王夢葉，杜曉華，賈文慶，穆金艷，朱小佩，劉會超

(河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

染色體核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)的基本研究方法，是研究物種演化、染色體結(jié)構(gòu)以及分類、功能與形態(tài)之間關(guān)系所不可缺少的重要手段，是細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞分類學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)研究中的基本方法之一[1]。了解物種的核型也是開展雜交育種工作的重要基礎(chǔ)。染色體核型己被廣泛應(yīng)用于洋水仙[2]、百合[3]、李[4-5]等園藝作物，為研究它們的遺傳關(guān)系、起源演化以及開展育種工作等提供了必要的細(xì)胞學(xué)證據(jù)。大花三色堇(Violawittrockiana)和角堇(Violacornuta)均屬于堇菜科(Violaceae)堇菜屬(Viola)草本花卉，近年來在中國城鄉(xiāng)綠化中，作為花壇、花境、地被植物材料大量應(yīng)用[6]。目前關(guān)于角堇及大花三色堇的細(xì)胞學(xué)特征比較的研究較少。弄清2種植物的細(xì)胞學(xué)特征對于堇菜屬植物的分類和雜交育種具有重要的價(jià)值。本研究選取河南科技學(xué)院三色堇課題組選育的2份角堇和4份大花三色堇自交系為試驗(yàn)材料，采用根尖常規(guī)壓片法對染色體數(shù)目和核型進(jìn)行分析與比較，旨在為2種堇菜屬植物親緣關(guān)系分析、雜交育種等方面研究提供借鑒。

1　材料和方法

1.1　材　料

試材為河南科技學(xué)院三色堇課題組選育的2份角堇和4份大花三色堇自交系，其來源見表1。

1.2　方　法

1.2.1染色體制片將種子在室溫下浸種15 min，然后溫湯浸種(55 ℃，浸種20 min)。將處理后的種子放在培養(yǎng)皿中，置于20 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光催芽。當(dāng)種子胚根長至0.8～1.0 cm時(shí)，切取根尖(1～2 mm)，置于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中，4 ℃環(huán)境下處理4 h后用FAA(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)固定液中固定12～24 h。將固定好的根尖用蒸餾水沖洗2～3次后置于預(yù)熱60 ℃的1 mol/L的鹽酸中解離6～8 min。取出根尖反復(fù)沖洗后，截

取1～2 mm，卡寶品紅染色2～3 min后常規(guī)壓片。

1.2.2細(xì)胞學(xué)觀察封片后在 Nikon Eclipse 80i顯微鏡的100×油鏡下觀察，按照李懋學(xué)等[7]的植物核型分析標(biāo)準(zhǔn)，每份材料取30個(gè)處于有絲分裂的細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，并從中選取5個(gè)染色體形態(tài)和著絲粒清晰、數(shù)目完整的細(xì)胞進(jìn)行顯微分析。

1.2.3數(shù)據(jù)分析染色體相對長度、臂比及類型采用Levan et等[8]的命名系統(tǒng)，染色體相對長度系數(shù)按照Kuo等[9]的方法劃分，核型分類采用Stebbins[10]的標(biāo)準(zhǔn)。并用Excel和Photoshop CS 軟件處理數(shù)據(jù)并繪制核型模式圖。染色體相對長度=染色體絕對長度/染色體組總長度×100；著絲粒指數(shù)=短臂長度/染色體全長×100%；臂比=長臂/短臂；核型不對稱系數(shù)=長臂總長/全組染色體總長。

2　結(jié)果與分析

2.1　角堇和大花三色堇染色體數(shù)目差異

對6份試驗(yàn)材料染色體分散良好的細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)，2份角堇自交系JB-1-1-2、JP-1-1-2的染色體數(shù)目均為26條，均占計(jì)數(shù)細(xì)胞的100%(圖1，A、B)；4份大花三色堇中，G10-1-3-1-4 和XXL-YB-1-1-1-1的染色體數(shù)目為48(圖1，C、F)，分別占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)的80.0%和83.3%；EYO-1-2-1-4 和 DSRFY-1-1-2染色體數(shù)目為44(圖1，D、E)，分別占計(jì)數(shù)細(xì)胞的80.5%和83.5%。

2.2　核型分析

根據(jù)李懋學(xué)等[7]提出的植物核型分析標(biāo)準(zhǔn)，染色體核型可分為長染色體(L)、中長染色體(M2)、中短染色體(M1)以及短染色體(S)。從2份角堇和4份大花三色堇自交系染色體長度特征來看(圖1)，其中M2型染色體最多，其次是S型染色體。除JP-1-1-2沒有中短染色體(M1)外，其他5份材料均含有4種染色體類型。由表2和表3可以看出，6份自交系染色體相對長度范圍為4.01～15.59，其中角堇染色體相對長度范圍為4.01～14.67；大花三色堇染色體相對長度范圍為4.49～15.59。6份材料均未發(fā)現(xiàn)隨體。

表1　角堇和大花三色堇材料來源

A.JB-1-1-2; B.JP-1-1-2; C.G10-1-3-1-4; D.EYO-1-2-1-4; E.DSRFY-1-1-2; F.XXL-YB-1-1-1-1.圖1　角堇和大花三色堇的染色體數(shù)目及核型圖Fig.1　Chromosome and karyotype image of V. cornuta and V. wittrockiana

