王若秋，趙　朋，王冬冬，王耀紅，陳　勤

(旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室 西北農林科技大學 農學院，陜西楊陵 712100)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界四大糧食作物之一，也是菜、飼和工業(yè)原料兼用作物。由于馬鈴薯營養(yǎng)豐富，糧菜兼用，含有豐富的維生素及鈣、鉀等微量元素，且易于消化吸收，老少皆宜，功能齊全，頗受人們稱贊。有的稱譽它為“第二面包”，有的贊揚它是“植物之王”[1]。在歐美國家特別是北美，馬鈴薯早就成為第二主食。2015年1月中國農業(yè)部發(fā)布消息稱將推動馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略[2]。馬鈴薯相比三大主糧的優(yōu)勢在于，種植周期短、產量高[3]。與普通馬鈴薯相比，彩色馬鈴薯含有較多的花青素、多酚、類黃酮等抗氧化活性物質，具有較高的營養(yǎng)價值和保健作用[4]。彩色馬鈴薯含有多種花青素，使其抗氧化活性達到普通馬鈴薯的2～3倍[5]。因此，彩色馬鈴薯的培育及保健作用研究成為當前科研熱點。

彩色馬鈴薯培育中，利用親緣關系較遠的彩色馬鈴薯彼此雜交，發(fā)揮雜種優(yōu)勢，有利于培育色素含量更高的新品種。然而，中國馬鈴薯品種鑒定一般基于傳統(tǒng)的形態(tài)學特征，如塊莖性狀、葉型、花色等[6]，這些性狀容易受環(huán)境條件影響,并且對植物及塊莖成熟度等都有一定的要求[7]。如何快速準確鑒別彩色馬鈴薯品種，選配優(yōu)良雜交親本組合培育新品種，已成為當前馬鈴薯育種工作中急需解決的問題。SSR分子標記克服了形態(tài)標記的不足，擴增結果穩(wěn)定、檢測手段簡便易行，與RFLP等其它分子標記相比，具有基因組間分布廣、共顯性、多態(tài)性高、重復性好、擴增結果穩(wěn)定及操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于植物親緣關系分析、指紋圖譜構建等方面。王紹鵬等[8]利用4對引物對黑龍江省7個主栽品種進行SSR標記，通過相似度分析區(qū)分出6個馬鈴薯品種。段艷鳳等[9]利用SSR標記構建了中國在2000～2007年之間審定的88個馬鈴薯品種的指紋圖譜并進行了遺傳多樣性分析，聚類分析結果與供試材料系譜來源具有較好一致性，同一栽培區(qū)域育成的品種在不同程度上聚在一類。張自強等[10]從90對SSR引物中篩選出10對多態(tài)性好、重復性強的引物將36個馬鈴薯品種劃分成7類，從DNA分子水平揭示出各供試品種間的親緣關系。目前，國內彩色馬鈴薯品種并不豐富，因此關于彩色馬鈴薯種質資源遺傳多樣性的報道仍比較少見。

本研究旨在利用SSR分子標記技術，對33份彩色馬鈴薯種質材料進行遺傳多樣性分析，構建分子標記指紋圖譜，為彩色馬鈴薯新品種的選育提供科學指導并為彩色馬鈴薯種質資源的快速鑒定提供技術依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　試驗材料

