彭喜旭?白寧寧?王海華, *

?

響應(yīng)鎘脅迫的水稻W(wǎng)RKY15轉(zhuǎn)錄因子基因的分離與表達特征

彭喜旭1, 2白寧寧1王海華1, 2, *

(1湖南科技大學 生命科學學院，湖南 湘潭 411201；2重金屬污染土壤生態(tài)修復與安全利用湖南省高校重點實驗室，湖南 湘潭 411201；)

【目的】鎘(Cd)是一種對植物生長發(fā)育和人類健康均具有很強毒害效應(yīng)的重金屬元素。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在抗逆生理過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。為了研究基因在鎘脅迫響應(yīng)和抗性反應(yīng)中的作用，【方法】基于基因注釋，采用RT-PCR策略從一氧化氮(NO)處理的水稻葉片中分離完整的編碼序列，運用生物信息學軟件分析其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，采用qRT-PCR分析其基因的空間(器官)特異性及誘導表達模式；運用酵母單雜交方法檢測其轉(zhuǎn)錄激活活性。【結(jié)果】克隆了cDNA 序列，長988 bp，包含一個長825 bp的完整開放讀碼框，編碼274個氨基酸。OsWRKY15具有1個典型的WRKY保守結(jié)構(gòu)域，鋅指類型為C2HC，歸類于WRKY第3組；擁有一個核定位信號，因此推測為一種核蛋白。酵母單雜交分析表明，它具有轉(zhuǎn)錄激活活性。在根中的表達豐度最高，其次是葉和莖，在穎果、花和干種子中的表達豐度較低；受Cd、NO和脫落酸(ABA)快速且顯著誘導，且在根中被誘導的程度比葉中大，而水楊酸、茉莉酸和乙烯對其表達無明顯影響?！窘Y(jié)論】OsWRKY15是一個具有功能的核蛋白，推測其可能通過NO、ABA介導的信號途徑參與水稻對Cd脅迫的抗性反應(yīng)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子；鎘；基因分離；基因表達模式；水稻

鎘(cadmium，Cd)是植物的非必需營養(yǎng)元素，其積累能直接或間接抑制植物的光合、呼吸和蒸騰作用，引起水分、礦質(zhì)代謝異常和氧化脅迫，從而導致植株葉片失綠、卷曲壞死，根尖發(fā)黃，生長遲緩，最終死亡[1]。Cd具高遷移性，易被作物吸收，并通過食物鏈威脅人類健康[2]。金屬礦藏開采、冶金、“三廢”排放、污水灌溉、污泥與磷肥的施用是土壤Cd污染的主要來源[3]。

