轉(zhuǎn)基因除草劑作物如乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase, ACCase)類抑制劑除草劑抗性和羥基苯基丙酮酸雙氧化酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD)類抑制劑除草劑抗性作物等，通過(guò)相互輪作減輕選擇強(qiáng)度，減低抗性雜草和雜草稻出現(xiàn)的幾率；選育具有ALS抑制劑類除草劑抗性的小麥、油菜、玉米等其他農(nóng)作物品種以保證正常的輪作或套作以及發(fā)現(xiàn)降解相應(yīng)除草劑的微生物菌株等[37-39]。

與國(guó)外相比，我國(guó)對(duì)此類水稻的品種研發(fā)和推廣應(yīng)用則顯得非常滯后。除缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因位點(diǎn)和相關(guān)育種材料外，最重要的因素是除草劑殘留對(duì)輪作或套作農(nóng)作物產(chǎn)生的藥害問(wèn)題，這在我國(guó)水旱輪作的單季稻地區(qū)尤其值得注意。如何在生產(chǎn)中避免這一問(wèn)題，提高安全程度，可以從兩個(gè)方面進(jìn)行考慮。一方面，必須選擇在集約化、規(guī)?；?、機(jī)械化程度高的稻區(qū)進(jìn)行示范種植，并配套高效、低殘留、易降解的除草劑產(chǎn)品進(jìn)行科學(xué)化、定量化噴施管理，并在輪作和套作時(shí)盡量種植對(duì)該類除草劑不敏感的農(nóng)作物，以免出現(xiàn)不必要的損失；另一方面，持續(xù)加大對(duì)其他ALS抑制劑類除草劑抗性農(nóng)作物的研發(fā)力度和經(jīng)費(fèi)投入，為農(nóng)作物的多樣化種植提供物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，我國(guó)在玉米、油菜、棉花、谷子等作物中已篩選或創(chuàng)制出相應(yīng)的抗性種質(zhì)資源，并開(kāi)始在育種中得以利用[40-43]。因此，隨著技術(shù)的發(fā)展和不斷完善，相信這些問(wèn)題一定會(huì)得到有效解決，我國(guó)抗ALS抑制劑類除草劑水稻研發(fā)也會(huì)迎來(lái)新的契機(jī)并在生產(chǎn)中發(fā)揮重要價(jià)值。

謝辭：感謝深圳興旺生物種業(yè)有限公司提供ALS抑制劑類除草劑抗性突變材料黃華占M-1。

[1] 中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開(kāi)發(fā)中心. 我國(guó)水稻機(jī)械化直播技術(shù)體系日臻完善. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2017, 19(2): 139.

China Rural Technology Development Center. More and more perfect technology system of mechanized direct-sowing rice in China., 2017, 19(2): 139. (in Chinese)

[2] 張?jiān)圃? 盧宗志, 李洪鑫, 崔海蘭. 雜草對(duì)乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑抗藥性的研究進(jìn)展. 雜草科學(xué), 2013, 31(2): 1-5.

Zhang Y Y, Lu Z Z, Li H X, Cui H N. Research progress on weed resistance to acetolactate synthase inhibitors., 2013, 31(2): 1-5. (in Chinese with English abstract)

[3] Duggleby R G, McCourt J A, Guddat L W. Structure and mechanism of inhibition of plant acetohydroxyacid synthase., 2008, 46: 309-324.

[4] Sudianto E, Beng-Kah S, Ting-Xiang N, Saldain N E, Scott R C, Burgos N R. Clearfieldrice: Its development, success, and key challenges on a global perspective., 2013, 49: 40-51.

[5] Wenefrida I, Utomo H S, Meche M M, Nash J L. Inheritance of herbicide resistance in two germplasm lines of Clearfield?riceL.)., 2007, 87: 659-669.

[6] Goulart I C G R, Matzenbacher F O, Merotto A J R. Differential germination pattern of rice cultivars resistant to imidazolinone herbicides carrying different acetolactate synthase gene mutations., 2012, 52: 224-232.

