晁毛妮，張自陽，王潤豪，張金寶，王　果，黃中文

(河南科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

蔗糖是植物葉片光合作用的產(chǎn)物，其本身不能被植物利用，需要蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, SUS)分解后才能參與植物的各項(xiàng)代謝活動(dòng)[1-3]。作為調(diào)節(jié)植物蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，蔗糖合成酶的活性與棉花纖維的伸長[4]、水稻穎果的發(fā)育[5]、豆科植物氮的固定[6]以及植物對逆境脅迫的響應(yīng)[7]等生命活動(dòng)密切相關(guān)。鑒定和克隆植物的蔗糖合成酶基因?qū)τ谔岣咂洚a(chǎn)量及抗逆性等具有重要意義。

研究表明，植物的蔗糖合成酶是一個(gè)多基因編碼的家族，但是不同物種間SUS家族成員數(shù)量差別很大。玉米[8]和菜豆[9]的基因組中均鑒定到3個(gè)SUS基因；擬南芥[10]、水稻[11]和桃樹[12]的基因組中均鑒定到6個(gè)SUS基因；陸地棉[13]、大麥[14]、楊樹[15]和葡萄[16]的基因組中分別鑒定到15、4、7和5個(gè)SUS基因。盡管不同物種間SUS基因數(shù)量差別很大，蛋白序列卻高度保守，均具有蔗糖合成結(jié)構(gòu)域和糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域[10,15]。在表達(dá)上，植物SUS家族成員的表達(dá)具有組織特異性。例如，在水稻SUS家族中，OsSUS3和OsSUS4在穎果中表達(dá)量最高，OsSUS2在所有組織中均有較高的表達(dá)，它們具有不同的組織表達(dá)模式[17]；同樣地，豌豆SUS家族成員PsSUS1、PsSUS2和PsSUS3分別在種子、葉片和花中大量表達(dá)[9]。除了具有組織特異性，植物SUS家族成員的表達(dá)還受發(fā)育時(shí)期和逆境脅迫的影響。例如，陸地棉[18]和海島棉[19]纖維發(fā)育的不同階段分別由不同的SUS基因調(diào)控；擬南芥SUS家族成員AtSUS1基因的表達(dá)受冷和干旱脅迫誘導(dǎo)[10]等?？傊?，植物SUS家族成員不同的表達(dá)調(diào)控模式，暗示著它們在植物生長發(fā)育過程中可能行駛著不同的功能。

大豆是重要的經(jīng)濟(jì)作物，提高大豆產(chǎn)量一直是研究的熱點(diǎn)。研究表明，蔗糖合成酶對于光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累有著重要影響，在作物產(chǎn)量形成的過程中起著重要作用[20-21]。例如，在棉花中過表達(dá)馬鈴薯SUS基因，可顯著提高棉花的產(chǎn)量[21]，表明SUS基因在提高作物產(chǎn)量方面具有很大潛力。目前，已從陸地棉[13]、玉米[8]和水稻[11]等多種作物中對SUS基因家族進(jìn)行全基因組鑒定和功能研究，然而，大豆SUS基因家族的系統(tǒng)研究尚很少開展。本研究基于已公布的大豆基因組數(shù)據(jù)，對大豆SUS基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，并對其序列特征、進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)模式等進(jìn)行了全面分析。研究結(jié)果為今后深入研究該家族基因的生物學(xué)功能及大豆產(chǎn)量的提高奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　大豆蔗糖合成酶基因家族的全基因組鑒定

于Phytozome網(wǎng)站(http://www.phytozome.net/)[22]下載大豆基因組數(shù)據(jù)，并建立本地Blast數(shù)據(jù)庫。從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥蔗糖合成酶基因家族(AtSUS1～AtSUS6)的蛋白序列，其基因ID號(hào)分別為At5g20830、At5g49190、At4g02280、At3g43190、At5g37180和At1g73370。以擬南芥SUS家族成員的蛋白序列作為查詢序列，運(yùn)行Blastp檢索程序，篩選閾值設(shè)置為1e-10，初步獲得大豆SUS基因家族的候選基因。接著將這些候選基因的蛋白序列提交到Pfam數(shù)據(jù)庫[23]進(jìn)行進(jìn)一步的蔗糖合成結(jié)構(gòu)域(PF00862)和糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(PF00534)驗(yàn)證，最終鑒定出大豆SUS家族成員。