植物通過復雜的信號轉(zhuǎn)導途徑啟動對Cd脅迫的應(yīng)答，包括信號感知、次級信使產(chǎn)生、信號級聯(lián)放大，最終匯集于轉(zhuǎn)錄因子對一系列參與Cd吸收、轉(zhuǎn)運和解毒相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而啟動對Cd脅迫的主動抗性反應(yīng)[4]。轉(zhuǎn)錄因子在植物Cd應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導中占據(jù)重要位置。全基因組表達譜分析表明，Cd脅迫下，水稻中包括DREB、NAC、MYB、AP2/ERFBP、WRKY在內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子基因表達被早期誘導[5, 6]。在芥菜()中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因受Cd誘導；進一步的分析表明，BjCdR5參與Cd吸收以及從根至地上部的長距離轉(zhuǎn)運，在Cd抗性中發(fā)揮重要作用[7]。硫代葡萄糖苷是細胞中一種重要的硫的儲存形式，在植物逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要功能。在天藍遏藍菜中，受高Cd誘導，參與硫代葡萄糖苷合成的調(diào)節(jié)[8]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中構(gòu)成蛋白超家族[9]。它們最典型的結(jié)構(gòu)特征是含有1至2個保守的WRKY結(jié)構(gòu)域：由大約60個氨基酸組成，其N端的七肽WRKYGQK十分保守，C端為鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)的組成，可將WRKY蛋白分成3組：第1組含兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指模式為C2H2；第2和3組含1個WRKY結(jié)構(gòu)域，前者的鋅指模式為C2H2，后者則為C2HC[9]。WRKY基因在植物抗熱、冷、高鹽、干旱、滲透和營養(yǎng)饑餓等非生物逆境中具有重要的調(diào)節(jié)功能[10]。近來研究表明，WRKY基因還可參與植物對金屬或類金屬脅迫反應(yīng)及轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)。水稻在過量的Fe處理下表達上調(diào)，暗示其在植物Fe脅迫反應(yīng)中可能發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用[11]。擬南芥的表達對砷(As)十分敏感，功能獲得和功能喪失突變體的遺傳與生理分析表明，該因子通過調(diào)節(jié)As/Pi轉(zhuǎn)運體基因的表達以及抑制As誘導的轉(zhuǎn)座子活化，從而實現(xiàn)對As吸收的控制[12]。擬南芥WRKY46通過抑制蘋果酸轉(zhuǎn)運體基因的表達，在Al吸收過程中起負調(diào)控作用[13]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子介導植物生理過程是通過不同的信號途徑來實現(xiàn)的。在這些復雜信號網(wǎng)絡(luò)中，除了一系列正、負調(diào)節(jié)子的交互作用外，水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和脫落酸(ABA)等激素參與了上游調(diào)控[14]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)廣泛參與植物的許多發(fā)育與生理過程[15]，也是植物體內(nèi)一種重要的抗逆相關(guān)激素，在包括金屬抗性中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。NO通過直接清除ROS、提高細胞抗氧化酶活力、調(diào)節(jié)植物對金屬的吸收與在細胞內(nèi)的分布等機制，減輕Cd、Al、Cu、Ni、Pb等金屬對植物的毒性[16]。Hong等[17]發(fā)現(xiàn)，Cd處理下，玉米()與超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)基因的表達同時被誘導；原生質(zhì)體瞬間表達分析表明，RNA干擾阻斷了ABA誘導的和基因的表達與酶活性，而超表達則起促進作用。這些結(jié)果提示，ZmWRKY4可能通過調(diào)節(jié)表達在Cd脅迫反應(yīng)中發(fā)揮功能。然而，WRKY在植物Cd響應(yīng)和抗性中的調(diào)節(jié)作用以及NO信號是否參與其中，仍不清晰。

前期我們采用cDNA芯片(Agilent Rice Oligo Microarray，含40 000個基因或轉(zhuǎn)錄本)對NO處理下水稻葉片的全基因組表達譜進行了分析。該芯片含有112個探針，代表71個基因，涵蓋了目前預(yù)測的水稻家族[18]70%的成員。結(jié)果表明，至少在一個時間點有兩倍或以上的表達變化的基因有42個；至少在兩個時間點有兩倍或以上表達變化的基因17個(定義為NO響應(yīng)基因)[19]。這些表達變化得到了實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的印證。我們分析了17個NO響應(yīng)的基因在Cd處理下的誘導表達情況，發(fā)現(xiàn)水稻基因()可被Cd顯著誘導，推測其可能通過NO信號途徑在水稻對Cd脅迫反應(yīng)和抗性中發(fā)揮作用。

本研究基于基因注釋，分離完整的編碼序列，運用生物信息學軟件分析其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，并檢測的空間(器官)特異性及誘導表達模式，擬為的生物學功能研究積累基礎(chǔ)性資料。

1?材料與方法

1.1?水稻培養(yǎng)與處理

在人工氣候室中培養(yǎng)水稻日本晴(L.cv. Nipponbare)至3葉1心期。人工氣候室培養(yǎng)條件如下：光強100 μmol/(m2·s)，光周期14 h光照/10 h黑暗，28℃/22℃，相對濕度85％。用100 μmol/L硝普鈉溶液(NO供體)、1 mmol/L水楊酸(SA)、100 μmol/L 茉莉酸甲酯(MeJA，溶于0.1%甲醇)、100 μmol/L脫落酸(ABA)、1 mmol/L 乙烯利(乙烯供體)對水稻幼苗進行葉面噴施，各處理溶液中含0.1%吐溫80，以蒸餾水或0.1%甲醇噴施為對照。在木村B營養(yǎng)液中添加30 μmol/LCd2SO4作為Cd處理，以未加Cd2SO4的營養(yǎng)液作為對照。