試驗選用33份國外引進和西北農林科技大學馬鈴薯課題研究組自主培育的彩色馬鈴薯品種(系)進行遺傳多樣性分析，各品種(系)薯皮和薯肉顏色見圖1和表1。

圖1　部分彩色馬鈴薯原原種塊莖Fig.1　Tuber traits of some pigmented potato varieties

編號Number材料Material薯皮顏色Potatoskincolor薯肉顏色Fleshcolor編號Number材料Material薯皮顏色Potatoskincolor薯肉顏色Fleshcolor1CQP46白White白White18CPW19紅Red紅Red2CQP67紫Purple淺紫Lightpurple19CPW199紫Purple紫Purple3CQP69紅Red紅Red20CPW2紫Purple花紫Whiteandpurple4CQP70紫Purple紫Purple21CPW29紅Red紅Red5CQP71淺紅Lightred黃Yellow22CPW35淺紫Lightpurple淡紅Aarnation6CQP72紫Purple紫Purple23CPW36淺紫Lightpurple淡紅Aarnation7CQP75紅Red白White24CPW37紅紫Reddishviolet紅紫Reddishviolet8CQP77紫Purple紫Purple25CPW38淺紫Lightpurple淡紅Aarnation9CQP82黃Yellow黃Yellow26CPW45紅Red紅Red10CQP85紅紫Reddishviolet紅Red27CPW47紫Purple紫Purple11CPW10紫Purple紫Purple28CPW48紫Purple紫Purple12CPW100紫Purple花紫Whiteandpurple29CPW55紫Purple紫Purple13CPW11紫Purple紫Purple30CPW6紅紫Reddishviolet紅紫Reddishviolet14CPW12紅Red紅Red31CPW8紫Purple紫Purple15CPW14紅Red紅Red32CPW84淺紫Lightpurple淺紫Lightpurple16CPW15紅Red紅Red33CPW99紫Purple紫Purple17CPW16紅Red紅Red

1.2　馬鈴薯DNA提取

取苗期馬鈴薯植株幼嫩、健壯且新鮮的葉片，置于保鮮袋中在液氮中速凍，于-80℃低溫冰箱保存，用于基因組DNA的提取。采用CTAB小量法[11]提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，微量分光光度計NanoDrop 2000測定提取DNA濃度，然后將樣品稀釋為100 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3　SSR 標記分析

本試驗參考其他相關研究文獻[12]，選擇了馬鈴薯染色體組上的22個SSR標記，引物序列等相關信息見表2。引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

擴增反應體系為15 μL：ddH2O為4.50 μL，2×Es Taq MasterMix(Dye)為7.50 μL，10 μmol/L正向引物為0.75 μL，10 μmol/L反向引物為0.75 μL，DNA模板為1.50 μL。

擴增反應程序：94 ℃模板預變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，重復30個循環(huán)；72 ℃終延伸2 min，4 ℃保存。PCR產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳結束后用硝酸銀染色觀察結果[13]。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計及聚類分析

根據(jù) SSR位點上銀染帶型的有無，轉換為二進制數(shù)據(jù)，有條帶的賦值為“1”，無條帶的賦值為“0”。利用NTSYS-pc 2.10軟件分析試驗材料的遺傳多樣性。其中，以Qualitiative data模塊計算試驗材料間的遺傳相似系數(shù)，SAHN模塊采用非加權類平均法(UPGMA)進行聚類分析，Tree plot模塊用于繪制樹狀聚類圖。

多態(tài)信息量(Polymorphism information content，PIC)的計算依照公式[14]PIC= 1-∑Pi2，表征SSR標記多態(tài)性信息含量(遺傳多樣性指數(shù))。對某一特定SSR標記引物擴增出的多態(tài)性片段，Pi為第 i 個等位基因在所有品種中出現(xiàn)的頻率。

2　結果與分析

2.1　DNA提取結果

將33份彩色馬鈴薯品種(系)提取的DNA各取5 μL，分別與1 μL Loading buffer混勻，用 1%瓊脂糖凝膠，120 V電壓，電泳30 min，用紫外凝膠成像儀觀察電泳結果。從電泳結果(圖2)可以看出，本試驗所提取的馬鈴薯DNA，電泳條帶清晰無拖尾，只有1條帶，片段大亮度高，說明提取的基因組DNA沒有降解，濃度較高。經微量分光光度計測定，DNA濃度多在800～1 000 ng/μL之間，在質量與數(shù)量上均滿足后續(xù)試驗要求。