自交系Name染色體序號Chromosomenumber相對長度Relativelength/%臂比Armratio類型Type相對長度系數(shù)IndexofrelativelengthJB-1-1-212.72+7.71=10.432.83smL22.31+8.12=10.433.52stL32.29+7.31=9.603.19stL42.16+6.48=8.642.99smM152.31+5.63=7.942.44smM162.13+5.21=7.342.44smM272.79+4.59=7.371.65mM282.91+4.38=7.291.50mM292.10+4.80=6.902.28smM2101.58+5.61=7.203.54stM2112.52+3.60=6.121.43mM2122.31+2.70=5.011.17mS131.76+3.97=5.732.25smSJP-1-1-214.15+8.15=12.311.96smL24.72+7.90=12.611.67mL36.77+7.91=14.671.17mL41.73+5.58=7.313.22stM251.90+4.97=6.872.62smM261.66+5.24=6.903.16stM272.08+4.29=6.372.06smM282.44+5.02=7.462.06smM291.68+4.15=5.832.48smM2101.93+3.92=5.852.03smM2111.58+3.57=5.152.26smS121.08+3.57=4.653.30stS131.09+2.92=4.012.67smS

表3　大花三色堇染色體參數(shù)

續(xù)表3Continued Table 3

自交系Name染色體序號Chromosomenumber相對長度Relativelength/%臂比Armratio類型Type相對長度系數(shù)IndexofrelativelengthXXL-YB-1-1-1-112.85+12.74=15.594.46stL22.20+9.32=11.524.23stL33.62+6.38=10.001.76smM143.08+6.81=9.892.21smM153.04+5.70=8.741.88smM162.17+6.11=8.282.82smM272.42+5.25=7.672.17smM281.98+4.47=6.452.26smM291.55+4.28=5.832.77smS101.95+4.10=6.042.10smS111.46+4.04=5.502.77smS121.92+2.56=4.491.33mS

表4　角堇和大花三色堇核型分析

從染色體結(jié)構(gòu)特征來看，6份材料均具有中部染色體(m)、近中部染色體(sm)和近端部染色體(st)，染色體長度比范圍為2.08～3.66，其中JB-1-1-2的最小，JP-1-1-2的最大2份角堇的染色體平均臂比范圍為2.40～2.36，核不對稱系數(shù)范圍為67.20%～70.10%，核型分類均為3B型；4份大花三色堇染色體平均臂比范圍為2.05～2.57，核不對稱系數(shù)范圍為66.74%～71.77%，核型分類(表4)分別為2B(EYO-1-2-1-4、DSRFY-1-1-2)和3B(G10-1-3-1-4、XXL-YB-1-1-1-1)。

3　討　論

染色體數(shù)目及特征是重要的生物學(xué)數(shù)據(jù)，同一物種或品種的染色體數(shù)目比較恒定，對闡述植物進(jìn)化程度和分類方面有重要意義[11]。目前普遍認(rèn)為大花三色堇(Violawittrockiana)，為美麗堇菜科亞屬園藝雜交種，由原種黃堇(V.lutea)、原種三色堇(V.tricolor)和開藍(lán)色花阿爾泰堇菜(V.altaica)種間多年雜交而來。其中三色堇染色體基數(shù)為x=13，黃堇的染色體基數(shù)為x=24，阿爾泰堇菜染色體基數(shù)為x=11。由于參與雜交的野生種染色體基數(shù)不一，大花三色堇的染色體數(shù)目及倍性呈現(xiàn)一定的復(fù)雜性[12]，本研究所用的4份大花三色堇材料，其中2份為48條，2份為44條，也證明了大花三色堇染色體數(shù)目的差異性。本研究結(jié)果顯示4份三色堇染色體基數(shù)分別為11，12條，均為四倍體材料，與穆金艷等[13]的研究結(jié)果相似；角堇的染色體數(shù)目穩(wěn)定，均為26條，染色體基數(shù)x=13，關(guān)于角堇的染色體數(shù)目還未見報(bào)道。三色堇的染色體數(shù)目為26條[14]，染色體基數(shù)為x=13，三色堇和角堇是一種什么樣的關(guān)系，還有待于進(jìn)一步研究。

Sebbins通過對植物核型資料的分析，將染色體核型按對稱性程度的高低分為12種類型(1A、2A、3A、4A；1B、2B、3B、4B；1C、2C、3C、4C)，認(rèn)為核型對稱性程度高的生物，其染色體變異越小，進(jìn)化程度也越低；對稱性程度越低的生物，其染色體變異也越大，進(jìn)化程度越高[15]。本研究角堇JB-1-1-2、JP-1-1-2的核型均為3B；大花三色堇G10-1-3-1-4、XXL-YB-1-1-1-1的核型為3B；EYO-1-2-1-4、DSRFY-1-1-2的核型為2B。說明2份角堇和2份染色體數(shù)目為48條的大花三色堇類型，進(jìn)化程度低于染色體數(shù)為44條的大花三色堇類型。

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