1.2?OsWRKY15 cDNA的分離

基于水稻基因組注釋計劃(http://rice.Plant biology.msu.edu/)注釋的LOC_01g46800序列設(shè)計引物：5′-GGCATGGTGAGGCAACTGG-3′和5′-GGCTGGCAACGTGTAGGAAA-3′，用逆轉(zhuǎn)錄PCR從NO處理的水稻幼苗葉片RNA中擴增。PCR產(chǎn)物純化后，連接到pUCmT載體上，測序驗證。

1.3?序列分析

采用DNAStar軟件推斷基因的開放讀碼框(ORF)及其所編碼的氨基酸序列，計算等電點和分子量。蛋白質(zhì)同源序列搜索用NCBI(http://ncbi. nlm.nih.gov/)的Protein BLAST工具。采用Mega 4.0軟件基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。用PROSITE (http://www.expasy.org/prosite) 預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域和活性位點，用WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測亞細胞定位信號。

1.4?RNA提取與實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

采用TRIZOL試劑抽提總RNA。用FastQuant逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根)合成cDNA第1鏈。qRT-PCR在CFX96 PCR儀(美國伯樂)上進行。以作為內(nèi)參。設(shè)陰性對照和3次重復。結(jié)果利用相對定量方法(2―△△CT)計算。反應(yīng)體系與程序參照參考文獻[18]。引物：5′-GTCG TCGCCCTTCGTGTC-3′, 5′-ATGAACTCCATG TCGTCTCCC-3′。引物：5′-ATCGCCC TGGACTATGAC-3′, 5′-GAAACGCTCAGCAC CAAT-3′。

填充點、豎線、斜線的框和實框分別代表核定位信號、WRKYGQK肽、鋅指和酸性區(qū)。圖中顯示了保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指類型。數(shù)字表示OsWRKY15中的氨基酸位置。

Fig. 1. Schematic diagram of the deduced protein of thegene.

1.5?轉(zhuǎn)錄激活分析

用引物5′-CGGGCATGGTGAGGC AACTGG-3′(下劃線部分為RI酶切位點)和5′-ACGCGGCTGGCAACGTGTAGGAAA -3′(下劃線部分為Ⅰ酶切位點)擴增的完整編碼區(qū)(不含終止密碼子)，用RI/I酶切，插入到PGBKT7(pBD)，構(gòu)建pBD-OsWRKY15。轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，在SD-Trp、SD-Trp-Ade-His選擇培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3 d。b-半乳糖苷酶活性測定按供應(yīng)商說明書進行。分別設(shè)pBD空載體和pBD-OsWRKY30[20]轉(zhuǎn)化子為陰性和陽性對照。

2?結(jié)果與分析

2.1?OsWRKY15 cDNA的克隆與序列分析

從NO處理的水稻幼苗葉片RNA中通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增，獲得與預(yù)期長度(988 bp)一致的cDNA序列，將該基因命名為。其編碼序列最大的ORF長825 bp，推測編碼1個由274個氨基酸組成、分子量為29.1 kD、等電點(pI)為7.3的蛋白質(zhì)。

利用PROSITE對的編碼蛋白進行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明OsWRKY15具有WRKY蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)特征：87~162位為WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指模式為CX7CX23HXC(圖1)。根據(jù)WRKY蛋白的分組原則[9]，歸于第3組。OsWRKY15具有3個酪蛋白磷酸化位點、1 個cAMP 和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點、3 個蛋白激酶C磷酸化位點。用WoLF PSORT預(yù)測，OsWRKY15在77~80位有核定位信號KKRK，提示其定位于細胞核中的可能性最大。189~266位的理論pI為3.4，其中酸性氨基酸(Asp，D和Glu，E)的比例達14.1%(11/78)，遠大于酸性氨基酸在序列中的隨機分布比例，提示OsWRKY15可能具有轉(zhuǎn)錄激活活性[20]，符合作為WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征。

