張　磊，路東曄，張國盛，楊海峰

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，呼和浩特 010019)

分枝發(fā)育在植物形態(tài)建成中具有十分重要的地位，是影響植物枝型、光合效率、生長量、固碳效率、造林效果及景觀等多方面的重要樹木性狀，對(duì)于農(nóng)林業(yè)等生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

分枝發(fā)育過程通常包括腋生分生組織的形成、腋芽的形成與生長兩個(gè)發(fā)育階段。環(huán)境因素及其內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制共同調(diào)控莖端分生組織和側(cè)生分生組織，繼而決定植物地上部株型。眾多基因家族共同參與調(diào)控植物的分枝發(fā)育，GRAS (gibberellin-insensitive, repressor of ga1-3, scarecrow)基因家族在植物根莖的發(fā)育、分生組織形成、根瘤和菌根的形成、植物激素赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)、油菜素類固醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物及非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[1-5]。研究表明，其代表性基因Lateralsuppressor(LAS)/Lateralsuppressor(LS)/Monoculm1 (MOC1)，它們的功能缺失突變體均表現(xiàn)為分枝減少。番茄(Lycopersiconesculentum)LS、黃瓜(Cucumissativus)LateralSuppressorGene(CLS)轉(zhuǎn)到擬南芥的las突變體中，發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體恢復(fù)正常表型，說明番茄LS、CLS基因與LAS基因功能互補(bǔ)，是擬南芥LAS的直系同源基因[6-7]。水稻(Oryzasativa)MOC1基因可調(diào)控分蘗芽的形成和腋生分生組織的起始，與LAS/LS同源[8]。近年來藥用植物青天葵(Nerviliafordii)、芋蘭(Nerviliaaragoana)的NfLS、NaLS基因相繼被克隆，發(fā)現(xiàn)其3’UTR序列具有反向調(diào)控上游基因表達(dá)的功能[9-10]。

沙柳(Salixpsammophila)，楊柳科柳屬，屬于速生、多年生灌木，是西北地區(qū)防風(fēng)固沙及沙產(chǎn)業(yè)開發(fā)的重要樹種。路東曄等[11]已在沙柳中成功克隆了SpsLAS，編碼產(chǎn)物具有GRAS蛋白高度保守結(jié)構(gòu)域LHR I、VHIID、LHR II、PFYRE、SAW。本研究將SpsLAS基因構(gòu)建35S::SpsLAS表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，分析過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的分枝、株高等表型變化，以及分枝、生長素、細(xì)胞分裂素相關(guān)基因表達(dá)量變化，為確定該基因?qū)嗄玖忍Y及分枝的調(diào)控機(jī)理提供可靠的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

SpsLAS入門載體質(zhì)粒、超表達(dá)載體pMDC32、野生型擬南芥種子(Columbia 生態(tài)型)，均為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2　研究方法

1.2.135S∷SpsLAS表達(dá)載體構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化利用MluI酶特異識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)入門載體pDONR222∷SpsLAS重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化。將酶切產(chǎn)物和與pMDC32超量表達(dá)載體進(jìn)行LR置換反應(yīng)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性菌株Thermo Fisher公司測序。將陽性轉(zhuǎn)化質(zhì)粒35S∷SpsLAS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并采用花絮浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。收集種子并在含有25 mg/L 潮霉素的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上篩選至T3純合株系。

