段國(guó)珍，白玉娥，伊如漢，白淑蘭

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，呼和浩特 010019)

云杉屬(PiceaDietr)植物是北方針葉林和亞高山針葉林的重要組成部分，分布范圍極廣，生長(zhǎng)環(huán)境差異較大[1]，全球約40種[2]，但被定名的云杉屬物種僅有34種[3]。沙地云杉(Piceamongolica(H. Q. Wu)W. D. Xu.)分布于中國(guó)內(nèi)蒙古渾善達(dá)克沙地東緣，形成中國(guó)罕見而壯觀的沙地針葉樹森林草原景觀，它對(duì)中國(guó)北方土地荒漠化防治，保護(hù)京津冀地區(qū)的周邊生態(tài)環(huán)境，具有十分重要的意義[4]。但沙地云杉種的確定是植物分類學(xué)界一直爭(zhēng)論不休的問題。中國(guó)著名植物分類學(xué)家鄭萬鈞在《中國(guó)植物志》[2]和《中國(guó)樹木志》[5]等著作中，談到能適應(yīng)沙地生長(zhǎng)的云杉在中國(guó)只有紅皮云杉(PiceakoraiensisNakai)，認(rèn)為白音敖包云杉林就是紅皮云杉林。1983年徐文鐸等[6]通過形態(tài)學(xué)鑒定、植物地理分布及水熱條件等分析，認(rèn)為該云杉是白杄(PiceameyeriRehd. et Wils.)。1986年烏弘奇[7]在徐文鐸研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行鑒定，認(rèn)為此種云杉是白杄的地方種，即蒙古云杉(PiceameyeriRehd.et Wils. var.mongolicaH. Q. Wu)。隨著研究的深入，1994年徐文鐸等[8]通過對(duì)該云杉、紅皮云杉和白杄的形態(tài)解剖的比較、同工酶測(cè)定、染色體核型分析、栽培試驗(yàn)觀察及種群生態(tài)地理分析等研究認(rèn)為此種云杉是一新種，并在1998年召開了沙地云杉新種鑒定會(huì)，定名為沙地云杉。但它的定名并未得到學(xué)術(shù)界的普遍接受[9-10]，爭(zhēng)議還在繼續(xù)。

基因組原位雜交(Genomic In Situ Hybridization，GISH)是20世紀(jì)80年代末，由熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)改良而來的一種重要技術(shù)[11]，隨著該技術(shù)的不斷改進(jìn)、拓展和完善，在植物基因組研究領(lǐng)域中發(fā)揮著愈來愈重要的作用[12-14]。GISH不僅能鑒定出遠(yuǎn)緣雜種中染色體的來源、重組以及外源滲入染色體片段的大小和位置，同時(shí)在不同物種之間的親緣關(guān)系比較、物種的起源與進(jìn)化中也被廣泛應(yīng)用[15]，如Schwarzacher等[16]首次從Secaleafricanum×Hordeumchilense基因組中成功區(qū)分兩親本的染色體。沙地云杉的歸屬問題雖然有過諸多探討，但卻沒有從基因組水平上分析沙地云杉與其近緣種的關(guān)系，而且也沒有研究關(guān)注沙地云杉是否可能為爭(zhēng)議最大的白杄和紅皮云杉的雜交種。因此，本試驗(yàn)應(yīng)用GISH技術(shù)對(duì)白杄與沙地云杉、紅皮云杉與沙地云杉進(jìn)行基因組原位雜交分析，排除或確定沙地云杉是否為雜交種，同時(shí)確定3種云杉在基因組水平上的親緣關(guān)系，為沙地云杉種的確定、種質(zhì)資源的保護(hù)和合理利用提供研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為裸子植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究提供研究方法和理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材　料

本試驗(yàn)中沙地云杉種子采自于分布最為集中的白音敖包自然保護(hù)區(qū)；白杄采自于主要分布區(qū)的山西龐泉溝國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)；紅皮云杉采于吉林省延吉市林業(yè)局帽兒山林場(chǎng)，是紅皮云杉集中分布區(qū)之一。