表2　SSR標記引物名稱及序列

M. DL500圖2　馬鈴薯基因組DNA瓊脂糖電泳Fig.2　Agarose electrophoresis of potato genome DNA

2.2　SSR標記多態(tài)性分析

試驗采用22對SSR標記引物(表2)，對33份彩色馬鈴薯材料進行PCR擴增，結果如表3所示。

由表3可知，22對引物組合共檢測到95個等位位點，其中82個為多態(tài)性位點，多態(tài)性比率達86.31%，并且DNA片段的長度多在50～400 bp之間，表明供試材料的SSR多態(tài)性豐富。每對引物擴增出的等位位點數(shù)為1～12個，平均每對引物擴增出的等位位點數(shù)為4.31個。其中，引物STI005多態(tài)性條帶最多，為12條；引物STM1053多態(tài)性條帶最少，僅有1條。多態(tài)信息量(PIC)為0.168 7(STM1053)～0.991 9(STI033)，平均為0.841 1。圖3為引物STM2022在部分彩色馬鈴薯材料中的擴增結果。

2.3　彩色馬鈴薯親緣關系聚類分析

由表4可知，33份彩色馬鈴薯材料之間遺傳相似系數(shù)在0.53～0.91之間。其中，CPW15與CPW16遺傳相似系數(shù)最大，為0.91，CQP75與CPW100遺傳相似系數(shù)最小，為0.53。

按照UPGMA方法進行聚類分析[15],得到33份供試材料的遺傳關系聚類圖(圖4)。通過共表型相關(cophenetic correlation)分析得出相關性系數(shù)(r)為0.72，說明聚類結果較好。在相似系數(shù)0.71處，33份供試材料分為4個主要聚類群。其中，類群Ⅰ包括7個材料，4個材料為紅紫色薯皮紅紫色薯肉，其余3個都是淺紫色或淡紅色馬鈴薯品種(系)；類群Ⅱ最大，包括17個材料，除CQP71為淺紅色薯皮黃色薯肉之外，其余材料均為紫色或紅色馬鈴薯品種(系)；類群Ⅲ包括7個材料，4個材料為均紫色或淺紫色馬鈴薯品種(系)，CQP46和CQP75為白色薯肉，CQP82薯皮薯肉均為黃色；類群Ⅳ只有CPW2和CPW100，均是花紫色馬鈴薯(花紫色是指薯肉白紫相間)。

表3　SSR標記擴增結果

2.4　指紋圖譜分析

依據(jù)22對引物擴增條帶的統(tǒng)計分析，綜合考慮條帶讀取難易程度[16]、重復性高低、多態(tài)性信息含量等[17]，篩選出STM0031、STM0030、STI014、STM1029、STI001共5對引物用于構建33份彩色馬鈴薯材料的分子標記指紋圖譜。STM0031擴增出的條帶大小分別是210、195、175和120 bp；STM0030擴增出的條帶大小分別是160、140和133 bp；STI014擴增出的條帶大小分別是140、132、120 和113 bp；STM1029擴增出的條帶大小分別是170和160 bp；STI001擴增出的條帶大小分別是240、230、210、198、194和189 bp。這5對引物在所有供試材料中可檢測到19個等位位點，多態(tài)性等位位點達18個，平均每對引物可以檢測出3.6個等位位點。利用這5對引物，可以完全區(qū)分33份供試彩色馬鈴薯材料(表5)。

相似系數(shù) Similarity coefficient圖4　彩色馬鈴薯遺傳關系聚類圖Fig.4　Genetic clustering tree map of pigmented potato

M.DL500；1～23分別為馬鈴薯品種CQP46、CQP67、CQP69、CQP70、CQP71、CQP72、CQP75、CQP77、CQP82、CQP85、CPW10、CPW100、CPW11、CPW12、CPW14、CPW15、CPW16、CPW19、CPW199、CPW2、CPW29、CPW35、CPW36 圖3　引物STM2022擴增結果M. DL500; 1 to 23 are CQP46, CQP67, CQP69, CQP70, CQP71, CQP72, CQP75, CQP77, CQP82, CQP85, CPW10, CPW100, CPW11, CPW12, CPW14, CPW15, CPW16, CPW19, CPW199, CPW2, CPW29 , CPW35, CPW36Fig.3　Amplification results of primer STM2022

