閻　華，王　會，于　博*，黃升謀，李云捷，吳進菊，李玉奇(.湖北文理學院 化學工程與食品科學學院，湖北 襄陽 44053； .襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 44053)

甲醚菊酯是一種人工合成的高效擬除蟲菊酯類殺蟲和殺螨劑。該農(nóng)藥具有典型的觸殺和胃毒作用，無內(nèi)吸和熏蒸作用。其殺蟲譜廣，對絕大多數(shù)昆蟲和螨蟲具有良好的效果，殺滅時間短[1]。甲醚菊酯在土壤中不移動，對環(huán)境影響相對較小，但是其殘效期較長，因此容易通過食物鏈進入人體，造成人體組織的損傷[2]。該農(nóng)藥適用作物有香蕉、大麥、棉花、萵苣、茶、蘋果、甜瓜、大蔥等。在農(nóng)業(yè)上，甲醚菊酯防治對象主要是各種鱗翅目幼蟲、粉虱、蚜蟲、植食性葉螨[3]。由于甲醚菊酯農(nóng)藥的廣泛應用，其殘留造成的環(huán)境污染和食品污染直接威脅到人體健康。

生物原位修復方法相對來說對殘留農(nóng)藥的清除是比較有效的，因此越來越受到研究人員的重視。分離獲取微生物產(chǎn)生的酶用于降解農(nóng)藥，具有較多優(yōu)點[3]：(1)農(nóng)藥降解速度快，效率高，即使農(nóng)藥的濃度比較低，酶也能進行催化；(2)安全無毒副作用，其降解產(chǎn)物可以溶解于水體中流入大海并進行光氧化作用；(3)農(nóng)藥降解酶通常比產(chǎn)生這類酶的微生物菌體更能耐受異常環(huán)境條件，具有更寬廣的溫度和pH值穩(wěn)定范圍；(4)具有比微生物更寬廣的降解譜，可以對具有相同基團的農(nóng)藥進行酶降解作用。由微生物發(fā)酵后制備的粗酶蛋白，通常含有多種雜蛋白及其他小分子物質(zhì)。將有活力的酶從粗酶中有效分離出來，并測定其酶學性質(zhì)，有利于酶的綜合開發(fā)利用。因而，本研究采用平板劃線培養(yǎng)的方法從湖北省襄陽市農(nóng)藥廠下水道活性污泥中分離得到對甲醚菊酯農(nóng)藥有降解作用的細菌菌株，然后采用DEAE-52和CM-52陰陽離子纖維素交換層析柱對該菌株中甲醚菊酯降解酶進行了部分純化。獲得部分純化酶以后，通過SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分析，確定該酶蛋白的分子質(zhì)量，并評價陰陽離子纖維素交換層析柱的純化效果。最后對該細菌菌株中甲醚菊酯降解酶的酶促反應最適溫度、最適pH值及反應動力學特性進行了研究，為其應用于農(nóng)藥污染物的原位降解奠定理論和實踐基礎。

1　材料和方法

1.1　試劑與培養(yǎng)基

SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、溴酚藍、甘氨酸、考馬斯亮藍G-250、三羥甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、瓊脂糖，均購自上海生工生物工程有限公司；標準蛋白質(zhì)Marker，購自日本Takara公司；20%甲醚菊酯乳油，購自浙江威爾達化工有限公司;甲醚菊酯標樣，購自北京康林科技有限公司。富集培養(yǎng)基和無機鹽培養(yǎng)基的配制和滅菌方法參照文獻[4]。

1.2　儀器與設備

UV-362型紫外-可見分光光度計，購自日本日立公司；TV-200型振蕩型恒溫水浴鍋，購自上海一恒科學有限公司；DHZ-5型恒溫振蕩器，購自太倉市強樂實驗設備有限公司；中空纖維超濾膜管，購自廣州能淼環(huán)?？萍加邢薰?；BD-164蛋白電泳儀、電泳槽，購自美國Bio-Rad公司；HP6890氣相色譜儀，購自美國惠普公司。