1.2　方　法

1.2.1染色體標(biāo)本制備將沙地云杉種子經(jīng)過消毒處理置于23 ℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)，根長(zhǎng)達(dá)到1～1.5 cm時(shí)，切取根尖進(jìn)行染色體制片，具體參照陳瑞陽等[17]的方法，略作修改。具體如下：0.1%秋水仙素+1% DMSO混合液黑暗預(yù)處理6.5 h，無水乙醇∶冰乙酸=3∶1固定24 h，2%纖維素酶+1%果膠酶37 ℃解離70 min，采用壓片法制片，在壓好的制片上滴加適量Giemsa Stain室溫下襯染3～5 min，蒸餾水洗去染色液，自然晾干后保存?zhèn)溆?，選擇30個(gè)完整染色體標(biāo)本備用。

1.2.2探針DNA及封阻DNA的制備采用改良的CTAB法[18]提取云杉基因組DNA，將白杄基因組DNA和紅皮云杉基因組DNA利用高壓滅菌剪切法剪切成合適片段(200～500 bp)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，用Dig-High Prime DNA Labeling and Detection starter Kit I標(biāo)記基因組DNA，點(diǎn)印跡法檢測(cè)標(biāo)記效果。封阻DNA片段獲取方法同上。

1.2.3基因組原位雜交基因組原位雜交過程參照鄧輝勝[19]的方法并加以修改。1)變性。在制備好的染色體標(biāo)本充分干燥后，滴100 μg/mL Rnase A 37 ℃條件下孵育40～60 min，2×SSC輕洗3次×5 min，0.1%胃蛋白酶37 ℃孵育1 h，1×PBS輕洗3次×5 min，4%多聚甲醛37 ℃固定10 min，2×SSC沖洗3次×5 min，70%去離子甲酰胺80 ℃變性2 min，75%、95%和100%乙醇逐級(jí)脫水，每級(jí)脫水5 min，晾干，鏡檢。2)基因組原位雜交。將40 μL雜交液(表1)滴在染色體標(biāo)本上，80 ℃共變性10 min，37 ℃雜交過夜。3) 洗脫與雜交信號(hào)檢測(cè)。2×SSC漂去雜交制片的蓋玻片，2×SSC(含有0.1% SDS)和0.2×SSC(含有0.1% SDS)37 ℃下各洗3次×5 min，2×SSC室溫洗滌2次，洗脫和雜交嚴(yán)謹(jǐn)度約為80%。加40～50 μL 5% BSA，37 ℃下封阻1 h，加40 μL Anti-DIG-Rhodamine，37 ℃溫育1 h，1×PBS 37 ℃洗滌3次×5 min，30～40 μL熒光染色劑DAPI染色5 min，襯染后1×PBS沖洗3次×3 min，加少量抗熒光衰減劑封片。

表1　雜交混合液配制標(biāo)準(zhǔn)

注：雜交溶液配好后在渦旋混合器上完全混勻，97 ℃條件下變性10 min后迅速轉(zhuǎn)到0 ℃中冷卻10 min

Note: The hybrid solution was mixed well on the vortex mixer and denatured 10 min at 97 ℃, and transferred to 0 ℃ quickly for cooling 10 min

采用熒光顯微鏡 (LeicaMC170HD) 觀察雜交信號(hào)強(qiáng)度，獲得原位雜交圖象，采用Spot和Photoshop軟件進(jìn)行圖像處理。

2　結(jié)果與分析

2.1　3種云杉的染色體核型分析

選擇染色體標(biāo)本中分散度適中、長(zhǎng)度收縮理想的中期分裂相在顯微鏡下進(jìn)行觀察、測(cè)量分析，共統(tǒng)計(jì)110個(gè)分裂相。紅皮云杉、白杄、沙地云杉Giemsa Stain染色后的中期分裂相觀察結(jié)果如圖1。