1.2　蛋白特性和序列分析

利用Expasy在線網(wǎng)站(http://www.expasy.org)預(yù)測大豆SUS家族成員的分子量和等電點(diǎn)；蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測使用InterPro和Pfam數(shù)據(jù)庫在線完成；采用Bioedit7.0軟件完成蛋白序列一致性分析；利用ClustalX軟件默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行多重序列比對，比對后的序列用GeneDoc進(jìn)行編輯。

1.3　系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI網(wǎng)站下載用于進(jìn)化樹構(gòu)建的7個(gè)物種的蛋白序列；利用MEGA5.02軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[24]，其中校驗(yàn)參數(shù)bootstrap值設(shè)置為1 000次，距離模型設(shè)置為p-distance，空位缺失數(shù)據(jù)的處理設(shè)置為pairwise deletion。

1.4　基因結(jié)構(gòu)示意圖的繪制

從下載的大豆基因組數(shù)據(jù)中調(diào)取GmSUS基因的編碼區(qū)(CDS)序列和基因組序列。通過GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)在線工具繪制大豆SUS家族成員的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)示意圖。

1.5　染色體定位和基因復(fù)制分析

根據(jù)大豆基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.phytozome.net/)提供的每個(gè)基因在染色體上的位置信息，通過Maplnspect軟件繪制該基因的染色體分布圖。根據(jù)2個(gè)基因序列相互匹配部分的長度大于較長序列長度的80%，且相互匹配部分的相似性大于80%來判定基因復(fù)制事件；同時(shí)進(jìn)一步結(jié)合基因在染色體上的位置來確定基因復(fù)制的類別是串聯(lián)復(fù)制還是片段復(fù)制[25-26]。

1.6　基因表達(dá)特性分析

大豆SUS基因在根、莖、葉、花、莢、種子和根瘤組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)下載自Phyzotome網(wǎng)站(http://www.phy tozome.net/)。利用MeV4.9[27]軟件繪制基因表達(dá)的熱圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　大豆SUS家族成員的鑒定

通過Blastp分析，在大豆基因組中共鑒定到12個(gè)蔗糖合成酶基因，根據(jù)它們在染色體上的位置，本研究將其命名為GmSUS1～GmSUS12(表1)。12個(gè)GmSUS的基因組大小和CDS長度分別在5 184(GmSUS5)～7 720 bp(GmSUS8)和2 409(GmSUS8)～2 766 bp(GmSUS4)之間變化。對其編碼蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GmSUS蛋白的氨基酸長度從802 aa(GmSUS8)到921 aa(GmSUS4)不等；分子量從91.58 kD(GmSUS8)到104.16 kD(GmSUS4)不等；等電點(diǎn)從6.03(GmSUS2)到7.46(GmSUS7)不等，其中等電點(diǎn)小于7的蛋白比例達(dá)66.67%，表明大豆SUS蛋白主要是以弱酸性蛋白質(zhì)存在(表1)。

2.2　大豆SUS家族成員的蛋白序列分析

序列一致性分析表明，大豆SUS家族成員間蛋白序列一致性很高(表2)，一致性在46.60%～98.80%之間，其中GmSUS11和GmSUS6一致性最高(98.80%)，其次是GmSUS7和GmSUS1(97.50%)，GmSUS3和GmSUS5一致性最低(46.60%)。通過InterPro和Pfam工具進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)(表1，圖1)，大豆GmSUS蛋白均具有植物SUS家族成員特有的蔗糖合成結(jié)構(gòu)域(圖1，實(shí)線)和糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(圖1，虛線)，它們分別行駛著蔗糖合成和糖基化合物轉(zhuǎn)移的功能。另外，除GmSUS5外，大豆GmSUS蛋白N端均具有一個(gè)保守的絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)(圖1，箭頭)，該位點(diǎn)可被絲/蘇蛋白激酶磷酸化[28-29]。