為了解OsWRKY15與不同物種的同源序列之間的進化關(guān)系，利用BLAST在線分析工具對GenBank 的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫進行同源序列搜索。結(jié)果表明，同源性最高的前8個序列均來源于單子葉植物，序列同一性均在50%以上。OsWRKY15與短花藥野生稻() WRKY41 (XP_006664979)在氨基酸水平上的同一性最高(65.3%)，其次為高粱()中推定的WRKY蛋白(XP_002458250)(53.1%)和玉米()WRKY54(XP_008656713)(52.1%)。這些蛋白的WRKY結(jié)構(gòu)域十分保守，然而WRKY結(jié)構(gòu)域之外存在較大分歧，反映了這些同源序列在結(jié)構(gòu)上的多樣性，也暗示它們可能具有不同的生物學功能。在多重序列比對的基礎(chǔ)上，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)。這些序列分成兩個大的進化分支：OsWRKY15與來自單子葉植物的同源序列聚類在一組，而雙子葉植物麻風樹()、川桑()和擬南芥的同源序列聚類在另一組，說明了它們在單、雙子葉植物之間的進化分歧。

2.2?OsWRKY15在不同器官中的表達分析

qRT-PCR表明，在所分析的6種器官中均有表達，其中根中的表達量最高，其次是葉、莖，在穎果、花和干種子中表達量較低(圖3)。

分支上的數(shù)字表示1000次重復的Bootstrap值。

Fig. 2. Phylogenetic tree of OsWRKY15 and WRKY proteins from other species.

不同字母表示在0.01水平差異顯著 (n=6；鄧肯多重范圍檢驗)。

Fig. 3. Expression patterns ofin different rice organs.

2.3?OsWRKY15在Cd和抗逆相關(guān)激素處理下的表達分析

采用qRT-PCR對水稻葉片和根在Cd處理下的表達動態(tài)進行了分析。結(jié)果表明，葉和根中的表達均被Cd誘導，在根中誘導的幅度大于葉。在葉中，Cd處理6 h時表達水平最高，為對照的4.0倍；在根中，Cd處理后1 h，表達至最高值，為對照的8.7倍，然后降低，但12 h的表達量仍顯著高于對照(圖4-A)。提示OsWRKY15可能參與水稻對Cd脅迫的響應(yīng)和抗性。

一氧化氮(NO)、水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(JA)、脫落酸(ABA)和乙烯利(ET)是與Cd脅迫響應(yīng)和抗性相關(guān)的植物激素[21]。為了了解參與Cd脅迫響應(yīng)或抗性所依賴的信號途徑，對在上述5種激素處理后的表達變化進行了檢測。結(jié)果表明，的表達受NO快速且顯著誘導。在根中，NO處理后6 h前表達量呈明顯上升趨勢，6 h達最大值，表達量為0 h對照的15.4倍；在葉中，在處理后1 h達到最大值，此時的表達量為對照的9.9倍，6 h時回復至與對照相當?shù)乃剑缓笥诛@著上升至接近1 h的水平(圖4-B)。同樣，受ABA快速且顯著誘導。處理后1~12 h，葉中的表達量持續(xù)上升；在根中，ABA處理后6 h前呈顯著上升趨勢，然后回落(圖4-E)。從總體上看，無論在根還是葉中，被NO誘導的程度比被ABA誘導的要大。然而，SA、JA和ET處理后，根和葉中的表達無明顯變化, 各時間點表達量均與0 h 對照相當(圖4-C，D，F(xiàn))。

