周亞麗，欒雪濤，王利廷，張振文,2，惠竹梅,2*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西楊陵 712100；2 陜西省葡萄與葡萄酒工程中心，陜西楊陵712100)

土壤鹽漬化是世界性的農(nóng)業(yè)問(wèn)題，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量，甚至還會(huì)造成植株死亡[1]。Downton將赤霞珠葡萄(Vitisvinifera)定義為對(duì)鹽適度敏感的植物，當(dāng)溫室栽培的赤霞珠葡萄用NaCl濃度超過(guò)50 mmol/L的營(yíng)養(yǎng)液灌溉時(shí)，芽的生長(zhǎng)速度會(huì)大大減少[2]。鹽脅迫產(chǎn)生的活性氧類(lèi)物質(zhì)會(huì)造成葡萄植株根際微環(huán)境的紊亂，葉片中葉綠素含量、有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性降低等傷害，進(jìn)而影響葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。在植物系統(tǒng)中，這些活性氧類(lèi)物質(zhì)通過(guò)由抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)及其他抗氧化劑組成的抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)清除[4]，這一系統(tǒng)就是我們所知的抗壞血酸-谷胱甘肽(ASA-GSH)循環(huán)系統(tǒng)。正常情況下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生傷害。在鹽脅迫初期，植物可通過(guò)自身調(diào)節(jié)增加體內(nèi)抗氧化酶類(lèi)和非酶類(lèi)抗氧化物質(zhì)協(xié)同清除由于鹽脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，減輕鹽脅迫對(duì)植物的傷害，提高植物的抗鹽性。長(zhǎng)時(shí)間鹽脅迫會(huì)使植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)失去平衡，氧自由基大幅增加誘導(dǎo)氧化脅迫，進(jìn)而引起細(xì)胞膜系統(tǒng)氧化損傷[5-7]。

應(yīng)用外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑被認(rèn)為是提高植物抗逆性的有效方法之一[4, 8]。油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids, BRs)是一種新型的天然植物激素，在逆境條件下，BRs能夠激發(fā)植物的內(nèi)在潛能，緩解植物受到的逆境傷害，提高植物的抗逆性[9-11]；研究表明，BRs處理可以顯著提高葡萄[12]、黃瓜[13]、小麥[14, 15]、薄荷[16]等作物對(duì)低溫脅迫、鹽脅迫的抗性；在逆境脅迫下，BRs處理通過(guò)提高AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中抗壞血酸(AsA)和還原型谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物質(zhì)的含量及APX、GR、SOD活性，從而提高茄子[17]、黃瓜[18]和無(wú)柄小葉榕[19]等植物的抗氧化能力，緩解高溫、低溫和鹽脅迫對(duì)植株造成的傷害。但關(guān)于外源BRs預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下葡萄幼苗葉片中抗氧化物質(zhì)及酶活性影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以2年生扦插苗葡萄品種赤霞珠為試材，探究外源油菜素內(nèi)酯(EBR)預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下葡萄幼苗葉片抗氧化物質(zhì)及酶活性的影響，以明確EBR在葡萄幼苗受到鹽脅迫時(shí)的調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步研究BRs調(diào)控葡萄幼苗耐鹽機(jī)理和利用EBR減輕葡萄幼嫩組織鹽堿傷害提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2016年在西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所人工智能氣候室和葡萄酒學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，供試品種為歐亞種釀酒葡萄品種赤霞珠(Cabernet Sauvignon)，材料為兩年生扦插苗。

1.2　幼苗預(yù)培養(yǎng)與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)移苗：當(dāng)盆栽扦插苗長(zhǎng)到10～12片真葉時(shí)，選取生長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗用自來(lái)水將根系上的泥土洗凈，并用海綿纏繞根的基部，然后將其移到裝有1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培盆中(50 cm×35 cm×15 cm)，并固定在水培盆的泡沫蓋上，在人工氣候室(AGC-D001P頂置光氣候室)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。

(2)加營(yíng)養(yǎng)液：在水培盆中注水，每盆添加1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液17 L，然后用帶刻度注射器向水中添加各種營(yíng)養(yǎng)成分，其中大量元素每種添加21.25 mL，微量元素添加8.5 mL，用H3PO4或NaOH將營(yíng)養(yǎng)液pH調(diào)至6.5±0.1。