3種云杉的核型測(cè)量結(jié)果及核型模式圖分別見表2和圖2，它們的染色體數(shù)目均為2n=24，沒有發(fā)現(xiàn)多倍體及變異的現(xiàn)象。3種云杉染色體中，紅皮云杉7、8號(hào)染色體分別有1個(gè)隨體，白杄2、4、5號(hào)染色體各有1個(gè)隨體，而沙地云杉在3、4、5號(hào)染色體各有1個(gè)隨體，與白杄的染色體形狀較為相似。3種云杉大部分為亞中部著絲粒染色體，染色體核型類型1A型，是最對(duì)稱的染色體核型。白杄和紅皮云杉的染色體核型不對(duì)稱系數(shù)相近，而兩者與沙地云杉的差別較大，這說明白杄與紅皮云杉的進(jìn)化水平比沙地云杉更原始。3種云杉中，白杄與沙地云杉的核型公式相同，說明白杄與沙地云杉的親緣關(guān)系比紅皮云杉與沙地云杉更為接近。

物種Species核型公式Karyotypeformula相對(duì)長(zhǎng)度Relativelength/%臂比Armratio核型不對(duì)稱系數(shù)As.k/%類型Type紅皮云杉P.koraiensis2n=24=20m(4sat)+4sm6.33～11.061.09～1.8757.641A白杄P.meyeri2n=24=22m(6sat)+2sm5.67～10.851.05～1.9357.781A沙地云杉P.mongolica2n=24=22m(6sat)+2sm5.97～10.771.14～1.9758.751A

A.紅皮云杉；B.白杄；C.沙地云杉圖2　3種云杉染色體核型模式圖A. P. koraiensis; B. P. meyeri; C. P. mongolicaFig.2　Karyotype patterns of three Picea species

2.2　白杄基因組DNA與沙地云杉染色體的基因組原位雜交

以白杄基因組DNA為探針，以紅皮云杉基因組DNA為封阻，對(duì)沙地云杉染色體進(jìn)行基因組原位雜交，雜交結(jié)果和信號(hào)如圖3，A1、A2。白杄基因組DNA在沙地云杉14條染色體上顯示有明顯的雜交信號(hào)，其中1、2條染色體雜交信號(hào)位于著絲粒區(qū)；3、4、13、14條染色體信號(hào)位點(diǎn)位于染色體長(zhǎng)、短臂或覆蓋著絲粒區(qū)；7和8條染色體雜交信號(hào)位于染色體著絲粒區(qū)至次縊痕處；9、10條染色體雜交信號(hào)位于染色體短臂及至次縊痕處；5、6條染色體的著絲粒至次縊痕處顯示雜交信號(hào)；19、20條染色體雜交信號(hào)位于著絲粒區(qū)及長(zhǎng)臂。雜交信號(hào)主要分布于染色體短臂、著絲粒區(qū)和次縊痕處，雜交信號(hào)強(qiáng)度均較強(qiáng)，說明白杄與沙地云杉的同源性較高。

2.3　紅皮云杉基因組DNA與沙地云杉染色體的基因組原位雜交

以紅皮云杉基因組DNA為探針，以白杄基因組DNA為封阻，與沙地云杉染色體進(jìn)行原位雜交，雜交結(jié)果和信號(hào)如圖3，B1、B2。紅皮云杉基因組DNA在沙地云杉的12條染色體上顯示有明顯的雜交信號(hào)，其中3、4條染色體雜交信號(hào)位于染色體長(zhǎng)臂及著絲粒，7、8條染色體雜交信號(hào)位于著絲粒區(qū)至次縊痕處，11、12條染色體短臂及著絲粒有雜交信號(hào)，13、14條染色體上的長(zhǎng)臂上顯示有雜交信號(hào)，15、16條染色體長(zhǎng)臂和著絲粒區(qū)有雜交信號(hào)，23、24條染色體的雜交信號(hào)位于長(zhǎng)臂和近端部，信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)。所有雜交信號(hào)有強(qiáng)有弱，信號(hào)分布范圍較少，說明紅皮云杉和沙地云杉的同源性相比白杄較低。

圖3　白杄(A1、A2)和紅皮云杉(B1、B2)基因組DNA與沙地云杉染色體的GISH和核型分析Fig.3　GISH of genomic DNA probes of P. meyeri (A1, A2)and P. koraiensis (B1, B2) on metaphase chromosomes of P. mongolica

