高國日，張　彤，陳道國，何彩云,2*

(1 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091；2 南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037)

沙棘(Hippophaerhamnoides)是一種多用途、耐寒和耐旱的落葉灌木植物，也是一種理想的防治水土流失的樹種，能夠有效改良荒漠化土地，增加野生動物棲息地和保護農(nóng)莊等[1]。沙棘的果肉可以被制成沙棘汁，是一種具有很高營養(yǎng)價值的飲料，含有豐富的維生素C～E和胡蘿卜素等生物活性成分。沙棘油提取于沙棘的種子，富含不飽和脂肪酸[2]。沙棘果實中豐富的營養(yǎng)物質能夠調節(jié)人體免疫力、保護肝臟、抗輻射、預防動脈硬化、抗腫瘤以及促進組織再生等。因其生態(tài)價值、藥用價值和經(jīng)濟價值，沙棘被認為是一種重要的植物[3]。近年來，對沙棘分子生物學的研究，不僅獲得了可用于沙棘基因組分析、分子繁殖和群體遺傳分析的大量簡單重復序列(SSR)[4]及表達序列標簽(EST)[5]，還獲得了響應冷凍[6-7]和干旱脅迫[8]的大量基因和蛋白質表達[9]信息，確定了其在響應低溫和干旱中的生物學功能，在沙棘發(fā)育不同時期代謝組和蛋白組聯(lián)合分析中，深入了解了沙棘果實獨特營養(yǎng)成分形成機理[10-11]。雖然不同沙棘果色的lncRNA研究[12]為研究表觀遺傳對沙棘基因的表達調控提供了思路，但是表觀遺傳學中組蛋白修飾因其修飾類型和位點的復雜性，對基因表達的調控同樣具有重要的作用[13]。許多研究已經(jīng)表明組蛋白乙?；揎棌V泛參與植物的生長發(fā)育過程[14]及應對外界環(huán)境變化[15]。染色質免疫共沉淀技術(ChIP)是研究生物體內蛋白質與DNA相互作用的有效方法，通常用于組蛋白修飾類型和轉錄因子結合位點的研究，與二代測序相結合的ChIP-seq技術，能夠高效準確的在全基因組范圍內檢測組蛋白修飾與轉錄因子所調控的DNA區(qū)域[16-17]。當前對擬南芥、水稻等組蛋白修飾和轉錄因子所調控的基因進行了大量的研究，其中組蛋白H3K9ac修飾在植物逆境脅迫及生長周期中，具有重要的作用[18]。并且由于組蛋白的保守性和調控基因的廣泛性，非常適合推廣至其他物種的表觀遺傳研究，2014年Li等[19]優(yōu)化了研究毛果楊表觀遺傳的試驗過程，闡明了木質部形成與組蛋白修飾的關系。

雖然研究沙棘組蛋白修飾對沙棘基因的表達調控方式，能夠闡明沙棘在生長周期和逆境脅迫下基因表達的調控機制[20]，但是使用商業(yè)抗體研究沙棘組蛋白修飾尚未見報道。本研究通過蛋白質印跡法(Western blot)驗證H3K9ac抗體與沙棘組蛋白的結合能力，并使用抗體進行后續(xù)的ChIP試驗。對富集到的沙棘DNA片段進行高通量測序，從而繪制沙棘H3K9乙?；揎棃D譜并鑒定出沙棘H3K9乙?；揎椪{控基因，為后續(xù)研究組蛋白修飾對沙棘基因表達的調控方式奠定基礎。

1　材料和方法

1.1　試驗材料

本試驗使用的材料為中國沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp.sinensis)，采自中國林業(yè)科學研究院科研溫室大棚，生長條件為自然光照，晝/夜溫度為20～30 ℃/10～15 ℃，相對濕度在60%～70%。所使用的H3K9ac(ab10812)抗體購買于美國Abcam公司。