(3)環(huán)境調(diào)控：將通氣管穿過(guò)泡沫板小孔，底部連接沙錘。各個(gè)水培盆用三通與通氣管連接，再將主通氣管與氣泵相連，氣泵正常通氣(30 min/h)。每5 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)室內(nèi)溫度為晝溫23～25 ℃/夜溫15～18 ℃，光源為日光燈(14 h光照/d)，光照強(qiáng)度為160 μmol·m-2·s-1。

(4)處理：幼苗在營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d完全適應(yīng)水培環(huán)境后，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)向營(yíng)養(yǎng)液中加入不同濃度(0.05、0.10、0.20 mg/L)EBR(美國(guó)Sigma 公司)，適應(yīng)5 d后，加入50 mmol/L的NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理。試驗(yàn)設(shè)5組處理：CK，正常生長(zhǎng)組(0 mg/L EBR+0 mmol/L NaCl)；T0，鹽對(duì)照組(0 mg/L EBR+50 mmol/L NaCl)；T1，0.05 mg/L EBR+50 mmol/L NaCl；T2，0.10 mg/L EBR+50 mmol/L NaCl；T3，0.20 mg/L EBR+50 mmol/L NaCl。各處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8株幼苗，共計(jì)120株。EBR施用前用98%的乙醇溶解后稀釋到需要的濃度，乙醇最終含量為0.1%(v/v)，用吐溫-80 ℃作為展開(kāi)劑，最終含量為0.1%(v/v)，CK和T0組也加入同樣體積的98%乙醇和吐溫-80 ℃。

(5)采樣：分別在鹽脅迫處理后的第6 天和第12 天，采取葡萄幼苗從基部起3～7節(jié)位的葉片。將葉片樣品用剪刀除去葉脈，并將葉片其他部位剪碎，放入封口袋中，密封保存于-80 ℃冰箱，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3　測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4　數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件作圖、DPS7.55進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用鄧肯氏檢驗(yàn)方法進(jìn)行多重比較，差異顯著性用不同的字母顯示。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果用3次試驗(yàn)的平均值表示。

2　結(jié)果與分析

2.1　EBR預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下葡萄幼苗葉片超氧陰離子和丙二醛(MDA)含量的影響

CK.正常對(duì)照(無(wú)EBR和鹽處理)；T0.鹽處理(50 mmol/L NaCl)；T1. EBR 0.05 mg/L +50 mmol/L NaCl；T2. EBR 0.10 mg/L+50 mmol/L NaCl；T3. EBR 0.20 mg/L+50 mmol/L NaCl，同期不同小寫(xiě)字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05)；圖中短線(xiàn)代表標(biāo)準(zhǔn)誤；下同圖1　EBR預(yù)處理葡萄幼苗葉片和MDA 含量在鹽脅迫下的變化CK.Control(without EBR and salt treatments)；T0.Salt treatment(50 mmol/L NaCl,only)；T1. EBR 0.05 mg/L +50 mmol/L NaCl；T2. EBR 0.10 mg/L+50 mmol/L NaCl；T3. EBR 0.20 mg/L+50 mmol/L NaCl，Different normal letters above the columns mean significant difference among treatments within same time at the 0.05 level; Bars represent SE. The same as belowFig.1　The and MDA contents in grape seedlings with EBR pretreatment under salt stress

2.2　EBR預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下葡萄幼苗葉片AsA、DHA含量及其比值的影響

抗壞血酸(AsA)是植物抵抗氧化脅迫的重要物質(zhì)，其含量的高低與植物的抗逆性密切相關(guān)；而脫氫抗壞血酸(DHA)含量的積累對(duì)細(xì)胞代謝及相關(guān)酶活性會(huì)產(chǎn)生不利影響[26]。而AsA/DHA也是植物抵抗非生物脅迫誘發(fā)的活性氧類(lèi)物質(zhì)積累的關(guān)鍵因素，AsA/DHA的值越大，抗脅迫能力越強(qiáng)[27]。圖2，A顯示，T0處理葡萄幼苗葉片中AsA含量在鹽脅迫6 d和12 d時(shí)均比CK不同程度升高，且在鹽脅迫12 d時(shí)達(dá)到顯著水平。與T0處理相比，T2處理葡萄幼苗葉片AsA含量在鹽脅迫6和12 d時(shí)分別顯著提高20.3%和82.8%，而T1和T3處理葡萄葉片AsA含量在鹽脅迫后均無(wú)顯著變化。