表5　彩色馬鈴薯基因型指紋圖譜

品種(系)Variety(line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

注：0表示該位點處無條帶，1表示該位點處有條帶

Note: 0 means there is no band at this locus, while 1 means there is a band at this locus

3　討　論

目前，馬鈴薯育種仍以品種間雜交為主，親本的選配顯得尤為重要[18]，既需要親本攜帶目標性狀或目的基因，又需要擴大親本間的遺傳差異。不同種質資源親緣關系分析和指紋圖譜的構建，對于雜交育種中優(yōu)良親本組合的選配及品種的快速鑒定具有重要的意義。而分子標記技術可以不受組織發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響[19]，從DNA水平上區(qū)分不同品種間的遺傳差異，穩(wěn)定可靠。為更好研究彩色馬鈴薯遺傳多樣性、為彩色馬鈴薯資源鑒定和利用提供依據(jù)[20]，本次研究中選用了33個表型有顯著差異的馬鈴薯,利用22對引物進行親緣關系的分析。結果表明33個馬鈴薯品種的遺傳關系差異較大，可分為4個類群。其中，類群Ⅰ的7個材料均為(紅)紫色薯皮(紅)紫色薯肉；類群Ⅱ的17個材料，除CQP71為淺紅色薯皮黃色薯肉之外，其余16個材料均為紫色或紅色馬鈴薯品種(系)；類群Ⅳ只有2個材料CPW2和CPW100，均是花紫色馬鈴薯。上述結果說明3個類群內彩色馬鈴薯間的親緣關系比較接近，遺傳背景差異小，遺傳多樣性水平低，可能與雜交育種的親本單一有關。因此在選擇雜交親本時，在滿足育種目標的同時應充分考慮其遺傳差異。類群Ⅲ包括7個材料，其中4個材料為(淺)紫色馬鈴薯品種(系)，2個材料為白色薯肉，CQP82薯皮薯肉均為黃色。從親緣關系來看，它們的遺傳基礎較為相似，可能由于控制色素合成的基因差異較大，所以薯皮薯肉顏色并不一致。

本研究利用22對引物將33個供試材料在相似系數(shù)0.71處分為4個類群。石景等[15]用56對SSR引物分析了55份彩色馬鈴薯供試材料，在相似系數(shù)0.63處可將全部材料分為三大類。段艷鳳等[9]用10對SSR引物分析了88個馬鈴薯審定品種的親緣關系并構建了指紋圖譜，在相似系數(shù)0.652處，81.8%的材料仍聚類在一組，說明供試材料遺傳基礎非常狹窄。李先平等[21]用41個SSR標記檢測了30份彩色馬鈴薯材料的親緣關系，供試材料分為兩大類群。上述研究結果與本研究結果較為一致，馬鈴薯品種(系)遺傳類群較少，表明中國目前的馬鈴薯品種及種質資源遺傳背景相近，遺傳基礎組成較為狹窄。

本研究所用彩色馬鈴薯材料表現(xiàn)出相對較大的遺傳基礎差異，這可能得益于部分國外新引進種質資源，提高了彩色馬鈴薯的遺傳多樣性。雖然供試材料在4個主要聚類群之間表現(xiàn)出較大遺傳差異，但是每個類群之內遺傳基礎比較狹窄。因此，在彩色馬鈴薯新品種選育中，應選擇遺傳差異豐富的種質資源進行雜交，以拓寬遺傳基礎，提高彩色馬鈴薯品種營養(yǎng)性的同時增強其對環(huán)境脅迫的抵御能力[22-23]。通過對這33份彩色馬鈴薯材料的遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建，將有助于提高彩色馬鈴薯新品種選育效率。

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