1.2　試驗方法

1.2.1染色質免疫共沉淀技術DNA片段富集和蛋白質印跡法檢測取沙棘葉片2 g，剪碎并浸沒在甲醛交聯(lián)緩沖液中，抽真空處理。加入甘氨酸后，終止交聯(lián)，取出樣品，洗滌并吸干表明水分。液氮研磨至粉末狀，多次抽提、過濾去除雜質，最終重新懸浮。預留出部分樣品后，加入核酸裂解緩沖液，置冰上裂解。對交聯(lián)成的DNA-蛋白質復合物超聲波片段化。取一部分進行Western blot試驗，具體步驟為：配制分離膠和濃縮膠，加樣前將梳子拔出，每個點樣孔上樣不超過7.5 μL。濃縮膠在80 V，分離膠在160 V下電泳，在電泳過程中裁剪PVDF膜并進行處理。電泳結束，撬去玻璃板，將濃縮膠輕輕刮去，將分離膠卸下。將分離膠鋪在電轉架上，再鋪上浸好的PVDF膜，裝好板，加入電轉液和冰塊，100 V轉膜80 min。電轉后的膜用1×TBST漂洗5 min，置于封閉液中，4 ℃過夜。分別加入一抗(H3K9ac)，用封閉液稀釋，室溫震蕩混勻2 h。1×TBST洗膜4×5 min，孵二抗(HRP-羊抗兔)，室溫搖床孵育2 h。用1×TBST洗膜3×10 min，用吸紙吸去多余水分，將ELC顯色反應液加在膜上，使反應液分布均勻后，吸去邊緣多余反應液，放到顯色器中，觀察顯色效果并拍照保存。

取另一部分進行解交聯(lián)純化及瓊脂糖凝膠電泳檢測。加入目的蛋白抗體，形成抗體-組蛋白-DNA復合物，利用Protein A beads沉淀該復合物，特異性富集與目的組蛋白結合的DNA片段，多次洗滌，去除非特異性DNA片段，純化復合體，解交聯(lián)，利用DNA純化試劑盒純化DNA片段[21,22]。用Qubit檢測DNA片段的濃度，并保存于-80 ℃。

1.2.2高通量測序及數(shù)據(jù)分析將ChIP試驗所得DNA片段利用Ovation Ultralow Library kit (NuGEN, Part No. 0330) 建立ChIP文庫，然后使用HiSeq 2000(Illumina)對DNA片段進行測序。通過trim方式對原始數(shù)據(jù)的質量進行檢測，去掉低質量的數(shù)據(jù)，獲得clean reads 用于后續(xù)分析。利用Burrows Wheeler Aligner(BWA) 將樣本的clean reads 匹配到參考基因組上以及進行定位質量分析和mapping效率的分析。將mapping后唯一匹配的unique reads 通過MACS2(q-value≤0.05)[23]完成峰檢分析，預測富集區(qū)域的峰即為組蛋白修飾的區(qū)域。然后與基因組上基因的位置進行重疊分析，包含有峰的基因就確定為該基因具有組蛋白修飾。通過GOseq R數(shù)據(jù)包和KOBAS軟件對基因進行GO功能分析和KEGG通路分析。

2　結果和分析

2.1　DNA片段化、H3K9ac抗體與復合物的結合特性以及片段富集

將交聯(lián)后的DNA片段化，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示，3個沙棘片段化DNA與片段化前各樣本主帶明顯，片段化DNA明顯分布于100～500 bp之間，效果較好，可進行下一步純化、富集實驗。經(jīng)Western blot檢測， H3K9ac抗體與復合物的結合特性如圖2所示，該抗體與復合物結合能力較強，在15～17kDa處有明顯的陽性條帶出現(xiàn)。用H3K9ac抗體對沙棘片段化DNA進行富集，解交聯(lián)，最終獲得的DNA濃度為0.845 ng/μL，是陽性對照input DNA濃度的13.63%(表1)。陰性對照IgG富集的DNA濃度太低，沒有檢測到數(shù)值(表1)。