同時(shí)，如圖2，B所示，T0處理葡萄幼苗葉片中DHA含量均比CK不同程度降低，在鹽脅迫6 d時(shí)還達(dá)到顯著水平。與T0處理相比，T1處理葡萄幼苗葉片中DHA含量?jī)H在鹽脅迫12 d時(shí)顯著升高45.5%，在脅迫6 d時(shí)無(wú)顯著變化，T2處理DHA含量在鹽脅迫6 和12 d時(shí)分別顯著升高23.4%和70.9%，而T3處理DHA含量在鹽脅迫過(guò)程中均無(wú)顯著變化。另外，在圖2，C中，T0處理葡萄幼苗葉片中AsA/DHA均比同期CK顯著升高。在鹽脅迫6 d時(shí)，T1～T3處理葡萄葉片AsA/DHA均與T0之間無(wú)顯著性差異；在鹽脅迫12 d時(shí)， T1處理葡萄幼苗葉片中AsA/DHA比T0顯著降低39.1%，T2處理AsA/DHA比T0顯著升高7.0%，而T3處理AsA/DHA則與T0處理之間無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果說(shuō)明0.1 mg/L EBR預(yù)處理使葡萄幼苗葉片具有較高的AsA、DHA含量和AsA/DHA，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗鹽能力。

圖2　EBR預(yù)處理葡萄幼苗葉片ASA含量、DHA含量及AsA/DHA在鹽脅迫下的變化Fig.2　The AsA, DHA contents and AsA/DHA in grape seedlings with EBR pretreatment under salt stress

2.3　EBR預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下葡萄幼苗葉片GSH、GSSG含量及其比值的影響

GSH是細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物的有效清除劑之一，GR在植物細(xì)胞AsA-GSH循環(huán)中可將GSSG還原為GSH，從而增強(qiáng)植物的抗逆性。同時(shí)，GSH/GSSG也是植物抵抗非生物脅迫誘發(fā)的活性氧類(lèi)物質(zhì)積累的關(guān)鍵因素，GSH/GSSG的值越大，抗脅迫能力越強(qiáng)[27]；保持較高GSH/GSSG在提高植物耐鹽性方面起著非常重要的作用[28]。首先，T0處理葡萄幼苗葉片中GSH含量在鹽脅迫過(guò)程中均比同期CK顯著增加；與T0處理相比，葡萄葉片GSH含量除在T2處理12 d時(shí)顯著升高29.7%外，而在其余時(shí)期EBR預(yù)處理中顯著降低(圖3，A)。其次，T0處理葡萄幼苗葉片中GSSG含量在鹽脅迫6和12 d后均比CK不同程度增加，但僅在鹽脅迫12 d時(shí)達(dá)到顯著水平；與T0處理相比，葡萄葉片GSSG含量?jī)H在鹽脅迫6 d時(shí)的T1處理顯著升高6.8%，而在其余脅迫時(shí)間各濃度EBR處理下顯著降低(圖3，B)。另外，T0處理葡萄幼苗葉片中GSH/GSSG在鹽脅迫6和12 d時(shí)分別比CK顯著增大185.2%和106.6%；與T0處理相比， T2處理葡萄葉片GSH/GSSG在鹽脅迫6 d和12 d時(shí)均不同程度增加，且在處理12 d時(shí)顯著增加49.2%，而T1和T3處理葡萄葉片GSH/GSSG在兩個(gè)時(shí)期均顯著降低(圖3,C)?？梢?jiàn)，鹽脅迫誘導(dǎo)葡萄幼苗葉片GSH、GSSG及比值不同程度提高,而0.1 mg/L EBR預(yù)處理又促使各指標(biāo)值在鹽脅迫葡萄幼苗葉片中保持較高水平，從而有效增強(qiáng)葡萄幼苗的抗鹽能力。