2.3　大豆SUS家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

先前對植物SUS蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析可知，植物SUS家族成員在進(jìn)化上可聚為3組(SUS1、SUSA和New Group)[10-11]，后續(xù)的一些研究將這3組又分別命名為SUSⅠ、SUSⅡ和SUSⅢ，其中SUSI又分為單子葉組(Monocot SUSI)和雙子葉組(Dicot SUSI)[12,15,30]。為了了解大豆SUS家族基因在進(jìn)化上的位置及親緣關(guān)系，本研究構(gòu)建了大豆和其他7個(gè)物種SUS家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。圖2表明，大豆SUS家族基因可聚為3組，分別是SUSI的雙子葉組(Dicot SUSⅠ)、SUSⅡ和SUSⅢ；其中4個(gè)大豆SUS基因(GmSUS9、GmSUS3、GmSUS11和GmSUS6)分布在SUSⅠ組；3個(gè)大豆SUS基因(GmSUS2、GmSUS8和GmSUS12)分布在SUSⅡ組，5個(gè)大豆SUS基因(GmSUS1、GmSUS4、GmSUS5、GmSUS7和GmSUS10)分布在SUSⅢ組。另外，由圖2可知，雙子葉和單子葉植物的SUS家族成員在SUSⅠ～SUSⅢ內(nèi)均有分布，表明SUS家族基因的擴(kuò)增可能發(fā)生在單子葉和雙子葉植物分化之前。

2.4　大豆SUS家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析

已有研究表明，植物SUS基因家族的內(nèi)含子數(shù)目和基因結(jié)構(gòu)在不同物種間高度保守[31]。本研究對大豆的SUS家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖3)表明，12個(gè)GmSUS基因均含有內(nèi)含子，內(nèi)含子數(shù)目在11～14個(gè)之間。在SUSⅠ組中，除GmSUS9含有12個(gè)內(nèi)含子外，其余GmSUS基因均含有11個(gè)內(nèi)含子；SUSⅡ和SUSⅢ組的GmSUS基因均包含14個(gè)內(nèi)含子。另外，位于同一組的GmSUS基因大部分具有相似的內(nèi)含子/外顯子分布模式(圖3)。

2.5　大豆SUS家族成員的染色體分布

由圖4可以看出，12個(gè)GmSUS基因不均勻地分布在大豆的10條染色體上，其中第Chr02、Chr03、Chr11、Chr13、Chr14、Chr16、Chr17和Chr19號(hào)染色體各含1個(gè)GmSUS基因；第Chr09和Chr15號(hào)染色體各含2個(gè)GmSUS基因；其余各染色體不含GmSUS基因。進(jìn)一步基因復(fù)制分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員無串聯(lián)復(fù)制，存在11個(gè)片段復(fù)制(圖4)，表明片段復(fù)制可能導(dǎo)致了GmSUS基因在大豆基因組中的擴(kuò)增。

箭頭表示絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)；實(shí)線和虛線分別表示蔗糖合成結(jié)構(gòu)域和糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域圖1　大豆蔗糖合成酶基因家族氨基酸序列的多重比對The arrow indicates serine phosphorylation site. The solid and dotted lines indicate a sucrose synthase domain and a glycosyl transferase domain, respectivelyFig.1　Multi alignment of amino acid sequences of sucrose synthase gene family in soybean

大豆SUS蛋白用●標(biāo)記；分支上的數(shù)值表示bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)節(jié)點(diǎn)的可信度；擬南芥AtSUS1～SUS6(At5g20830，At5g49190，At4g02280，At3g43190，At5g37180和At1g73370)；豌豆PsSUS1～SUS4(AJ012080，AJ001071，AJ311496和AF079851)；蜜桔CuSUS1～SUS2，CuSUSA(AB022092，AB029401和AB022091)；楊樹PtrSUS1～SUS7(GU559729，GU559730，GU559731，GU559732，GU559733，GU559734和GU559735)；水稻OsSUS1～SUS6(Os03g0401300，Os06g0194900，Os07g0616800，Os03g0340500，Os04g0309600和Os02g0831500)；玉米ZmSUS1～SUS5(L29418，L22296，BT069288，NM_001111941和EU971052)；大麥HvSUS1～SUS2(X69931和Y15802)；GmSUS1～GmSUS12，本研究鑒定的12個(gè)大豆SUS蛋白圖2　大豆SUS蛋白與其他植物SUS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析SUS proteins in soybean was marked by a symbol ●. The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstrap values based on 1 000 replication. Arabidopsis thaliana, AtSUS1-SUS6 (At5g20830, At5g49190, At4g02280, At3g43190, At5g37180, At1g73370); Pisum sativum, PsSUS1-SUS4 (AJ012080, AJ001071, AJ311496, AF079851); Citrus unshiu, CuSUS1-SUS2 and CuSUSA (AB022092, AB029401, AB022091); Populus trichocarpa, PtrSUS1-SUS7 (GU559729, GU559730, GU559731, GU559732, GU559733, GU559734, GU559735); Oryza sativa, OsSUS1-SUS6 (Os03g0401300, Os06g0194900, Os07g0616800, Os03g0340500, Os04g0309600, Os02g0831500); Zea mays, ZmSUS1-SUS5 (L29418, L22296, BT069288, NM_001111941, EU971052); Hordeum vulgare, HvSUS1-SUS2(X69931, Y15802); GmSUS1-GmSUS12, 12 soybean SUS proteins identified in this studyFig.2　Phylogenetic relationships between the soybean SUS proteins and other plant SUS proteins