1.2.2轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定在載體、目的基因分別設(shè)計(jì)上、下游引物，CTAB 法提取擬南芥總DNA[12]，以DNA為模板進(jìn)行PCR，92 ℃預(yù)變性3 min，92 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸7 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳檢測。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析用Thermo RNA試劑盒分別提取24 h、4 d、30 d擬南芥全株總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，取質(zhì)量完好的RNA置于-80 ℃保存，備用。全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃冰箱保存，備用。以擬南芥AtACT2 基因(GenBank登錄號(hào) EU604080)為內(nèi)參基因[13]，選取SpsLAS特異性引物L(fēng)ASq、分枝相關(guān)基因(MAX1、MAX3、RAX1、RAX3、AXR1、REV)、細(xì)胞分裂素受體組氨酸激酶(ArabidopsisHisKinase)AHK4、應(yīng)答子基因組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白(ArabidopsisHistidine-phosphotransferprotein)AHP2、響應(yīng)調(diào)節(jié)子(Arabidopsisresponseregular)ARR15 及生長素輸入載體基因AUX1、輸出載體蛋白基因PIN1，對(duì)其野生型、轉(zhuǎn)基因擬南芥表達(dá)量進(jìn)行測定。qRT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共42個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。所用的特異性引物見表1。2-ΔCt法分析qRT-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Excel、Origin 8作圖。所用特異引物見表1。

1.2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察每周對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型觀察記錄，包括葉片形態(tài)、大小、顏色、輪座葉數(shù)目、表皮毛、莖高度、莖分枝等情況、莖生葉數(shù)目、形態(tài)、抽薹時(shí)間、花期長短等，并拍照記錄。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和Spss19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

表1　引物列表

2　結(jié)果與分析

2.1　35S∷SpsLAS植物表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

將LR反應(yīng)陽性菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖1，A)，測序結(jié)果表明成功構(gòu)建35S∷SpsLAS表達(dá)載體。將構(gòu)建好的含目的基因表達(dá)載體及空表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌GV3101分別轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，通過潮霉素篩選和DNA鑒定共獲得9株轉(zhuǎn)基因株系(圖1，B)。通過熒光定量PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行純合體檢測，顯示SpsLAS在幾個(gè)株系均有表達(dá)(圖2)，其中LAS-5表達(dá)量最高、LAS-2最低，而轉(zhuǎn)入空表達(dá)載體的擬南芥對(duì)照未檢測到該基因表達(dá)。

2.2　過表達(dá)植株表型變化

為檢查野生型擬南芥與過表達(dá)株系的生長速率，將Col、LAS-9、LAS-5和LAS-2種子各100粒在1/2MS培養(yǎng)基，4 ℃同步處理3 d，每小時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)種子萌芽率。結(jié)果(圖3)顯示，過表達(dá)株系萌發(fā)速率明顯快于對(duì)照，但總體萌發(fā)率均在99%左右無顯著差異。10 d后進(jìn)行根長測量，LAS-5、LAS-9顯著長于對(duì)照，LAS-2與對(duì)照相似。

A. 35S∷SpsLAS載體的菌落PCR鑒定：M. DL2000; 1～3. 35S∷SpsLAS菌落PCR; B. 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定：M. DL2000; 1.Col; 2～10. 轉(zhuǎn)基因株系 圖1　35S∷SpsLAS植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定A. The PCR of 35S∷SpsLAS vector E.coli：M. DL2000; 1-3. The PCR of 35S∷Sps LAS vector; B. Detection of transgenic lines with PCR：M. DL2000; 1.Col; 2-10. Transgenic linesFig.1　Construction of 35S::SpsLAS vector and detection of transgenic lines with PCR

對(duì)20株過表達(dá)植株表型觀察發(fā)現(xiàn)，LAS-5莖生葉、蓮座葉顏色深綠，蓮座葉呈倒卵形、表面褶皺，葉長(4.29±0.49)cm，葉寬(2.62±0.14)cm，較對(duì)照增加，葉柄縮短變寬，葉緣向下翻卷(圖4，B)；抽薹時(shí)間為(18.44±1.33)d早于對(duì)照組，生長速度快，主莖粗壯、株高增加(表2)；而LAS-2則表現(xiàn)為葉片縮小，生長速度較對(duì)照緩慢(圖4，C)，營養(yǎng)生長期長，根長縮短，節(jié)間縮短，平均株高為21 cm。LAS-5生長周期長，生長70 d時(shí)，野生型(對(duì)照)蓮座葉已黃化，而LAS-5仍為深綠(圖4，D)。LAS-2雖能正常開花，但果莢短小(圖4，E)、敗育率高達(dá)88.45%(表2)。生長90 d時(shí)，LAS-5、LAS-2莖生葉仍為綠色，LAS-2仍在花期，而對(duì)照已枯萎(圖4，G)。