NO、ABA和Cd處理下，在根中受誘導表達的程度明顯高于葉。

以上表明，OsWRKY15可能通過依賴于NO和ABA的信號途徑參與水稻對Cd脅迫的反應(yīng)。

2.4?OsWRKY15的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

從一級結(jié)構(gòu)分析來看，鋅指結(jié)構(gòu)后的區(qū)域含有較多的酸性氨基酸, 提示OsWRKY15可能為一轉(zhuǎn)錄激活子[20]。為驗證此假說，將cDNA的完整編碼序列插入至pGBKT7中Gal4 BD的C端，構(gòu)建與Gal4 BD融合的酵母轉(zhuǎn)化載體，然后轉(zhuǎn)化至酵母AH109中，進行酵母單雜交分析?？蛰d體pGBKT7(負對照)、pBD-OsWRKY15和pBD- OsWRKY30(正對照)[19]均在SD-Trp培養(yǎng)基上生長良好，而在SD-Trp-Ade-His選擇培養(yǎng)基上只有pBD-OsWRKY15和正對照能夠生長(圖5-A)，說明OsWRKY15的確具有轉(zhuǎn)錄激活的能力。b-半乳糖酶活性測定的結(jié)果也證明了這一點(圖5-B)。

A－鎘；B－一氧化氮；C－水楊酸；D－茉莉酸甲酯；E－脫落酸；F－乙烯利。*，**分別表示與0 h對照相比在0.05、0.01水平上有顯著差異(n=6；鄧肯多重范圍檢驗法)。

Fig. 4.expressionin response to different treatments with hormones and Cd exposure.

A－生長在SD-Trp或SD-Trp-Ade-His培養(yǎng)基上的酵母轉(zhuǎn)化子。1－空載體pGBKT7(負對照)；2－pGBKT7-OsWRKY15；3－pGBKT7-30(正對照)。B－酵母轉(zhuǎn)化子的β-半乳糖苷酶相對活性分析。不同小寫字母表示在P<0.05水平上有顯著差異(鄧肯多重范圍檢驗法)。

Fig. 5. Assay of transcriptional activation activity of OsWRKY15 in yeast cells.

3?討論

植物對Cd的響應(yīng)和抗性涉及到許多吸收、轉(zhuǎn)運、解毒相關(guān)基因的表達調(diào)控[4]。轉(zhuǎn)錄是基因表達的第1步，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控體現(xiàn)了經(jīng)濟與靈活的原則，在基因表達調(diào)控中處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)。另外，從潛在的應(yīng)用層面上看，轉(zhuǎn)錄因子在提高作物抗逆方面可能更加有效。因為，作物抗性通常由多基因控制，單個基因的遺傳轉(zhuǎn)化只能部分提高抗性；而一個轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控表達多個性狀或同一性狀的多個基因。因此，分離和鑒定信號途徑中的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)﹃U明植物適應(yīng)Cd脅迫的生理與分子機理至關(guān)重要，同時可能在Cd污染土壤的植物修復和低金屬積累作物品種選育中具有一定的應(yīng)用前景。

基因表達分析可為基因功能解析提供基礎(chǔ)信息?；赾DNA芯片雜交和第2代RNA-Seq測序技術(shù)的基因組尺度上的轉(zhuǎn)錄表分析初步揭示了轉(zhuǎn)錄因子在植物Cd應(yīng)答中起重要的調(diào)節(jié)作用[5, 6]。水稻地上部的表達在Cd處理后24 h提高超過90倍[6]；在Cd超富集植物天藍遏藍菜中，的表達同樣被Cd誘導[23]，提示它們可能參與植物對Cd脅迫的應(yīng)答或抗性。最近，Yang等[24]通過啟動子順式元件分析、酵母單雜交以及基因表達模式分析，發(fā)現(xiàn)剛毛檉柳() WRKY7可能作為液泡膜膜V型質(zhì)子泵基因的上游調(diào)節(jié)子，在Cd抗性中起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究從NO處理的水稻葉片中分離了完整的編碼序列，推定編碼含1個WRKY結(jié)構(gòu)域的蛋白，其鋅指具有水稻第3亞組典型的結(jié)構(gòu)模式[9]，含KKRK典型的核定位信號，預(yù)測定位于細胞核中。轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活域一般富含酸性氨基酸[21]。很多WRKY具有符合上述特征的轉(zhuǎn)錄激活域[9]。OsWRKY15的C端為酸性結(jié)構(gòu)區(qū)，含有4個Glu、7個Asp。酵母單雜交分析表明，OsWRKY15的確具有轉(zhuǎn)錄激活活性。這些結(jié)果提示，OsWRKY15是一個有功能的核調(diào)節(jié)蛋白。