[7] 陳竹鋒, 王承旭, 柳威, 唐曉艷, 鄧興旺. 水稻抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應(yīng)用: CN201210037789.9. 2013-04-17.

Chen Z F, Wang C X, Liu W, Tang X X, Deng X W. Rice herbicide resistant protein and application thereof in plant breeding[P]: CN201210037789.9. 2013-04-17. (in Chinese)

[8] 陳濤, 駱名瑞, 張亞?wèn)|, 朱鎮(zhèn), 趙凌, 趙慶勇, 周麗慧, 姚姝, 于新, 王才林. 利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)檢測(cè)水稻低直鏈淀粉含量基因. 中國(guó)水稻科學(xué), 2013, 27(5): 529-534.

Chen T, Luo M R, Zhang Y D, Zhu Z, Zhao Q Y, Zhou L H, Yao S, Yu X, Wang C L. Detection ofgene for low-amylose content by tetra-primer amplification refractory mutation system PCR in rice., 2013, 27(5): 529-534. (in Chinese with English abstract)

[9] 李軍, 李白, 高榮村. 利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)檢測(cè)水稻光溫敏核不育基因. 中國(guó)水稻科學(xué), 2014, 28(4): 442-446.

Li J, Li B, Gao R C. Detection of genefor photoperiod- and thermo-sensitive genic male sterility by tetra-primer amplication refractory mutation system PCR in rice., 2014, 28(4): 442-446. (in Chinese with English abstract)

[10] Ye S, DhillonS, Ke X Y, Collins A R, Day I N M. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms., 2001, 29, e88.

[11] Lalitha S. Primer Premier 5., 2000, 1(6): 270-272.

[12] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular-weight plant DNA., 1980, 8: 4321–4325.

[13] Chen X, Temnykh S, Xu Y, Cho Y G, McCouch S R. Development of a microsatellite framework map providing genome-wide coverage in rice (L.)., 1997, 95: 553-567.

[14] 宋貴生, 馮德江, 魏曉麗, 唐家斌, 朱楨. 水稻乙酰乳酸合成酶基因的克隆和功能分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2007, 9(3): 66-72.

Song G S, Feng D J, Wei X L, Tang J B, Zhu Z. Isolation and functional analysis of rice acetolactate-synthase (ALS).,2007, 9(3): 66-72. (in Chinese with English abstract)

[15] Boutsalis P, Karotam J, Powles S B. Molecular basis of resistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides inand., 1999, 55: 507-516.

[16] Tan S, Evans R, Singh B. Herbicidal inhibitors of amino acid biosynthesis and herbicide tolerant crops., 2006, 30: 195-204.

[17] Zhou Q Y, Liu W P, Zhang Y S, Liu K K. Action mechanisms of acetolactate synthase-inhibiting herbicides., 2007, 89: 89-96.

[18] Massa D, Krenz B, Gerhards R. Target-site resistance to ALS-inhibiting herbicides inpopulations is conferred by documented and previously unknown mutations., 2011, 51: 294-303.

[19] 張保龍, 王金彥, 陳天子, 凌溪鐵. 粳稻的ALS突變型基因及其蛋白和應(yīng)用: CN201710120061.5. 2017-03-02.

Zhang B L, Wang J Y, Chen T Z, Ling X T. Mutantgene and its applications and japonica[P]: CN201710120061.5. 2017-03-02. (in Chinese)

[20] Mallory-Smith C A, Thill D C , Dial M J. Identification of sulfonylurea herbicide-resistant Prickly Lettuce ()., 1990, 4: 163-168.

[21] 任洪雷. 乙酰乳酸合成酶及基因研究概述. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2016, 32(26): 37-42.