1.3　菌株分離及鑒定

準確稱取湖北省襄陽市農(nóng)藥廠下水道活性污泥10 g放入250 mL錐形瓶，然后添加100 mL無機鹽培養(yǎng)基，最初設定甲醚菊酯質(zhì)量濃度為100 mg/L，錐形瓶置于30 ℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)7 d。然后轉接5 mL培養(yǎng)液至二次無機鹽培養(yǎng)基(設定甲醚菊酯200 mg/L)，在30 ℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)7 d，以此重復接種5次，設置100 mg/L的質(zhì)量濃度梯度，使最后無機鹽培養(yǎng)液中甲醚菊酯的質(zhì)量濃度為500 mg/L，從而獲得對甲醚菊酯有降解活力的菌株。而后將菌懸液制備成10-6稀釋液，在固體富集培養(yǎng)基上劃線涂布，30 ℃培養(yǎng)2 d，根據(jù)細菌生長的外觀形態(tài)和特征選取單菌落，反復劃線培養(yǎng)，最后將分離得到的菌株(XU-3)接種于固體富集培養(yǎng)基斜面，保存于4 ℃冰箱備用。

甲醚菊酯降解菌株的形態(tài)、生理生化特征鑒定方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]。降解菌株總DNA的制備方法參照文獻[3]，使用細菌16S rDNA通用引物FT1(5′-TGAGTTTGATTATGGCTCAG-3′)和RK2(5′-GAGGTTACCTTGTGTCGACTT-3′)，采用PCR擴增儀擴增降解菌的16S rDNA片段。PCR擴增的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，然后利用DNA膠回收試劑盒收集純化PCR擴增產(chǎn)物，最后送到深圳華大基因股份有限公司進行測序，將測序結果登錄NCBI網(wǎng)站，使用Blast軟件進行16S rDNA序列同源性比較。

1.4　甲醚菊酯降解菌XU-3粗酶液的制備及其可溶性蛋白含量測定

甲醚菊酯降解菌XU-3粗酶液的制備參照文獻[6]開展?？扇苄缘鞍缀康臏y定參照文獻[7]，使用福林酚法。

1.5　甲醚菊酯農(nóng)藥含量和菌體酶活力測定

甲醚菊酯農(nóng)藥含量測定參照文獻[8]，使用氣相色譜法。酶活力測定方法參照文獻[9]，酶活力單位(U)定義為每分鐘降解1 mg甲醚菊酯所需的酶量。

1.6　甲醚菊酯降解菌XU-3生長與降解酶活力的關系試驗

采用添加50 mg/L甲醚菊酯作為唯一碳、氮源的無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)XU-3菌株，在30 ℃、pH值7.0、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)120 h，每隔12 h測定XU-3菌液的OD600 nm[10]，同時按照1.5的方法測定培養(yǎng)基中殘留甲醚菊酯農(nóng)藥的含量，計算出菌體酶活力單位。

1.7　甲醚菊酯降解酶的部分純化

1.7.1DEAE-52陰離子交換層析使用1 mol/L的HCl溶液處理DEAE-52樹脂成Cl-型。用0.005 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液平衡DEAE-52柱子24 h后，加樣XU-3粗酶液20.0 mL，然后使用0.005 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗脫，最后使用0.1～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫。用自動收集器收集流出液，自動收集器設定為9 min/格，流速為9 滴/min。收集時間約9 h，得到XU-3酶蛋白的收集峰。按照1.5的方法測定出峰樣品的酶活力，將有活力的樣品合并后用透析膜和聚乙二醇-20000進行濃縮。部分酶液進行蛋白質(zhì)含量和酶活力測定，其余保存于4 ℃冰箱備用。

1.7.2CM-52陽離子交換層析使用1 mol/L的NaOH 溶液處理CM-52樹脂成Na+型。用0.005 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液平衡CM-52柱子24 h后，加樣濃縮過的XU-3酶液，然后使用0.005 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗脫，最后使用0.1～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫。用自動收集器收集流出液，自動收集器設定為9 min/格，流速為9 滴/min。收集時間約8 h，得到XU-3酶蛋白的收集峰。然后將有活力的收集峰合并濃縮，測定蛋白質(zhì)含量和酶活力后，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8　酶蛋白純度鑒定及其分子質(zhì)量測定

酶蛋白的純度鑒定及其分子質(zhì)量的測定參照文獻[9]開展，使用SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳法。電泳完成后，與標準蛋白質(zhì)條帶位置相比較，測算出甲醚菊酯降解酶蛋白的分子質(zhì)量。

1.9　甲醚菊酯降解酶特性研究

1.9.1酶促反應最適溫度測定將純化后的甲醚菊酯降解酶配制成0.01 mg/mL的液體，分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃恒溫水浴中保持60 min，然后根據(jù)1.5的方法測定酶活力，以酶活力最高值為基準，測算出各溫度下的相對活力[11]，相對活力最高值所對應的溫度即為酶促反應最適溫度。