NO、SA、JA、ABA和ET等幾種重要的逆境適應(yīng)相關(guān)激素均參與植物對Cd抗性的建立、維持與活化[22]，因此Cd脅迫應(yīng)答與其他非生物脅迫的抗性反應(yīng)可能享有相似的信號傳遞機制，這也反映了植物對Cd的應(yīng)答、抵御機制的復雜多樣性。一方面，Cd處理可以誘導這些激素在植物組織中的生物合成，改變它們在各器官或組織中積累水平與分布，另一方面這些激素的施用可以通過不同的機制提高植物對Cd的抗性。藥物試驗證明，NO可以降低Cd脅迫下苜蓿的根部對Cd的吸收速率，同時通過激活活性氧清除系統(tǒng)緩解Cd對根細胞的氧化損傷，從而有效地削弱Cd傷害[25]。ABA可以整合不同的脅迫信號，控制下游脅迫反應(yīng)，在植物對干旱、鹽、低溫等多種非生物逆境的抗性中發(fā)揮重要功能[22]。在水稻中，ABA抑制Cd從根向地上部運輸，從而賦予水稻對Cd的抗性[26]。Oono等[6]發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下水稻中ABA依賴的轉(zhuǎn)錄因子(如bZIP、NAC)基因以及許多抗旱相關(guān)基因被Cd顯著誘導，提示Cd與干旱脅迫的信號通路存在“對話”機制。本研究發(fā)現(xiàn)，被Cd快速而顯著誘導，提示它可能參與了水稻對Cd脅迫的響應(yīng)和抗性；盡管誘導時序與程度不同，都能被NO和ABA誘導，提示它可能位于NO和ABA信號途徑的交叉點實現(xiàn)對Cd脅迫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，也不能排除它參與水稻對其他非生物脅迫抗性調(diào)節(jié)的可能性，這尚需進一步證實。SA、JA和ET不影響的表達水平，說明它們可能不參與OsWRKY15介導的對Cd脅迫的應(yīng)答或抗性調(diào)節(jié)。在根、莖、葉等6種器官中表達豐度不一，且根中的表達水平高于其他器官，這與Ramamoorthy等[27]報道的結(jié)果基本一致。有趣的是，Cd、NO和ABA處理下，根部的表達受誘導的程度高于葉。若證明OsWRKY15果真在水稻Cd抗性中具有調(diào)節(jié)功能的話，這些結(jié)果將不難理解，因為植物對Cd吸收以及Cd對植物傷害的原初部位在根部。至于OsWRKY15在水稻Cd脅迫響應(yīng)和抗性中是否具有重要的生物學功能有待下一步研究證明。

[1] Cosio C, Vollenweider P, Keller C. Localization and effects of cadmium in leaves of a cadmium-tolerant willow (L.): I. Macrolocalization and phytotoxic effects of cadmium., 2006, 58: 64-74.

[2] Grant C A, Clarke J M, Duguid S, Chaney R L. Selection and breeding of plant cultivars to minimize cadmium accumulation., 2008, 390: 301-310.

[3] Folgar S, Torres E, Pérez-Rama M, Cid A, Herrero C, Abalde J.as marine microalga highly tolerant to but a poor remover of cadmium., 2009, 165: 486-493.

[4] Verbruggen N, Hermans C, Schat H. Mechanisms to cope with arsenic or cadmium excess in plants., 2009, 12: 364-372.