2.3　生長素及細(xì)胞分裂素關(guān)鍵基因表達(dá)分析

種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中35S∷SpsLAS轉(zhuǎn)基因植株萌發(fā)速率均快于對(duì)照，定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，24 h時(shí)LAS-9PIN1、AUX1、AHP2 表達(dá)量增加，LAS-5AUX1、AHK4、AHP2表達(dá)量增加，LAS-2各基因表達(dá)量均少于對(duì)照；而在4 d時(shí)各基因在各轉(zhuǎn)基因株系開始上調(diào)，其中LAS-2株系上調(diào)最明顯(圖5)。

LAS-1、LAS-2、LAS-5、LAS-6、LAS-7、LAS-8、LAS-9、LAS-10、LAS-11均為35S∷SpsLAS轉(zhuǎn)基因株系圖2　轉(zhuǎn)基因擬南芥SpsLAS表達(dá)量分析LAS-1, LAS-2, LAS-5, LAS-6, LAS-7, LAS-8, LAS-9, LAS-10 and LAS-11 are 35S∷SpsLAS transgenic linesFig.2　Expression analysis of SpsLAS in transgenic

*表示0.05水平差異顯著圖3　Col及35S∷SpsLAS株系萌芽率及根長測定* is significant difference at 0.05 levelFig.3　Seed germination rate and root length of Col and 35S::SpsLAS lines

蓮座葉數(shù)Rosetteleaf葉長Leaflength/cm葉寬Leafwidth/cm葉柄長Petiolelength/cm葉柄寬Petiolelength/cm株高Plantheight/cm抽薹時(shí)間Daytoflowering/d敗育率Abortionrate/%Col22.11±1.61a3.23±0.57b1.55±0.12b2.03±0.41c0.20±0.03a31.46±1.59b24.33±1.58a12.14±3.44aLAS-526.67±3.16b4.29±0.49c2.62±0.14c1.43±0.25b0.35±0.08b48.26±9.69c18.44±1.33a15.01±3.40aLAS-224.6±3.13ab2.19±0.29b1.38±0.08a0.99±0.13a0.18±0.05a21.23±3.55a59.56±4.12c88.45±12.50b

注：數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列不同字母表示在0.05水平差異顯著

Notes：Data indicated mean ±SD；the different letters of the same column is significant difference at 0.05 level

圖4　35S∷SpsLAS轉(zhuǎn)基因株系表型觀察Fig.4　Phenotypic observation of 35S∷SpsLAS transgenic lines

圖5　擬南芥生長素及細(xì)胞分裂素關(guān)鍵基因表達(dá)分析Fig.5　Expression analysis of key genes in auxin and cytokinin pathway

2.4　分枝基因表達(dá)分析

圖6　分枝相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.6　Expression analysis of branching genes

為進(jìn)一步探究LAS與其他分枝相關(guān)基因關(guān)系，選取部分分枝基因MAX1、MAX3、RAX1、RAX3、AXR1和REV，利用RT-PCR分析它們在對(duì)照及35S∷SpsLAS轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量變化，尋找LAS可能的下游基因。結(jié)果(圖6)表明，RAX1在LAS-5、LAS-9、LAS-2表達(dá)量明顯增高，RAX3在LAS-9、LAS-2同樣有所增高而在LAS-5卻略有降低；MAX3在LAS-5、LAS-2表達(dá)量降低，MAX1無明顯變化；AXR1及REV除AXR1在LAS-9表達(dá)量略有增高外在其他株系下降(圖6)。

