岳慧芳，任永哲，王志強(qiáng)，辛澤毓，林同保*

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，鄭州 450002；2 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002；3 小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，鄭州 450002)

20世紀(jì)90年代初，人們首次發(fā)現(xiàn)了circRNAs[1]。circRNAs是一類線性RNA分子通過3′端和其上游的5′端利用共價鍵結(jié)合形成的閉合環(huán)狀RNA分子。隨著對circRNAs研究的深入，發(fā)現(xiàn)人、小鼠和大鼠在不同發(fā)育階段或病理狀態(tài)下，circRNAs與心臟發(fā)育和病理過程關(guān)系密切[2]。通過RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)在秀麗隱桿線蟲、黑腹果蠅、小鼠和人類等生物中circRNAs能夠富集表達(dá)[3-6]，說明這可能是一種普遍存在的調(diào)控現(xiàn)象。最近幾年在水稻[7-8]、小麥[9]、大麥[10]和番茄[11]中也發(fā)現(xiàn)存在大量的circRNAs，其在植物方面的功能也開始逐漸浮出水面。

circRNAs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，序列保守且具有時空表達(dá)特異性。如圖1所示，在轉(zhuǎn)錄后修飾過程中除了存在正向剪接方式，還存在反向剪接，這種可變的反向剪接就形成了circRNAs。由于circRNAs分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被 RNA核糖核酸酶 R(ribonuclease R，RNase R)降解，因此比線性RNA更穩(wěn)定[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)存在大量的circRNAs，它們可以來自基因外顯子區(qū)、基因間區(qū)到反義鏈區(qū)、5′-UTR區(qū)到3′-UTR區(qū)等不同位置[4, 14-15]。

1　circRNAs的形成

1.1　circRNAs的類型

circRNAs有三大類：第一類是外顯子環(huán)化形成的circRNAs[16]；第二類是內(nèi)含子套索化(intra-lariat)形成的內(nèi)含子circRNAs，又稱ciRNAs[17]；第三類是內(nèi)含子與外顯子共同環(huán)化成的circRNAs(extron-intron circRNAs),即EIciRNAs[18]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，circRNAs的種類會伴隨著物種進(jìn)化程度而表現(xiàn)出多樣性[13]。

ciRNAs(僅有內(nèi)含子)與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄；EIciRNAs(含內(nèi)含子與外顯子)與小核糖體U1SnRNP結(jié)合形成復(fù)合體進(jìn)一步與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合促進(jìn)親本基因轉(zhuǎn)錄；circRNAs(僅含外顯子序列)含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)元件(MRE)可吸附microRNA，間接調(diào)控mRNA表達(dá)。此外，circRNAs可作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous，ceRNA)調(diào)控基因的表達(dá)[19]，也可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用[20]。

拼接過程中外顯子順式剪接生成mRNAs，外顯子通過反向剪接形成circRNAs圖1　circRNAs與mRNA形成的區(qū)別[12]circRNAs are most commonly produced from back-splicing events, while mRNA from linear splicing eventsFig.1　The difference between the formation of circRNAs and mRNA