2.2　沙棘H3K9ac修飾的全基因組分析

2.2.1ChIP-seq測序數(shù)據(jù)及基因組分布將構建的IP和Input文庫進行高通量測序，最終分別得到6G和10G的數(shù)據(jù)量，分別包含約2.2×107條和3.6×107條原始序列(圖3)。將原始序列經(jīng)過質量檢測去除低質量序列后得到分析序列，其中分析序列占原始序列的99%以上。將分析序列與自測沙棘參考基因組進行比對，2個樣本分析序列定位到基因組上序列的百分比均在35%以上。唯一定位的測序序列占定位到基因組上序列的80%左右。對唯一比對序列比對到基因組的各條染色體上的密度進行統(tǒng)計，結果如圖4所示，序列在各條染色體上均有分布，并且在染色體上的不同區(qū)域富集程度不同。序列相對于基因位置分布表明序列在結構基因中的分布要高于基因上下游部分，并且在結構基因中的兩端具有明顯的富集(圖5)。

M. DNA分子標量；CK-1、CK-2、CK-3.3個生物學重復圖1　沙棘DNA片段化結果M.DNA Marker；CK-1，CK-2,CK-3.Three biological repeats Fig.1　The results of DNA fragment of H. rhamnoides

圖2　H3K9ac與復合物結合特性Fig.2　The binding specificity of histone with H3K9ac antibody

樣品名稱Samplename試驗用量Dosage/μL濃度Content/(ng/μL)溶解體積Volume/μLInputCK206.2012IPCK-1(H3K9ac)200.8914IPCK-2(H3K9ac)200.8014IPCK-3(IgG)20low13

圖3　測序數(shù)據(jù)及與參考基因組序列的比對統(tǒng)計Fig.3　The statistics of sequencing data and mapping with reference genome

2.2.2富集區(qū)域峰的預測及基因注釋對mapping到參考基因組上的unique reads的富集區(qū)進行峰(peak)的預測，每個peak代表一個H3K9ac的修飾位點。共預測出1 011個peak，長度為147 bp，peak中所包含的reads的個數(shù)占所有比對上的reads的20.83%。Peak在染色體上的分布如圖6所示。從圖6可以看出，H3K9ac修飾位點在不同染色體上均勻分布。對修飾基因進行GO功能注釋，包含基因數(shù)最多的前30類結果如圖7所示，H3K9ac修飾可以調控的基因功能包括了生物學過程(17類)、分子功能(5類)和細胞組成(8類)，其中，在生物學過程分類中，包含基因數(shù)最多的是細胞生理過程和細胞生長中代謝過程，在細胞組成中，膜質和細胞分類中擁有的基因數(shù)最多，分子功能中結合作用占有最大比例。KEGG通路分析結果表明，基因在50個代謝通路中得到注釋，包含基因數(shù)最多的主要有：代謝途徑、氧化磷酸化和次級代謝物的合成。這些過程為研究H3K9ac修飾所調控基因的功能提供了新的信息。

圖4　IP的reads在基因組上的分布Fig.4　The distribution of reads of IP in genome

圖5　IP的reads相對基因位置的分布Fig.5　The distribution of reads of IP in relative genetic location