2.4　EBR預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下葡萄幼苗葉片SOD、APX、GR活性的影響

首先，與CK相比，T0處理葡萄幼苗SOD活性在各鹽脅迫時(shí)間內(nèi)均顯著增加；而與T0處理相比，3種濃度的EBR預(yù)處理均使葡萄幼苗SOD的活性不同程度增加，尤其在T2處理下升幅均達(dá)到顯著水平(圖4,A)，在鹽脅迫6和12 d時(shí)SOD活性分別顯著升高20.1%和24.0%。其次，T0處理葡萄葉片APX活性均比同期CK顯著升高；與T0處理相比，同期T1和T3處理葡萄幼苗葉片APX活性均不同程度降低，在鹽脅迫6 d還達(dá)到顯著水平，而T2處理APX活性卻在鹽脅迫6和12 d時(shí)分別顯著升高7.1%和8.5%(圖4,B)。此外，GR是AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，可維持細(xì)胞內(nèi)GSH含量的穩(wěn)定，催化GSSG還原為GSH，其活性限制AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的運(yùn)行速率。圖4，C顯示，T0處理處理葡萄幼苗葉片中GR活性在鹽脅迫12 d時(shí)比CK顯著升高35.1%，而在脅迫6 d時(shí)比CK稍高。與T0處理相比，T1和T3處理葡萄幼苗葉片中GR活性在鹽脅迫6 d時(shí)均顯著升高，而在脅迫12 d時(shí)均顯著降低，T2處理葡萄幼苗葉片GR活性則在兩個(gè)時(shí)期均顯著升高，其在鹽脅迫12 d時(shí)增加幅度為7.2%。可見(jiàn)，在鹽脅迫環(huán)境下，EBR預(yù)處理能誘導(dǎo)葡萄幼苗葉片APX、SOD抗氧化酶活性的提高，有效清除超氧陰離子自由基對(duì)細(xì)胞膜的損害，抑制膜脂過(guò)氧化反應(yīng)；尤其是0.10 mg/L EBR預(yù)處理還可有效誘導(dǎo)葡萄葉片GR活性的提高，進(jìn)一步增加GSH含量和GSH/GSSG比值，促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)高效運(yùn)行，有助于緩解鹽脅迫對(duì)葡萄幼苗的傷害[29]。

圖3　EBR預(yù)處理葡萄幼苗葉片GSH含量、GSSG含量及GSH/GSSG 在鹽脅迫下的變化Fig.3　The GSH, GSSG contents and GSH/GSSG of grape seedlings with EBR pretreatment under salt stress

圖4　EBR預(yù)處理葡萄幼苗葉片抗壞血酸過(guò)氧化物酶SOD、APX及GR活性在 鹽脅迫下的變化Fig.4　The SOD, APX and GR activities of grape seedlings with EBR pretreatment under salt stress

3　討　論

BRs是一種被廣泛用于增強(qiáng)植物抗逆性的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[9]，它可通過(guò)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量及相關(guān)酶的活性，從而提高植株的抗氧化能力，緩解逆境脅迫對(duì)植株造成的傷害[15, 17-19]。

而抗氧化酶類(lèi)和非酶類(lèi)抗氧化物質(zhì)所構(gòu)成的抗氧化系統(tǒng)是植物自身在逆境條件下應(yīng)對(duì)膜脂過(guò)氧化傷害的重要機(jī)制，目前在這方面已有較多研究[32-34]。其中，AsA和GSH在植物抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與單獨(dú)鹽脅迫處理(T0)相比，0.05 和0.20 mg/L EBR預(yù)處理(T1和T3)均使葡萄幼苗葉片AsA和GSH含量降低，以及AsA/DHA和GSH/GSSG減小，而0.10 mg/L EBR預(yù)處理(T2)使葡萄幼苗葉片AsA和GSH含量以及AsA/DHA和GSH/GSSG顯著增大。說(shuō)明適宜濃度的外源BRs處理可提高葡萄葉片抗氧化劑AsA和GSH的含量，從而提高赤霞珠葡萄的耐鹽性，這與?zkan等[16]的研究結(jié)果一致。

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