1.2　形成機(jī)制

circRNAs是通過非經(jīng)典剪接方式進(jìn)行反向剪接形成的，并大量存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。Zhang等[21]首次系統(tǒng)地分析了circRNAs的形成機(jī)制，提出了內(nèi)含子中反向互補(bǔ)序列促使形成circRNAs的機(jī)制模型，即依賴 pre-mRNA 中鄰近的2個內(nèi)含子反向互補(bǔ)配對，序列堿基配對形成環(huán)狀套索，拉近剪切位點(diǎn)，進(jìn)而切除內(nèi)含子，促使序列成環(huán)。此外，Ivanov等[22]在線蟲中研究發(fā)現(xiàn)，與線性RNA分子相比，被內(nèi)含子包圍的circRNAs側(cè)翼上富含反向互補(bǔ)序列(reverse complementary sequences，RCMs)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)含子RCMs對circRNAs的形成非常關(guān)鍵，并且雙鏈RNA編輯酶ADAR1也參與了該過程，當(dāng)敲低ADAR1基因的表達(dá)量后，circRNAs的表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子間的互補(bǔ)配對序列通過競爭性結(jié)合的方式介導(dǎo)了外顯子環(huán)化過程。 circRNAs的生成調(diào)節(jié)依賴于在拼接過程中的順式調(diào)控元件和反作用因子[23]，它的外顯子環(huán)化效率取決于外顯子的回切位點(diǎn)[24-25]。研究還表明，circRNAs呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)模式[4-5,20,26]。Sun等[27]對擬南芥樣品進(jìn)行了RNase R與非RNase R處理，從16個擬南芥的RNA-seq數(shù)據(jù)中鑒定了803個circRNAs。試驗結(jié)果表明：規(guī)則剪接與不規(guī)則剪接都可產(chǎn)生circRNAs；葉綠體是最有可能產(chǎn)生circRNAs的細(xì)胞器；互補(bǔ)序列不僅存在于內(nèi)含子中，而且也存在于剪接位點(diǎn)側(cè)翼的序列中。

1.3　circRNAs的鑒定方法

RNA-seq 是一種對RNA進(jìn)行高通量測序的技術(shù)，其結(jié)果可用來注釋新的RNA種類并進(jìn)行GO功能富集[28]?，F(xiàn)在多運(yùn)用circRNA-seq高通量測序手段來研究circRNAs，并基于測序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對鑒定circRNAs。circRNAs的測序流程是：首先利用去核糖體試劑盒和核酸酶R從檢測合格的樣品中去除核糖體RNA和線性RNA分子，然后將得到的circRNAs進(jìn)行隨機(jī)打斷，針對打斷后的序列連接3′和5′端的接頭，進(jìn)而依次進(jìn)行RT-PCR、庫檢、PCR擴(kuò)增和電泳分離目的大小片段，建庫后進(jìn)行測序。將獲得的序列與整個基因組進(jìn)行比對錨定回原位(anchor reads)，但是如果是環(huán)狀的話就會導(dǎo)致這個序列的兩頭對比到不同方向的位置上，這樣的序列被注釋為circRNAs。

通過RT-PCR驗證可將circRNAs與線性RNA區(qū)分開，因為在驗證時circRNAs的引物設(shè)計方向為反方向；也可通過Northern 印跡[29-30]對二者進(jìn)行區(qū)分，以驗證檢測到的RNA是否為環(huán)狀，通過這樣的方法對circRNAs進(jìn)行定量[31]。在circRNAs的研究過程中，用于預(yù)測circRNAs的方法和軟件有CircInteractome[32]、CircRNA finder[33]、finder circ[4]、CIRCexplorer[21]和CIRI[34]。此外還有替代剪接檢測的其他算法，如：Map Splice[35]、Splice Map[36]、Split Seek[37]均可用來查找circRNAs。其中，Chen等[38]開發(fā)的用于植物circRNAs的預(yù)測軟件(稱為PcircRNA_finder)也具有運(yùn)行程序快、靈敏度高的特點(diǎn)。

2　植物與動物中circRNAs的序列特征比較

Ye 等[7]在水稻的根和擬南芥的葉中分別鑒定了12 037和6 012個circRNAs，并比較了植物與動物circRNA的特征。在植物中，circRNAs的側(cè)翼內(nèi)含子(introns flanking)序列比線性基因(linear genes)要長很多，且與動物中的circRNAs相比，植物中的circRNAs具有特有的重復(fù)元件(repetitive elements)和反向互補(bǔ)序列(complementary sequence)。Ye等[8]在水稻中鑒定了約3 000個具有全長序列的circRNAs，進(jìn)一步研究表明，circRNAs的可變環(huán)化是水稻的一個常見特征，該研究還發(fā)現(xiàn)大量水稻circRNAs的連接位點(diǎn)位于不同的非GT/AG剪接信號位的兩側(cè)，而人類大多數(shù)的circRNAs都位于標(biāo)準(zhǔn)的GT/AG剪接信號位。由此可知，circRNAs不僅在植物中廣泛存在，而且與動物中的circRNAs序列有所差異。