3　討　論

植物核型分析是現(xiàn)代植物分類和遺傳研究的重要手段之一[20]。根據(jù)李懋學(xué)[21]有關(guān)植物核型分析的研究發(fā)現(xiàn)，沙地云杉、紅皮云杉、白杄的染色體數(shù)目均為24，屬于二倍體(2n=24)，未發(fā)現(xiàn)染色體非整倍和多倍體現(xiàn)象，說明3種云杉的遺傳相對(duì)穩(wěn)定，這與其他學(xué)者對(duì)云杉屬植物研究結(jié)果一致[22-24]。本研究結(jié)果中3種云杉染色體核型均為1A，其中沙地云杉核型分析與徐文鐸等[25]、白玉娥等[26]的研究結(jié)果一致，白杄和紅皮云杉核型與劉玉紅[27]、李林初[28]的研究結(jié)果略有差異，這可能與試驗(yàn)材料來源有關(guān)。染色體核型不對(duì)稱系數(shù)(As.k%)越接近50%，表明著絲粒越接近中點(diǎn)，染色體越對(duì)稱[29]，著名植物遺傳與進(jìn)化學(xué)家Stebbins提出自然界系統(tǒng)演化過程中，較對(duì)稱的核型一般處于較古老或原始地位的植物中，而不對(duì)稱的核型則出現(xiàn)在較進(jìn)化或特化的植物中[30]，本研究中白杄和紅皮云杉的As.k% 相近，并且小于沙地云杉的As.k%，可以判斷白杄和紅皮云杉相對(duì)于沙地云杉更原始，這與王米力[31]的研究結(jié)果相似。

根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱和多少可推測(cè)基因組間的相似程度，物種間的親緣關(guān)系越近，其基因組間相似性越高，“雜交”位點(diǎn)出現(xiàn)越多，“雜交”位點(diǎn)信號(hào)表現(xiàn)越強(qiáng)[32]。本試驗(yàn)使用白杄和紅皮云杉基因組DNA分別與沙地云杉染色體進(jìn)行基因組原位雜交，結(jié)果顯示沙地云杉部分染色體上均有明顯的雜交信號(hào)出現(xiàn)，但雜交信號(hào)的強(qiáng)弱和分布范圍有顯著的區(qū)別。白杄基因組DNA在沙地云杉14條染色體雜交信號(hào)較強(qiáng)，主要分布在著絲粒區(qū)、染色體短臂及次縊痕處，其中著絲粒區(qū)與染色體短臂信號(hào)最強(qiáng)，而紅皮云杉在沙地云杉12條染色體上顯示較強(qiáng)信號(hào)，主要分布在著絲粒、染色體長(zhǎng)臂及次縊痕處，其中染色體長(zhǎng)臂的信號(hào)最強(qiáng)。同時(shí)，白杄基因組DNA與沙地云杉染色體雜交的每一條染色體所產(chǎn)生的信號(hào)分布范圍比紅皮云杉基因組DNA與沙地云杉染色體雜交時(shí)分布更廣，且明顯雜交信號(hào)位于部分同源染色體的對(duì)數(shù)較多，強(qiáng)度較強(qiáng)，說明這2個(gè)物種都與沙地云杉有著較近的親緣關(guān)系，且白杄更近，這與形態(tài)學(xué)、分子標(biāo)記的研究結(jié)果一致[33-36]。關(guān)于沙地云杉是否為白杄和紅皮云杉的種間雜交種，本研究通過基因組原位雜交發(fā)現(xiàn)白杄基因組DNA或紅皮云杉基因組DNA與沙地云杉的雜交信號(hào)均分布于部分染色體的部分區(qū)域，與GISH鑒定雜交種所得試驗(yàn)結(jié)果有所不同，如Schwarzacher等對(duì)Secaleafricanum×Hordeumchilense基因組組成進(jìn)行鑒定，能清晰地將來自兩親本的染色體用不同顏色區(qū)分，同樣的結(jié)果還出現(xiàn)在小麥[37]、水稻[38]、枳橙[39]、沙田柚宜昌橙雜種[40]中，因此，推斷沙地云杉不是白杄和紅皮云杉的雜交種，部分染色體出現(xiàn)的雜交信號(hào)僅能說明白杄和紅皮云杉與沙地云杉之間均存在著較高的同源性，與寧順斌等[41]、Cao等[42]采用GISH對(duì)不同種與其近緣種分析結(jié)果趨同。