1.9.2酶促反應最適pH值測定將純化后的甲醚菊酯降解酶配制成0.01 mg/mL的液體，用0.1 mol/L HCl或者NaOH分別調(diào)節(jié)pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，并保持60 min，然后按照1.5的方法測定酶活力，以酶活力最高值為基準，測算出各pH值下的相對活力[12]，相對活力最高值所對應的pH值即為酶促反應最適pH值。

1.9.3酶促反應動力學測定分別配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mmol/L的甲醚菊酯溶液，在最適條件下按照1.5的方法測定酶活力，以單位時間底物濃度[S]減少量計算出反應速率V。使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測算甲醚菊酯降解酶對底物的米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vmax。Lineweaver-Burk方程[11]如下所示：

2　結果與分析

2.1　甲醚菊酯降解菌XU-3菌落形態(tài)特征

采用平板劃線培養(yǎng)的方法從湖北省襄陽市農(nóng)藥廠下水道活性污泥中分離得到1株細菌XU-3，在30 ℃采用營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24 h后，可見其菌落形態(tài)為黃色、濕潤圓形略隆起、邊緣整齊，直徑2 mm左右。

2.2　甲醚菊酯降解菌XU-3生理生化特征及其16S rDNA鑒定結果

采用VITEK-32 全自動微生物鑒定儀分析菌株XU-3的形態(tài)和生理生化特性，結果見表1。從表1可以看出，菌株XU-3屬于革蘭氏陰性菌，短桿狀，其生化反應具有典型的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)特性。同時以菌株XU-3總DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物FT1和RK2進行PCR擴增，得到長度為836 bp的16S rDNA基因片段。測序后將XU-3的16S rDNA序列與GenBank上其他細菌的序列進行同源性比對，結果發(fā)現(xiàn)，該菌株的16S rDNA與陰溝腸桿菌BX273453.1菌株的同源性達98.0%。綜合菌株XU-3的形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA序列分析結果，將菌株XU-3鑒定為陰溝腸桿菌。

表1　菌株XU-3的形態(tài)和生理生化特性

注：+代表陽性，-代表陰性。

2.3　甲醚菊酯降解菌XU-3生長與降解酶活力的關系

采用添加50 mg/L甲醚菊酯作唯一碳、氮源的無機鹽培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)陰溝腸桿菌XU-3，測定不同時間段菌株生長和甲醚菊酯降解酶活力的關系。由圖1可以看出，甲醚菊酯降解酶的活力大小變化和菌株XU-3生長速度基本一致，都在60 h達到最大值。因此，用于制備甲醚菊酯降解酶的培養(yǎng)時間選擇60 h較為合適。

圖1　菌株XU-3生長與甲醚菊酯降解酶活力的關系

2.4　甲醚菊酯降解酶的純化

2.4.1DEAE-52纖維素柱層析20.0 mL粗酶液經(jīng)過DEAE-52柱層析后，具有甲醚菊酯農(nóng)藥降解活力的酶蛋白出現(xiàn)在餾分管的第20～40管(圖2)。DEAE-52柱層析后酶蛋白得到初步純化，將獲得的第20～40 管酶蛋白使用透析膜和聚乙二醇-20000進行除鹽和濃縮，共收集到濃縮后的酶液5.6 mL。

圖2　甲醚菊酯降解酶的DEAE-52纖維素柱層析結果

2.4.2CM-52纖維素柱層析5.6 mL DEAE-52濃縮后的酶液經(jīng)過CM-52柱層析后，具有甲醚菊酯農(nóng)藥降解活力的酶蛋白出現(xiàn)在餾分管的第25～45 管(圖3)。將第25～45 管的酶液使用透析膜和聚乙二醇-20000進行除鹽和濃縮，共收集到濃縮后的酶液2.2 mL。