Ren H L. Acetolactate synthase andgene research., 2016, 32(26): 37-42. (in Chinese with English abstract)

[22] Délye C. Unravelling the genetic bases of non-target- site-based resistance (NTSR) to herbicides: A major challenge for weed science in the forthcoming decade., 2013, 69: 176-187.

[23] Délye C, Jasieniuk M, Le Corre V. Deciphering the evolution of herbicide resistance in weeds., 2013, 29: 649-658.

[24] Rey-Caballero J, Menéndez J, Osuna M D, Salas M, Torra J. Target-site and non-target-site resistance mechanisms to ALS inhibiting herbicides in., 2017, 138: 57-65.

[25] Okuzaki A, Shimizu T, Kaku K, Kawai K, Toriyama K. A novel mutated acetolactate synthase gene conferring specific resistance to pyrimidinyl carboxy herbicides in rice., 2007, 64: 219-224.

[26] Yu Q, Powles S B. Resistance to AHAS inhibitor herbicides: current understanding., 2014, 70: 1340-1350.

[27] Guttieri M J, Eberlein C V, Thill D C. Diverse mutations in the acetolactate synthase gene confer chlorsulfuron resistance in kochia () biotypes., 1995, 43: 175-178.

[28] Sibony M, Michel A, Haas H U, Rubin B, Hurle K. Sulfometuron-resistant: Cross- resistance and molecular basis for resistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides., 2001, 41: 509-522.

[29] Tranel P J, Wright T R. Resistance of weeds to ALS-inhibiting herbicides: What have we learned?, 2002, 50: 700-712.

[30] Kadaru S, Zhang W Q, Yadav A, Oard J H. Development and application of allele-specific PCR assays for imazethapyr resistance in rice ()., 2008, 160: 431-438.

[31] Roso A C, Merotto A Jr, Delatorrea C A, Menezesb V G. Regional scale distribution of imidazolinone herbicide- resistant alleles in red rice (L.) determined through SNP markers., 2010, 119: 175-182.

[32] Rosas J E, Bonnecarrère V, Vida F P D. One-step, codominant detection of imidazolinone resistance mutations in weedy rice (L.)., 2014, 17: 95-101.

[33] Burgos N R, Norsworthy J K, Scott R C, Smith K L. Red rice () status after 5 years of imidazolinone-resistant rice technology in Arkansas., 2008, 22: 200-208.

[34] Busconi M, Rossi D, Lorenzoni C, Baldi G, Fogher C. Spread of herbicide-resistant weedy rice (red rice,L.) after 5 years of Clearfield rice cultivation in Italy., 2012, 14: 751-759.

[35] Heap I. International survey of herbicide resistant weeds. [2017-07-01]. http://www.weedscience.org/.

[36] 黃春艷, 陳鐵保, 王宇, 孫寶宏, 楊紹義. 咪唑啉酮類除草劑對(duì)后茬作物安全性研究初報(bào). 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 3(2): 29-34.

Huang C Y, Chen T B, Wang Y, Sun B H, Yang S Y. Study on safety of imidazolinone herbicides to succeeding crops., 2001, 3(2): 29-34. (in Chinese with English abstract)

[37] Tan S, Evans R R, Dahmer M L, Singh B K, Shaner D L. Imidazolinone-tolerant crops: History, current status and future., 2005, 61: 246-257.

[38] Dauer J, Hulting A, Carlson D, Mankin L, Harden J, Mallory-Smith C. Gene flow from single and stacked herbicide-resistant rice (): Modeling occurrence of multiple herbicide-resistant weedy rice., 2017, 74(2): 348-355

[39] Green J M, Owen M D K. Herbicide-resistant crops: utilities and limitations for herbicide-resistant weed management., 2011, 59: 5819-5829.

[40] 仲義, 王云鵬, 代秀云, 劉文國(guó). 利用玉米萌動(dòng)胚獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因新材料. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 53(17):

4001-4004.