沙地云杉及其近緣種的基因組原位雜交分析，為沙地云杉的分類地位的確定又提供了一個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)，至于沙地云杉是否為白杄的變種或是一個(gè)獨(dú)立的并且有特異生態(tài)位的進(jìn)化譜系或物種，研究團(tuán)隊(duì)將會(huì)結(jié)合遺傳機(jī)制、生理生態(tài)與基因組原位雜交進(jìn)一步研究確定。

參考文獻(xiàn):

[1]SPRIBILLE T, CHYTR M. Vegetation surveys in the circumboreal coniferous forests: A review[J].FoliaGeobotanica, 2002,37(4): 365-382.

[2]鄭萬鈞, 傅立國(guó). 中國(guó)植物志:裸子植物門[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1978.

[3]FARJON A, KEW R B G. World Checklist and Bibliography of Conifers[M]. London: Royal Botanic Gardens, 1999.

[4]黃三祥. 沙地云杉生態(tài)學(xué)特性及引種研究[D]. 北京: 北京林業(yè)大學(xué), 2004.

[5]鄭萬鈞. 中國(guó)樹木志[M]. 北京: 中國(guó)林業(yè)出版社, 1997.

[6]徐文鐸. 內(nèi)蒙古沙地的白扦與白扦林[J]. 植物生態(tài)學(xué)與地植物學(xué)叢刊, 1983,7(1): 1-7.

XU W D.Piceameyeriand its spruce forest in the Nei Monggol sands[J].ActaFhytoecologicaetGeobotanicaSinica, 1983,7(1): 1-7.

[7]烏弘奇. 云杉屬一新變種[J]. 植物研究, 1986,6(2): 153-155.

WU H Q. A new variety ofPiceaDiter[J].BulletinofBotanicalReaearch, 1986,6(2): 153-155.

[8]徐文鐸. 沙地云杉新種的鑒定及其對(duì)我國(guó)北方生態(tài)環(huán)境建設(shè)意義[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 1999,10(3): 361.

[9]杜芳. 基因流速度與種間漸滲和物種界定:云杉屬線粒體和葉綠體DNA群體遺傳學(xué)的證據(jù)[D]. 蘭州: 蘭州大學(xué), 2010.

[11]RAINA S N, RANI V. GISH technology in plant genome research[J].MethodsinCellScience, 2001,23(1): 83-104.

[12]肖水平, 陳宜, 柯興盛, 等. 二倍體野生棉與四倍體栽培棉基于GISH的遺傳關(guān)系分析[J]. 棉花學(xué)報(bào), 2017,29(1): 99-107.

XIAO S P, CHEN Y, KE X S,etal. Genomic in situ hybridization analysis of the genetic relationship between wild-type diploid and cultivated allotetraploidGossypiumspecies[J].CottonScience, 2017,29(1): 99-107.

[13]RAMZAN F, YOUNIS A, LIM K B. Application of genomic in situ hybridization in horticultural science[J].InternationalJournalofGenomics, 2017, doi: https://doi.org/10.1155/2017/7561909.

[14]MELO C A F, SILVA G S, SOUZA M M. Establishment of the genomic in situ hybridization (GISH) technique for analysis in interspecific hybrids ofPassiflora[J].Genetics&MolecularResearch, 2015,14(1): 2 176-2 188.

[15]LIU Q, LIU H, WEN J. Relationships betweenSorghumbicolor(Poaceae) and its closerelatives based on genomic in situ hybridization evidence[J].TurkishJournalofBotany, 2017,41(1): 11-24.

[16]SCHWARZACHER T, ANAMTHAWAT J K, HARRISON G E,etal. Genomic in situ hybridization to identify alien chromosomes and chromosome segments in wheat[J].Tagtheoretical&AppliedGenetic, 1992,84(7-8): 778-786.