[5] Tang M F, Mao D H , Xu L W, Li D, Song S, Chen C. Integrated analysis of miRNA and mRNA expression profiles in response to Cd exposure in rice seedlings., 2014, 15: 835.

[6] Oono Y, Yazawa T, Kawahara Y, Kanamori H, Kobayashi F, Sasaki H, Mori S, Wu J, Handa H, Itoh T, Matsumoto T. Genome-wide transcriptome analysis reveals that cadmium stress signaling controls the expression of genes in drought stress signal pathways in rice., 2014, 9(5): e96946.

[7] Farinati S, DalCorso G, Varotto S, Furini A. TheBjCdR15, an ortholog ofTGA3, is a regulator of cadmium uptake, transport and accumulation in shoots and confers cadmium tolerance in transgenic plants., 2010,185: 964-978.

[8] van de Mortel J E, Schat H, Moerland P D, Ver Loren van Themaat E, van der Ent S, Blankestijn H, Ghandilyan A, Tsiatsiani S, Aarts M G. Expression differences for genes involved in lignin, glutathione and sulphate metabolism in response to cadmium inand the related Zn/Cd-hyperaccumulators., 2008, 31: 301-324.

[9] Eulgem T, Rushton P J, Robatzek S, Somssich I E. The WRKY superfamily of plant transcription factors., 2000, 5, 199-206.

[10] Chen L, Song Y, Li S, Zhang L, Zou C, Yu D. The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses., 2012, 819(2): 120-128.

[11] Ricachenevsky F K, Sperotto R A, Menguer P K, Fett J P. Identification of Fe-excess-induced genes in rice shoots reveals a WRKY transcription factor responsive to Fe, drought and senescence., 2010, 37: 3735-3745.

[12] Castrillo G, Sánchez-Bermejo E, de Lorenzo L, Crevillén P, Fraile-Escanciano A, Tc M, Mouriz A, Catarecha P, Sobrino-Plata J, Olsson S, Leo Del Puerto Y, Mateos I, Rojo E, Hernández L E, Jarillo J A, Pi?eiro M, Paz-Ares J, Leyva A. WRKY6 transcription factor restricts arsenate uptake and transposon activation in., 2013, 25: 2944-2957.

[13] Ding Z J, Yan J Y, Xu X Y, Li G X, Zheng S J. WRKY46 functions as a transcriptional repressor of ALMT1, regulating aluminum-induced malate secretion in., 2013, 76: 825-835.

[14] Jiang Y J, Yu D Q. WRKY transcription factors: Links between phytohormones and plant processes., 2015, 58: 501-502.

[15] Lamotte O, Courtois C, Barnavon L, Pugin A, Wendehenne D. Nitric oxide in plants: The biosynthesis and cell signalling properties of a fascinating molecule., 2005, 221: 1-4.

[16] Xiong J, Fu G, Tao L, Zhu C. Roles of nitric oxide in alleviating heavy metal toxicity in plants., 2010, 497: 13-20.

[17] Hong C Y, Cheng D, Zhang G Q, Zhu D, Chen Y, Tan M. The role of ZmWRKY4 in regulating maize antioxidant defense under cadmium stress., 2017, 482: 1504-1510.

[18] Wu K L, Guo Z J, Wang H H, Li J. The WRKY family of transcription factors in rice andand their origins., 2005, 12: 9-26.

[19] 孟姣, 王海華, 向建華, 蔣丹, 彭喜旭, 賀歡歡. 水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族響應(yīng)外源一氧化氮的表達譜分析. 中國水稻科學, 2016, 30(2): 111-120.

Meng J, Wang H H, Xiang J H, Jiang D, Peng X X, He H H. Expression profiles of rice WRKY transcription factor gene family responsive to exogenous nitric oxide application., 2016, 30(2): 111-120. (in Chinese with English abstract)

[20] Peng X X, Hu Y, Tang X, Zhou P, Deng X, Wang H H, Guo Z. Constitutive expression of ricegene increases the endogenous jasmonic acid accumulation, PR gene expression and resistance to fungal pathogens in rice., 2012,236: 1485-1498.