3　植物中circRNAs的鑒定

Lu等[39]從水稻的成熟葉和圓錐花序中共鑒定出2 354個circRNAs，并對候選circRNAs分子進(jìn)行了功能預(yù)測與驗證。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的提高，Tan等[40]研究發(fā)現(xiàn)在番茄的果實(shí)(solanum lycopersicum)中確定了數(shù)千個推定的反向剪接位點(diǎn)，結(jié)果顯示某些circRNAs的豐度會隨著果實(shí)的成熟過程發(fā)生變化，該研究在番茄品種Ailsa Craig和micro Tom中對源自木霉合酶1(phytoene synthase 1，PSY1)的一個circRNAs進(jìn)行過表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中PSY1 mRNA的豐度、番茄紅素和β-胡蘿卜素積累均有所變化。不僅在主要的糧食作物中鑒定到circRNAs，而且在一些經(jīng)濟(jì)作物中也有所發(fā)現(xiàn)。Zhao等[41]通過測序與生物信息學(xué)分析在大豆中共鑒定了5 372個circRNAs，其中約80%同源circRNAs(paralogous circRNAs)是由同源基因產(chǎn)生，此外同源基因還可產(chǎn)生不同表達(dá)模式的同源circRNAs。在不同植物中鑒定circRNAs的背景不同，擬南芥作為一種模式植物，相關(guān)研究還對擬南芥葉片生長與衰老過程中circRNAs的表達(dá)譜及其功能進(jìn)行了分析[42]，在擬南芥中共鑒定了168個circRNAs，其中158個circRNAs是由外顯子產(chǎn)生的，包括在葉片中新發(fā)現(xiàn)的40個circRNAs，該研究表明從G期到M期差異表達(dá)的circRNAs有6個，從M期到S期差異表達(dá)的circRNAs有35個。通過GO分析與KEGG通路分析表明，circRNAs可能參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、卟啉(porphyrin)及葉綠素代謝過程，并推測circRNAs可能在擬南芥葉片的衰老過程中起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs可能在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮了重要的作用。Zhao等[43]運(yùn)用RNA-seq測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析了大豆對昆蟲的抗性基因，對相關(guān)的circRNAs全基因組譜進(jìn)行了分析，該研究鑒定出了5 367個circRNAs，其中3 377個是耐藥型的，而且不同感受性樣品之間的circRNAs具有不同的表達(dá)模式，還預(yù)測某些circRNAs可參與昆蟲抗性過程，另外預(yù)測了在大豆中有5 356個circRNAs能與miRNA模擬物(miRNA mimics)結(jié)合，這些circRNAs屬于69個miRNA家族(miRNA families)，miR1514家族含有的circRNAs的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目最多，其次是miR1520、miR172、miR159、miR156 和miR395家族。最新研究中對circRNAs與miRNA的關(guān)系進(jìn)行了分析，Gang等[44]選取了處于不同發(fā)育時期的植物樣品，并進(jìn)行了4個脅迫處理，構(gòu)建了14文庫(strand-specific libraries)，通過對擬南芥和其他物種的circRNAs序列相似性的分析表明，一些circRNAs在植物中是保守的，circRNAs的許多親本基因參與了植物發(fā)育、繁殖以及對逆境刺激的響應(yīng)等基本生物過程，另外一小部分circRNAs則是潛在的miRNA靶標(biāo)，說明這些circRNAs可以與miRNA相互作用來調(diào)控基因表達(dá)。