[17]陳瑞陽, 宋文芹, 李秀蘭. 植物有絲分裂染色體標(biāo)本制作的新方法[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 1979,21(3): 101-102.

CHEN R Y, SONG W Q, LI X L. A new method for preparing mitotic chromosomes from plant[J].ActaBotanicaSinica, 1979,21(3): 101-102.

[18]ZOU J B, YUE W, LI L L,etal. DNA barcoding of recently diversified tree species: a case study on spruces based on 20 DNA fragments from three different genomes[J].Trees, 2016,30(3): 959-969.

[19]鄧輝勝. 松科三屬植物的染色體研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2005.

[20]劉永安, 馮海生, 陳志國(guó), 等. 植物染色體核型分析常用方法概述[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006,34(1): 98-102.

LIU Y A, FENG H S, CHEN Z G,etal. Common methods of karyotype analysis in plant[J].GuizhouAgriculturalSciences, 2006,34(1): 98-102.

[21]李懋學(xué), 陳瑞陽. 關(guān)于植物核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問題[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào), 1985,3(4): 297-302.

LI M X, CHEN R Y. A suggestion on the standardization of karyotype analysis in plants[J].JournalofWuhanBotanicalResearch, 1985,3(4): 297-302.

[22]石大興, 王米力. 6種云杉的核型分析[J]. 云南植物研究, 1994,16(2): 157-164.

SHI D X, WANG M L. Karyomorphological studies of 6 species in genusPicea[J].ActaBotanicaYunnanica,16(2): 157-164.

[23]HIZUME M. Karyomorphological studies in the family pinaceae[J].MemoirsoftheFacultyofEducationEhimeUniversity, 1988,8:1-108.

[24]李林初, 王剛, 蘇蘇, 等. 4種云杉的核型分析[J]. 廣西植物, 2001,21(1): 43-46.

LI L C, WANG G, SU S,etal. Karyotype analysis of four species inPicea(Pinaceae) [J].Guihaia, 2001,21(1): 43-46.

[25]徐文鐸, 李維典, 鄭沅. 內(nèi)蒙古沙地云杉分類的研究[J]. 植物研究, 1994,14(1): 59-68.

XU W D, LI W D, ZHENG Y. A study on taxonomy ofPiceamongolicain Inner Mongolia[J].BulletinofBotanicalResearch, 1994,14(1): 59-68.

[26]白玉娥, 彭鵬, 王菊, 等. 基于熒光原位雜交技術(shù)分析沙地云杉及近緣種核型[J]. 分子植物育種, 2016,14(12): 3 548-3 553.

BAI Y E, PENG P, WANG J,etal. Comparative FISH karyotype analysis ofPiceamongolicaand its closest relatives[J].MolecularPlantBreeding, 2016,14(12): 3 548-3 553.

[27]劉玉紅, 李懋學(xué). 5種云杉的核型分析[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào), 1985,3(3): 203-207.

LIU Y H, LI M X. Karyotype analysis of 5 species of genusPicea[J]. JournalofWuhanBotanicalResearch, 1985,3(3): 203-207.

[28]李林初. 云杉核型的研究兼論云杉屬的進(jìn)化地位[J]. 植物分類與資源學(xué)報(bào), 1992,14(4): 347-352.

LI L C. A contribution to the karyotype ofPiceaasperatawith a discussion on the evolutionary position ofPicea(Pinaceae) [J].ActaBotanicaYunnanica, 1992,14(4): 347-352.

[29]倪妍妍, 楊文娟, 劉建鋒, 等. 崖柏屬植物的核型分析[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2017,30(2): 189-193.

NI Y Y, YANG W J, LIU J F,etal. Karyomorphology of fiveThujaspecies[J].ForestResearch, 2017,30(2):189-193.

[30]STEBBINS G L. Chromosomal Evolution in Higher Plants[M]. London: Edward Arnold, 1971.

[31]王米力, 石大興, 曾平安. 中國(guó)云杉屬植物核型及生物學(xué)意義初探[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1997,15(1): 74-81.