2.6　大豆SUS家族成員的組織表達(dá)特性分析

組織表達(dá)特性分析表明，大豆SUS家族成員具有不同的組織表達(dá)模式(圖5)。GmSUS8在大豆種子中表達(dá)量最高，其他組織表達(dá)量很低，表明其在大豆種子發(fā)育過程中可能起著重要作用。GmSUS1、GmSUS7和GmSUS5在大豆根瘤中表達(dá)量很高，其他組織表達(dá)量很低或者不表達(dá)，表明它們可能參與了大豆的根瘤固氮過程。GmSUS3、GmSUS11和GmSUS12在所有被檢測的組織均具有較高的表達(dá)，表明它們在大豆生長發(fā)育的多個(gè)過程中都起著重要作用。對不同表達(dá)特性GmSUS基因的進(jìn)化組分布情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，一些特異性表達(dá)的基因主要分布在SUSⅢ和SUSⅡ進(jìn)化組，包括SUSⅢ的全部基因和SUSⅡ的1個(gè)基因；另外一些非特異性表達(dá)的基因主要分布在SUSⅠ和SUSⅡ進(jìn)化組，包括SUSⅠ全部基因和SUSⅡ的2個(gè)基因(圖5)。

3　討　論

蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，而蔗糖合成酶是促使蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，在植物的生長發(fā)育過程中起著重要作用。鑒定和克隆植物的蔗糖合成酶基因是了解其生理功能和代謝機(jī)制的第一步。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，利用比較基因組學(xué)進(jìn)行基因家族分析已成為基因功能研究的前提?；谝褱y序的基因組數(shù)據(jù)，目前已從玉米[8]、水稻[11]和陸地棉[13]等多種作物中對蔗糖合成酶基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定，并發(fā)現(xiàn)其在作物生長和產(chǎn)量形成過程中起著重要的作用[20-21]。然而，目前還未對大豆SUS基因家族進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和研究。本研究在大豆基因組共鑒定到12個(gè)SUS基因家族成員，其數(shù)量是擬南芥[10]和水稻[11]SUS家族基因數(shù)量的2倍。與此相符的是，在大豆漫長的進(jìn)化過程中，曾經(jīng)歷了2次全基因組復(fù)制，分別發(fā)生在56.5～60.0 mya (百萬年前)和10～13 mya(百萬年前)[32]，而擬南芥和水稻只經(jīng)歷了1次基因組復(fù)制[33-34]。因此，在大豆基因組中，約75%的基因有2個(gè)或2個(gè)以上的拷貝[35]。本研究中大豆SUS家族基因成員較多，可能與大豆經(jīng)歷的2次全基因組復(fù)制事件有關(guān)。

許多研究表明，SUS家族基因的蛋白結(jié)構(gòu)及內(nèi)含子/外顯子特征在不同物種間高度保守[16,31,36-38]。在本研究中，大豆的SUS家族成員均具有蔗糖合成結(jié)構(gòu)域和糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域。除GmSUS5外，其他GmSUS蛋白N端均有一個(gè)保守的絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，這些蛋白特征與大多數(shù)植物SUS家族成員相似。已有研究表明，基因內(nèi)含子/外顯子特征可為基因進(jìn)化關(guān)系的研究提供有價(jià)值的信息[39-40]。本研究對大豆內(nèi)含子/外顯子分布特征進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，大豆SUS基因家族的內(nèi)含子數(shù)目在11～14個(gè)之間。同樣地，楊樹SUS家族的7個(gè)PtrSUS基因，海島棉SUS家族的大部分GaSUS基因(除GaSUS5外)，其內(nèi)含子數(shù)目均在11～14個(gè)之間[15,31]。以上結(jié)果表明，不同物種間SUS基因家族的內(nèi)含子數(shù)目是高度保守的。

黃色表示外顯子，黑線表示內(nèi)含子，藍(lán)色表示上下游序列；分支上的數(shù)值表示bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)節(jié)點(diǎn)的可信度圖3　大豆SUS家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹和基因結(jié)構(gòu)示意圖Exons were represented in yellow, introns were represented by black lines, and upstream and downstream were represented in blue. The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstrap values based on 1 000 replication.Fig.3　Phylogenetic relationship and gene structures of SUS family genes in soybean