Zhong Y, Wang Y P, Dai X X, Liu W G. Generating herbicide resistant transgenic plants in maize with germinating embryo as explants., 2014, 53(17): 4001-4004. (in Chinese)

[41] 胡茂龍, 浦惠明, 龍衛(wèi)華, 高建芹, 戚存扣, 張潔夫, 陳松. 油菜乙酰乳酸合酶突變體S638N的酶學(xué)特性及其對(duì)ALS類除草劑的抗性. 作物學(xué)報(bào), 2015, 41(9): 1353-1360.

Hu M L, Pu H M, Long W H, Gao J Q, Qi C K, Zhang J F, Chen S. Enzymatic characteristics of acetolactate syn- thase mutant S638N inand its resistance to ALS inhibitor herbicides., 2015, 41(9): 1353-1360. (in Chinese with English abstract)

[42] 連麗君, 李瑩, 王娟, 郭寧, 張可煒. 轉(zhuǎn)/基因棉花生存競(jìng)爭(zhēng)力和基因漂流的調(diào)查. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版, 2009, 44(5): 20-27.

Lian L J, Li Y, Wang J, Guo N, Zhang K W. Investigations on survival competitiveness and gene flow of transgenic cotton withgene in the field.:, 2009, 44(5): 20-27. (in Chinese with English abstract)

[43] 師志剛, 夏雪巖, 劉正理, 程汝宏. 谷子抗咪唑乙煙酸新種質(zhì)的初步研究. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 14(11): 133-134, 136.

Shi Z G, Xia X Y, Liu Z L, Cheng R H. Preliminary study on new imazethapyr resistant foxtail millet germplasm., 2010, 14(11): 133-134,136. (in Chinese)

Development and Verification of a Functional Marker Associated with Resistance to ALS Inhibitor Herbicide

CHEN Tao1,2, ZHANG Shanlei1, ZHAO Ling1, ZHANG Yadong1, ZHU Zhen1, ZHAO Qingyong1, ZHOU Lihui1, YAO Shu1, ZHAO Chunfang1, LIANG Wenhua1, WANG Cailin1,*

(1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu High Quality Rice R&D Center / Nanjing Branch of China National Center for Rice Improvement, Nanjing 210014, China;2Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;)

【Objective】Breeding rice varieties with resistance to ALS-inhibiting herbicide is the most economical and effective method to prevent weeds in direct-sowing field, and molecular marker-assisted selection can improve its efficiency. 【Method】The dominant molecular marker, designed for genotypic detection in different varieties and an F2population derived from Huaidao 5/Huanghuazhan M-1(mutant with resistance to ALS-inhibiting herbicide) was developed with Tetra-primer ARMS-PCR technique, based on the clarified mutation in CDS ofgene. 【Result】 The sequence alignment analysis ofgene encoding region showed that only the mutation from T1642G1643to A1642T1643leading to the 548th amino acid substitution from tryptophan to methionine in highly conserved region was the critical factors to produce resistance to ALS-inhibiting herbicide in Huanghuazhan M-1, despite the existence of multiple base differences between differentandrice varieties. The results of PCR detection indicated that three different genotypes could be accurately distinguished by electrophoretic bands, and it was exactly consistent with the phenotype of herbicide resistance at the seedling stage. 【Conclusion】 The genotype associated with two continuous base mutations could be rapidly detected by Tetra-primer ARMS-PCR technique, and the efficiency for varieties with resistance to ALS-inhibiting herbicide could be improved in breeding process.

acetolactate synthase; herbicide resistance; base mutation; tetra-primer ARMS-PCR

Corresponding author, E-mail: clwang@jaas.ac.cn

S482.4; S511.034

A

1001-7216(2018)02-0137-09

2017-08-01；

2017-09-29。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)(2017YFD0100305)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(CARS-01-62)；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(BE2016416)；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所科研基金資助項(xiàng)目(LZS17-7)。

通訊聯(lián)系人，E-mail：clwang@jaas.ac.cn

10.16819/j.1001-7216.2018.7091