WANG M L, SHI D X, ZENG P A. The situation of karyomorphological analysis and biological signification ofPiceaplants in China[J].JournalofSichuanAgriculturalUniversity, 1997,15(1): 74-81.

[32]徐靜, 張新友, 李春喜. 基因組原位雜交技術(shù)及其在植物中的應(yīng)用[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006,35(4): 5-8.

XU J, ZHANG X Y, LI C X. Genomic in situ hybridization (GISH) technology and its application in plant[J].JournalofHenanAgriculturalSciences, 2006,35(4): 5-8.

[33]蔡萍, 宛濤, 張洪波, 等. 沙地云杉與其近緣種花粉形態(tài)的比較研究[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)(自然版), 2009,40(6): 685-689.

CAI P, WAN T, ZHANG H B,etal. Pollen morphology comparison ofPiceamongolica(H. Q. Wu.)W. D. Xu with its close relative species[J].JournalofInnerMongoliaUniversity, 2009,40(6): 685-689.

[34]李春紅, 藍(lán)登明, 周世權(quán), 等. 內(nèi)蒙古白音敖包沙地云杉分類學(xué)研究[J]. 干旱區(qū)資源與環(huán)境, 2008,22(2): 164-169.

LI C H, LAN D M, ZHOU S Q,etal. Research on the taxonomy of species ofPiceain Baiyinaobao sandy land of Inner Mongolia[J].JournalofAridLandResourcesandEnvironment, 2008,22(2): 164-169.

[35]張洪波. 沙地云杉(PiceamongolicaW.D.Xu)生物學(xué)特點(diǎn)及遺傳多樣性研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[36]鄭舒文, 白玉娥, 何炎紅, 等. 沙地云杉及其近緣種遺傳多樣性研究[J]. 福建林業(yè)科技, 2015,42(3): 24-28.

ZHENG S W, BAI Y E, HE Y H,etal. The interspecific genetic diversity ofPiceamongolicaand its relative species[J].JournalofFujianForestryScienceandTechnology, 2015,42(3): 24-28.

[37]王黎明, 林小虎, 趙逢濤, 等. 中間偃麥草的染色體組及其優(yōu)良基因向普通小麥的轉(zhuǎn)移[J]. 中國(guó)草地學(xué)報(bào), 2005,27(1): 57-63.

WANG L M, LIN X H, ZHAO F T,etal. Genome configuration ofElytrigiaintermediumand its valuable genes transferred into wheat[J].GrasslandofChina, 2005,27(1): 57-63.

[38]YU S W, CHEN B T, TAO A L,etal. Identification of intergeneric hybrid plants betweenOryzasativaandO.minutavia GISH and RAPD[J].AgricultureSciencesinChina, 2003,2(12): 1 297-1 301.

[39]陳春麗, 郭文武, 鄧秀新. 柑橘基因組原位雜交(GISH)技術(shù)體系的建立[J]. 武漢植物學(xué)研究, 2003,21(5): 439-443.

CHEN C L, GUO W W, DENG X X. Establishment of GISH technique inCitrus[J].JournalofWuhanBotanicalResearch, 2003,21(5): 439-443.

[40]楊星, 王瑩, 趙倩, 等. 沙田柚宜昌橙雜種核型及基因組原位雜交分析[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2016,43(3): 441-450.

YANG X, WANG Y, ZHAO Q,etal. Analysis of karyotype and GISH of the hybrid fromCitrusgrandis‘Shatianyou’andC.ichangensis[J].ActaHorticulturaeSinica, 2016,43(3): 441-450.

[41]寧順斌, 金危危. 基因組原位雜交比較玉米和水稻基因組同源性[J]. 科學(xué)通報(bào), 2000,45(22): 2 431-2 434.

NING S B, JIN W W. Comparison of genomic homology between maize and rice by GISH[J].ChineseScienceBulletin, 2000,45(22): 2 431-2 434.

[42]CAO M, SLEPER D A, DONG F G,etal. Genomic in situ hybridization (GISH) reveals high chromosome pairing affinity betweenLoliumperenneandFestucamairei[J].Genome, 2000,43: 398-403.