左邊標(biāo)尺的單位是Mb；染色體頂端的數(shù)字代表著染色體對應(yīng)的編號(hào)；虛線代表片段復(fù)制圖4　大豆SUS基因家族在染色體上的分布和基因復(fù)制分析The scale on the left is Mb; the chromosome numbers are indicated at the top of each chromosome; the segmental duplicated genes are connected with dotted linesFig.4　Chromosomal distribution and gene duplication analysis of SUS gene family in soybean

顏色條代表的是GmSUS基因在7個(gè)大豆組織中的相對表達(dá)水平，其值大小用Log10(FPKM value)表示圖5　大豆SUS家族基因的組織表達(dá)分析及進(jìn)化組分布Color bar represents the relative transcript level of GmSUS genes in seven soybean tissues, and its value was showed by Log10(FPKM value)Fig.5　Tissue expression analysis and group distribution of SUS family genes in soybean

對大豆SUS家族成員的組織表達(dá)模式進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，大豆GmSUS基因具有不同的組織表達(dá)模式，暗示著它們在大豆生長發(fā)育的過程中可能起著不同的功能。GmSUS8基因在種子中表達(dá)量最高，其他組織表達(dá)量很低，表明該基因在大豆種子發(fā)育過程中可能起著重要作用。SUS基因?qū)ΨN子發(fā)育的影響，在其他植物中也被觀察到。例如，擬南芥的AtSUS2基因特異地在花后12 d的種子中高表達(dá)，其可作為種子成熟的標(biāo)記[10]。在菜豆中，SUS基因表達(dá)受到抑制，會(huì)推遲胚的發(fā)育，使胚和胚柄的發(fā)育出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致種子不能正常發(fā)育[41]；利用RNAi技術(shù)抑制棉花SUS基因的表達(dá)，可導(dǎo)致棉花種子早期發(fā)育受阻[42]。本研究中GmSUS8基因在大豆種子中特異地高表達(dá)，但是關(guān)于其如何影響大豆的種子發(fā)育目前還不清楚，還需通過基因敲除或過表達(dá)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步地研究。先前很多研究表明，豆科植物的根瘤主要依賴蔗糖代謝提供的碳骨架和能量[6]，且固氮作用相關(guān)的蛋白也依賴于SUS的活性[43]，因此，調(diào)控SUS的表達(dá)或改變SUS的活性可以影響豆科植物的固氮作用。本研究鑒定的GmSUS1、GmSUS7和GmSUS5基因在大豆根瘤中表達(dá)量很高，而在其他組織表達(dá)量很低或者不表達(dá)，表明它們在大豆固氮過程中可能起著重要作用，可作為大豆共生固氮調(diào)控分子機(jī)制研究的候選基因，進(jìn)而為通過分子育種提高大豆固氮效率提供理論基礎(chǔ)。有趣的是，這些組織特異性表達(dá)的基因主要分布在SUSⅢ和SUSⅡ進(jìn)化組，包括SUSⅢ的全部基因和SUSⅡ的部分基因。另外，SUS家族的一些基因在被檢測的各個(gè)組織均有較高表達(dá)，其表達(dá)不具有組織特異性，如大豆GmSUS3、GmSUS11和GmSUS12，這些基因主要分布在SUSⅠ和SUSⅡ進(jìn)化組，包括SUSⅠ的全部基因和SUSⅡ的部分基因。本研究觀察到的這種大豆SUS家族基因不同進(jìn)化組表達(dá)模式或功能的差異，暗示著它們在進(jìn)化過程中可能受到了選擇作用。

大豆在生長發(fā)育過程中，會(huì)遇到各種逆境脅迫，如低溫、干旱和鹽脅迫等，它們會(huì)嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量[44-46]。先前很多研究表明，SUS家族基因如擬南芥AtSUS1[10]，大麥HvSUS1和HvSUS3[14]，橡膠樹HbSUS5[7]等在植物應(yīng)對逆境脅迫過程中起著重要作用，但是關(guān)于大豆SUS基因在逆境條件下的表達(dá)特性及其對大豆生長發(fā)育的影響目前還不清楚。因此，在今后的研究中，有必要在逆境條件下進(jìn)一步研究大豆SUS基因的表達(dá)特性，了解它們響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制，以期為將來大豆抗逆育種提供重要的基因信息。

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