圖6　Peak在染色體上的分布Fig.6　The distribution of peak on chromosome

1.細胞過程；2.代謝過程；3.有機物代謝過程；4.初級代謝過程；5.單個組織過程；6.細胞代謝過程；7.單個組織細胞過程；8.高分子代謝過程；9.細胞高分子代謝過程；10.氮化合物代謝過程；11.細胞氮化合物代謝過程；12.單生物代謝過程；13.生物合成過程；14.雜環(huán)代謝過程；15.細胞生物合成過程；16.有機環(huán)狀化合物合成代謝過程；17.有機物生物合成過程；18.細胞膜；19.細胞；20.細胞部分；21.胞內部分；22.胞內；23.結合；24.催化活性；25.有機環(huán)狀化合物結合；26.雜環(huán)化合物結合；27.離子結合；28.蛋白結合；29.核酸結合；30.水解酶活性圖7　GO功能富集分布圖1.Cellular process；2.Metabolic process；3.Organic substance metabolic process；4.Primary metabolic process；5.Single-organism process；6.Cellular metabolic process；7.Single-organism cellular process；8.Macromolecule metabolic process；9.Cellular macromolecule metabolic process；10.Nitrogen compound metabolic process；11.Cellular nitrogen compound metabolic process；12.Single-organism metabolic process；13.Biosynthetic process；14.Heterocycle metabolic process；15.Cellular biosynthetic process；16.Organic cyclic compound metabolic process；17.Organic substance biosynthetic process；18.Membrane；19.Cell；20.Cell part；21.Intracellular part；22.Intracellular；23.Binding；24.Catalytic activity；25.Organic cyclic compound binding；26.Heterocyclic compound binding；27.Ion binding；28.Protein binding；29.Nucleic acid binding；30.Hydrolase activityFig.7　The distribution of GO function

通路名稱Pathwayname基因數(shù)Genenumber通路名稱Pathwayname基因數(shù)Genenumber新陳代謝通路Metabolicpathways23核黃素代謝Riboflavinmetabolism1氧化磷酸化Oxidativephosphorylation9丁酸甲酯代謝Butanoatemetabolism1次生代謝物合成Biosynthesisofsecondarymetabo-lites9?；撬岷蛠喤；撬岽xTaurineandhypotaurinemetabolism 1RNA轉運RNAtransport4錯配修復Mismatchrepair1淀粉和蔗糖代謝Starchandsucrosemetabolism4玉米素合成Zeatinbiosynthesis1果糖和甘露糖代謝Fructoseandmannosemetabo-lism3纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成Valine,leu-cineandisoleucinebiosynthesis1核苷酸切除修復Nucleotideexcisionrepair3丙胺酸代謝beta-Alaninemetabolism1丙酮酸代謝Pyruvatemetabolism3維生素C代謝Ascorbateandaldaratemetabolism1糖酵解/糖異生途徑Glycolysis/Gluconeogenesis3堿基切除修復Baseexcisionrepair1氨基糖和核苷酸糖代謝Aminosugarandnucleo-tidesugarmetabolism3丙三酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝Alanine,aspartateandglutamatemetabolism1胞吞作用Endocytosis3DNA復制DNAreplication1內質網(wǎng)蛋白加工Proteinprocessinginendoplasmicreticulum 3二羧酸代謝Glyoxylateanddicarboxylatemetabo-lism1碳代謝Carbonmetabolism3蛋白質運輸Proteinexport1磷酸戊糖途徑Pentosephosphatepathway2甘油酯代謝Glycerolipidmetabolism1半乳糖代謝Galactosemetabolism2核糖體Ribosome1同源重組Homologousrecombination22-氧代羧酸代謝2-Oxocarboxylicacidmetabolism1蛋白酶體Proteasome2精氨酸和脯氨酸代謝Arginineandprolinemetabo-lism1光和生物的碳固定Carbonfixationinphotosyn-theticorganisms2戊糖和葡萄糖醛酸轉換Pentoseandglucuronateinterconversions 1光合作用Photosynthesis2半胱氨酸和甲硫氨酸代謝Cysteineandmethioninemetabolism 1谷胱甘肽代謝Glutathionemetabolism2植物病原菌互作Plant-pathogeninteraction1RNA降解RNAdegradation2嘧啶代謝Pyrimidinemetabolism1mRNA監(jiān)測途徑mRNAsurveillancepathway2嘌呤代謝Purinemetabolism1泛素介導的蛋白水解作用Ubiquitinmediatedpro-teolysis2真核細胞核小體合成Ribosomebiogenesisineu-karyotes1氨基酸生物合成Biosynthesisofaminoacids2剪接體Spliceosome1植物信號激素轉導Planthormonesignaltransduc-tion2甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝Glycine,serineandthreoninemetabolism1