Ye等[7]分別對水稻和擬南芥在缺磷與正常條件下的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，circRNAs在磷充足與磷饑餓脅迫下表現(xiàn)出明顯差異，表明circRNAs可能在響應(yīng)磷脅迫中起到作用。在植物的自然生長環(huán)境中，除了缺磷脅迫外還有其他的生物與非生物脅迫，比如冷害脅迫、水分脅迫、低氮脅迫等。有研究在小麥的幼苗葉中發(fā)現(xiàn)了88個候選基因，其中有6個circRNAs具有相應(yīng)miRNA的海綿功能[9]，而有62個circRNAs在干旱和對照下表現(xiàn)出顯著差異，其中16個上調(diào)表達(dá)，46個下調(diào)表達(dá)，這表明在應(yīng)對干旱脅迫時，circRNAs具有不同程度的表達(dá)特異性;還通過KEGG對靶mRNA的功能進(jìn)行分析，得到了183個通路，其中一些通路與已知的小麥或其他高等植物的抗旱性相關(guān)，說明葉片中的circRNAs可能參與了小麥幼苗耐旱性的響應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn)了在番茄中不僅有163個circRNAs可能對冷害做出響應(yīng)[11]，而且有104個circRNAs具有miRNA的海綿功能。由于circRNAs是閉環(huán)結(jié)構(gòu)，可以使其半衰期延長[45]，有些circRNAs可能作為生物或非生物脅迫的緩沖調(diào)節(jié)劑，通過與DNA形成R-環(huán)(R-loop)來調(diào)節(jié)其親本基因的表達(dá)，circRNAs的這種作用方式可能是植物界的一種普遍機(jī)制。由此可知，circRNAs不僅在植物體的生長發(fā)育中有顯著的時空表達(dá)特異性，而且還可能參與了對多種生物和非生物脅迫的響應(yīng)。

4　功能解析

一直以來，人們對于動物中circRNAs的鑒定和功能研究較多，但在植物中的研究還相對較少。通過全基因組范圍內(nèi)鑒定circRNAs，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可預(yù)測其在植物中的功能及其參與植物體代謝的通路。circRNAs 對基因表達(dá)的過程產(chǎn)生影響，并間接影響生物體的發(fā)育。近來，在鑒定大麥的親本基因時發(fā)現(xiàn)了參與多種細(xì)胞代謝的circRNAs[10]，這些基因參與了激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝、氨基酸生物合成、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程。此外，circRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平上也具有很多重要的調(diào)控功能，包括 circRNAs 調(diào)控可變剪切、miRNA 海綿功能、與 RNA 結(jié)合蛋白(RBPs)及核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoprotein complex)結(jié)合等，circRNAs還具有調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)[21]和順式轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能[17]。

Memczak等[4]首次提出circRNAs的miRNA 海綿功能模型，研究發(fā)現(xiàn)CDR1as上存在63個miR-7的結(jié)合位點(diǎn)，因此稱為miRNA 海綿功能模型。在隨后的多項研究中均有類似發(fā)現(xiàn)，比如：circRNASry基因的表面包含16個miRNA-138的結(jié)合位點(diǎn)[26]，但在發(fā)育成熟后主要以circRNAs的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[46]；Zheng等[47]發(fā)現(xiàn)circHIPK3能夠結(jié)合9種miRNA并且找到了18個潛在結(jié)合位點(diǎn)。此外，Salzaman 等[16]研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在果蠅中普遍存在，且不同部位的circRNAs呈現(xiàn)特異性表達(dá)。為了進(jìn)一步明確circRNAs在轉(zhuǎn)錄水平上的作用，Su等[48]開發(fā)了一種circRNAs 體內(nèi)沉淀(circRNAs in vivoprecipitation，circRIP)技術(shù)，這種技術(shù)可專門釣取目標(biāo)circRNAs競爭性結(jié)合的miRNA。但有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)型(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程中，并沒有具有富集到circRNA的miRNA靶位點(diǎn)[49]，因此對circRNAs與miRNA的功能和作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。目前對植物中circRNAs功能的研究相對較少，有關(guān)研究通過對水稻和擬南芥的模擬目標(biāo)進(jìn)行識別[50-51]，發(fā)現(xiàn)一小部分circRNAs(水稻6.6%、擬南芥5.0%)具有miRNA的潛在目標(biāo)位點(diǎn)，這是因為產(chǎn)生circRNAs的基因組區(qū)域含有miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，但不明確結(jié)合位點(diǎn)的屬性。還有研究表明部分circRNAs的生成會降低基因mRNA的表達(dá)水平[52]，那么這些circRNAs是否具有保守性，其在植物體內(nèi)是否也存在相似的調(diào)節(jié)功能，需要進(jìn)一步試驗證實(shí)。動物中E3與miR-7以及miR-214的相互作用可提高泛化素蛋白連接酶E3的表達(dá)水平[53]，證明在細(xì)胞核內(nèi)ciRNAs以及EIciRNAs均可調(diào)節(jié)親本基因的表達(dá)[54]，在植物體內(nèi)的泛化素蛋白發(fā)生連接的過程中，ciRNAs與EIciRNAs是否也可參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的過程以及是否具有類似功能均有待進(jìn)一步研究。