[21] Schwechheimer C, Bevan M. The regulation of transcription factor activity in plants., 1998, 3: 378-383.

[22] Asgher M, Khan M I, Anjum N A, Khan N A. Minimising toxicity of cadmium in plants–role of plant growth regulators., 2015, 252: 399-413.

[23] Wei W, Zhang Y, Han L, Guan Z, Chai T. A novel WRKY transcriptional factor fromnegatively regulates the osmotic stress tolerance of transgenic tobacco., 2008,27: 795-803.

[24] Yang G, Wang C, Wang Y, Guo Y, Zhao Y, Yang C, Gao C. Overexpression ofand its potential upstream regulator,, improved plant tolerance of cadmium stress., 2016, 6: 18752.

[25] Li L, Wang Y, Shen W. Roles of hydrogen sulfide and nitric oxide in the alleviation of cadmium-induced oxidative damage in alfalfa seedling roots., 2012, 25: 617e631.

[26] Uraguchi S, Mori S, Kuramata M, Kawasaki A, Arao T, Ishikawa S. Root-to-shoot Cd translocation via the xylem is the major process determining shoot and grain cadmium accumulation in rice., 2009, 60: 2677-2688.

[27] Ramamoorthy R, Jiang S Y, Kumar N, Venkatesh P N, Ramachandran S. A comprehensive transcriptional profiling of thegene family in rice under various abiotic and phytohormone treatments., 2008, 49: 865-879.

Isolation and Expression Profiles of Cadmium Stress-Responsive Rice WRKY15 Transcription Factor Gene

PENG Xixu1, 2, BAI Ningning1, WANG Haihua1, 2, *

(1School of Life Science, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, China;2Key Laboratory of Ecological Remediation and Safe Utilization of Heavy Metal-polluted Soils, College of Hunan Province, Xiangtan 411201, China;)

【Objective】Cadmium (Cd) is one of the most toxic heavy metal elements to growth and development of plants and human health. WRKY transcription factors play important regulatory roles in the resistance against stresses. But so far, the regulatory functions of WRKY proteins (WRKYs) in the resistant responses to Cd stress in plants remain unclear so far. 【Methods】Full-length coding sequence ofwas amplified by RT-PCR with gene-specific primers designed according to gene prediction. Structural characteristics of OsWRKY15 were analyzed by bioinformatics software; Organ-specific and induced expression patterns ofwere analyzed by qRT-PCR. Transcriptional activation activity of OsWRKY15 was tested by yeast one-hybrid assay.【Results】15,988 bp in length, contained an entire ORF in length of 825 bp, encoding a protein of 274 amino acid residues consisting of one WRKY domain with a zinc finger motif of C2HC, belonging to the WRKY subgroup III. OsWRKY15 had a nuclear localization signal and was predicted to be localized in nucleus. Yeast one-hybrid assay revealed that OsWRKY15 had transcriptional activation activity. The transcript levels ofwere higher in roots than those in stems and leaves, and the least was in panicles, flowers and dry seeds. Its expression was rapidly and significantly induced in response to Cd exposure, nitric oxide (NO) and abscisic acid (ABA) application with more increase folds in roots than in leaves. However, salicylic acid, jasmonic acid and ethylene exerted no obvious effects on the expression of. 【Conclusion】OsWRKY15 may be involved in the regulation of rice resistance response to Cd stress through NO- and ABA-dependent signal pathways.

WRKY transcription factor; cadmium; gene isolation; gene expression profiles;

Corresponding author, E-mail: hhwang@hnust.edu.cn

Q945.78; Q786; S511.032

A

1001-7216(2018)02-0103-08

2017-05-20；

2017-09-15。

國家自然科學基金資助項目(31301617)；湖南省自然科學基金資助項目(2016JJ3060)；湖南省教育廳重點科研平臺開放基金資助項目(15K045)。

通訊聯(lián)系人，E-mail: hhwang@hnust.edu.cn

10.16819/j.1001-7216.2018.7056