3　討　論

動植物在不同的進化中，組蛋白的氨基酸序列非常保守，即使存在較遠親緣關系，4種組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)氨基酸序列都非常相似[24]。所以，可以使用同一種抗體研究不同物種的組蛋白修飾。但是，不同物種間的組蛋白還是存在微小的空間結構差異，所以同一抗體對不同物種組蛋白的結合能力會有所差別[25]。對沙棘染色質進行超聲波破碎后，片段大小集中在100～500 bp，說明該試驗條件的適用性。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)H3K9ac抗體與沙棘片段化染色質具有較強的結合能力，可以用于后續(xù)的富集試驗。用H3K9ac抗體對沙棘片段化DNA進行富集，最終富集得到的DNA濃度為0.845 ng/μL，僅為陽性對照Input DNA濃度的13.63%，低于對擬南芥[21]、毛果楊所報道的濃度[19]，原因可能是抗體與沙棘組蛋白的結合能力有限。通過陰性對照IgG可以確定抗體與組蛋白的特異性良好。DNA片段富集濃度低的原因可能是試驗過程中的試驗條件并不是最優(yōu)方案，所選用抗體存在物種差異，或者是沙棘中H3K9ac修飾密度低于擬南芥和毛果楊等，可以通過改進試驗方案或定制抗體來提高富集濃度，進一步進行驗證。

ChIP-seq獲得的數(shù)據(jù)，在經(jīng)過一系列的質量檢測和篩選后，clean reads將被用于后續(xù)的分析。由于ChIP獲得的是DNA片段，其所測定的序列與參考的基因組的mapping率應該在70%以上[26-27]，但是，在本研究中2個樣本的mapping率只有35%，造成該現(xiàn)象的原因可能是因為自測基因組中含有大量的重復序列，確切的結論還需要在進一步完善沙棘基因組后才能獲得。Reads在染色體上分布廣泛，更加證明了組蛋白H3K9ac修飾對于沙棘基因的表達具有廣泛的調控作用[28]，reads相對基因位置的分析表明，H3K9ac對于沙棘基因的調控主要發(fā)生在結構基因的兩端。由于染色體被超聲波隨機打斷，所以在通過特異抗體富集后，片段之間的存在大量的重疊區(qū)域，為了更加準確分析基因功能，將reads富集區(qū)域稱為peak，即為DNA與相應組蛋白的結合位點。我們利用GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫，對peak所在區(qū)域的基因進行GO功能富集和KEGG通路分析，不僅可以預測基因功能，還可以研究基因在不同代謝通路中的位置和作用，通過注釋，準確獲得了H3K9ac修飾所能夠調節(jié)的基因功能，主要涉及到生物學過程中的細胞生理過程和細胞生長中代謝過程，細胞組成中的膜質和細胞分類，以及分子功能中小分子間有選擇性、非共價結合作用。在代謝途徑、氧化磷酸化和次級代謝物的合成通路中具有重要的作用。綜上所述，H3K9ac調控基因對于沙棘基因的正常表達具有重要的作用。

本研究通過western blot驗證了H3K9ac抗體與復合物具有較強的結合能力。沙棘片段化DNA的富集以及高通量測序證明了抗體能夠用于研究沙棘的組蛋白修飾類型，并且繪制了沙棘第一張H3K9ac修飾遺傳圖譜草圖和鑒定出沙棘H3K9ac修飾所調控基因，為今后研究組蛋白修飾對沙棘基因表達的調控方式奠定基礎。通過對試驗條件的優(yōu)化，提高抗體對組蛋白的捕獲效率，將會獲得更加完整的組蛋白修飾遺傳圖譜。

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