circRNAs不僅可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程，而且還參與蛋白質(zhì)合成過程，可與RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins，RBPS)相結(jié)合形成RNA蛋白復(fù)合物(RNA-protein cpmplexes，RPCs)，通過部分堿基互補(bǔ)配對直接作用于靶基因[55-56]。在蛋白水平上，RNA 結(jié)合蛋白(RBPs)也調(diào)節(jié)了circRNAs 的形成。在人體中發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609可直接翻譯蛋白，且該蛋白還參與了肌肉的生成過程[57]。Sebastian Kadener等[58]發(fā)現(xiàn)大量circRNAs可以翻譯成蛋白或多肽，并且發(fā)現(xiàn)有核糖體可結(jié)合circMbl的終止密碼子。另外，在水稻中的研究也發(fā)現(xiàn)，一個220 nt的circRNAs構(gòu)成的擬病毒在感染植株后會在這種可復(fù)制的circRNAs分子上表達(dá)出一個16 kD大小的蛋白分子[59]。據(jù)此推測，在小麥等其他植物中可能也存在circRNAs翻譯成蛋白的現(xiàn)象。此外通過對人工合成的circRNAs進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)合成的circRNAs可進(jìn)入核糖體內(nèi)部的翻譯位點(diǎn)[60]，從而證明circRNAs具有編碼蛋白質(zhì)的功能。由于circRNAs沒有poly(A)尾結(jié)構(gòu)，不易被降解，說明circRNAs在調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成上可能具有關(guān)鍵性的作用[61]。

5　circRNAs的研究存在問題及展望

基于二代測序的RNA-Seq(RNA sequencing)技術(shù)大大提高了研究不同RNA分子的能力，目前已開發(fā)出了多種線性RNA分子中RNA拼接的信息學(xué)分析算法，但如何提高circRNAs拼接預(yù)測的精確性依然是一個富有挑戰(zhàn)的問題。此外，樣品的制備方面，還需要考慮樣品純度、RNA和cDNA水平、分子大小過濾和樣品片段化處理等情況。相信隨著測序技術(shù)的日益成熟和生物信息學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，對包括circRNAs在內(nèi)的所有RNA序列的測定、拼接和預(yù)測會變得越來越準(zhǔn)確和可靠，為進(jìn)一步深入研究circRNAs的功能奠定基礎(chǔ)。

在人類與動物體中對circRNAs的功能已有較多的研究，對于circRNAs在植物體中的研究才剛剛起步，植物體內(nèi)circRNAs是否也存在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上的調(diào)控作用？哪種是主要機(jī)制？是否也存在吸附miRNA的sponge功能？都尚未可知。但從已有文獻(xiàn)報道結(jié)果看來，大量的circRNAs分子參與了植物對多種逆境脅迫的響應(yīng)與生長發(fā)育的調(diào)控過程。相信隨著研究的逐漸深入，circRNAs在植物中的調(diào)控作用會越來越引起人們的重視，其調(diào)控機(jī)制也會慢慢浮出水面。

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