3　討　論

植物分枝發(fā)育作為重要的農(nóng)業(yè)性狀，其內(nèi)在調(diào)控分子機(jī)制已有初步研究，但其主要集中在以擬南芥、番茄、黃瓜、芋蘭等為代表的草本植物，木本植物中尚無系統(tǒng)研究。大量研究表明，LAS/LS亞家族在分枝發(fā)育調(diào)控中起重要作用。擬南芥、番茄las突變體、水稻moc1突變體營養(yǎng)生殖階段腋芽形成受到抑制、分枝數(shù)目減少。DendranthemagrandiflorumKitamuraLateralsuppressor-like(DgLsL)在葉腋等側(cè)枝形成部位富集，通過基因互作對(duì)側(cè)枝原基的分生組織的形成起調(diào)控作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，SpsLAS基因過表達(dá)擬南芥種子萌發(fā)速率高于對(duì)照、生長周期均有所延長、分枝數(shù)量增加與ZoysiajaponicaLateralsuppressor-like(ZjLsL)過量表達(dá)擬南芥會(huì)促進(jìn)腋芽形成相一致[15]；獲得9株純合株系中LAS-5等7個(gè)株系生長迅速、蓮座葉深綠肥大、株高增加；LAS-2生長緩慢、株高降低、敗育等表型變化與BnLAS過表達(dá)擬南芥相一致[16]。9株純合株系分枝均增加，這與LAS基因促進(jìn)腋芽形成功能相一致；LAS-5等高表達(dá)株系中SpsLAS基因表達(dá)量是LAS-2的千百倍，這種表達(dá)量差異可能引起代謝途徑中其他基因表達(dá)變化，從而產(chǎn)生LAS-5、LAS-2兩種不同的表型。這種表型差異是由SpsLAS表達(dá)量差異還是其他原因造成仍有待下一步研究。

植物側(cè)枝形成受到側(cè)生分生組織重要調(diào)控基因及生長素、細(xì)胞分裂素、獨(dú)腳金內(nèi)酯等激素共同調(diào)控。RAX基因與LAS基因功能相似rax1缺失突變體中，葉腋處無分生組織形成，導(dǎo)致分枝減少，而過表達(dá)RAX2 會(huì)引起擬南芥分枝增加，大多主側(cè)枝外的莖生葉在葉腋處會(huì)增生附著枝[17]。 Müller D認(rèn)為LAS和RAX1是腋生分生組織形成的控制通道中2個(gè)獨(dú)立元素[17]，而我們在分枝相關(guān)基因RT-PCR分析中發(fā)現(xiàn)在SpsLAS過表達(dá)植株中RAXs表達(dá)明顯上調(diào)，推測RAXs可能為LAS的下游基因。LAS基因作用于REV/AXR1上游[18]，同時(shí)受到NAC家族轉(zhuǎn)錄因子CUPSHAPEDCOTYLEDON(CUC1)、CUC2、CUC3基因的調(diào)控[19]，但本研究在SpsLAS過表達(dá)株系并未發(fā)現(xiàn)REV/AXR1表達(dá)量明顯變化。LAS與RAXs、REV、AXR1的關(guān)系仍待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

SpsLAS過表達(dá)擬南芥種子萌發(fā)速率、后期生長速度均快于野生型擬南芥(對(duì)照)，而24 h時(shí)擬南芥幼苗生長素及細(xì)胞分裂素途徑相關(guān)基因表達(dá)量與對(duì)照相似，4 d時(shí)各基因在各轉(zhuǎn)基因株系開始上調(diào)但上調(diào)不明顯，這表明過表達(dá)LAS可能未誘導(dǎo)生長素、細(xì)胞分裂素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相應(yīng)途徑。通過模式植物擬南芥對(duì)SpsLAS基因功能初步鑒定，將有助于進(jìn)一步了解沙柳分枝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為培育新品種奠定基礎(chǔ)。

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