圖3　甲醚菊酯降解酶的CM-52纖維素柱層析結果

2.4.3部分純化結果分析陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶經(jīng)過部分純化的結果見表2。結果顯示，最初陰溝腸桿菌XU-3中破碎得到的粗酶液總體積為20.0 mL，通過DEAE-52柱層析后，酶液總體積為5.6 mL，再通過CM-52柱層析后，酶液總體積為2.2 mL。甲醚菊酯降解酶經(jīng)過部分純化后，酶液的總體積降低，而其酶蛋白比活力上升，所以DEAE-52和CM-52柱層析對酶蛋白具有純化作用。最初酶的總蛋白質(zhì)量為12.4 mg，通過DEAE-52柱層析后，總蛋白質(zhì)量為2.6 mg，再通過CM-52柱層析后，總蛋白質(zhì)量為1.9 mg，酶蛋白得到了進一步的純化。酶總活力最初為189.4 U，通過DEAE-52柱層析后，總活力為146.8 U，再通過CM-52柱層析后，總活力為126.5 U。這表明，酶的總活力隨著純化過程會逐漸降低，主要是純化過程中回收率降低的原因。而酶的比活力是升高的，最初酶的比活力為15.2 U/mg，通過DEAE-52柱層析后，酶的比活力上升為56.5 U/mg，再通過CM-52柱層析后，酶的比活力上升為66.6 U/mg。綜合計算后，純化倍數(shù)為4.4，回收率為66.8%，相對而言酶蛋白的回收率較高[7]。

表2　菌株XU-3中甲醚菊酯降解酶的純化結果

2.5　甲醚菊酯降解酶的電泳分析

將純化的甲醚菊酯降解酶進行SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分析，從圖4可以看出，甲醚菊酯降解酶出現(xiàn)較為清晰的條帶，該條帶較粗，考馬斯亮藍染色較深，表明經(jīng)過純化的酶較為均一，酶蛋白量較豐富。根據(jù)SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳的酶分子質(zhì)量計算方法，陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶的分子質(zhì)量約為74.8 ku。

M.標準蛋白質(zhì)Marker；1—2.甲醚菊酯降解酶圖4　菌株XU-3中甲醚菊酯降解酶的SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分析

2.6　甲醚菊酯降解酶的特性

2.6.1酶促反應最適溫度將甲醚菊酯降解純化酶在不同溫度保持60 min后，對其酶活力進行了測定(圖5)。從圖5可以看出，酶促反應最適溫度為35 ℃，該酶在25～40 ℃時活力較為穩(wěn)定，相對酶活力可以達到60%以上。溫度對酶活力的影響體現(xiàn)在兩方面[12]。一方面，酶促反應速度隨溫度的升高而增加，主要原因是較高溫度有助于酶的分子構象改變，更容易和底物相結合。本研究中，溫度從20 ℃上升到35 ℃時，酶活力明顯增加。另一方面，當溫度升高到一定程度時，由于酶蛋白出現(xiàn)變性，酶活力會逐漸降低甚至完全消失。本研究中，溫度從35 ℃上升到60 ℃時，酶活力下降明顯，60 ℃時，相對酶活力僅為20%左右。綜合以上結果，陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶的最適反應溫度為35 ℃。

圖5　不同溫度處理對甲醚菊酯降解酶活力的影響

2.6.2酶促反應最適pH值酶液中pH值對酶活力的影響是多方面的[9]：可能改變酶蛋白分子構象，進而影響酶活力中心基團，使酶活力發(fā)生改變；也可能改變酶的解離狀態(tài)，一般來說，只有特定解離狀態(tài)最適合酶促反應。本研究將甲醚菊酯降解純化酶在不同pH值保持60 min后，對其酶活力進行了測定(圖6)。從圖6可以看出，酶促反應最適pH值為8.5，該酶在pH值7.5～9.0時活力較為穩(wěn)定，相對酶活力可以達到60%以上。由此可以推測，陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶是一種偏堿性水解酶，在偏堿性環(huán)境中可以發(fā)揮農(nóng)藥降解作用。當pH值低于8.5時，酶活力隨pH值降低而降低，在pH值5.0時，相對酶活力僅為20%左右。當pH值高于8.5時，酶活力隨pH值上升而降低，在pH值10.0時，相對酶活力不足25%。 綜合以上結果， 陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶的最適反應pH值為8.5。

圖6　不同pH值處理對甲醚菊酯降解酶活力的影響

2.6.3酶促反應動力學參數(shù)采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法對甲醚菊酯降解酶進行了酶促反應動力學測定，以酶促反應速度倒數(shù)1/V對底物濃度倒數(shù)1/[S]作圖，采用線性回歸方程來計算反應動力學相關參數(shù)。由圖7可以看出，甲醚菊酯降解酶對底物甲醚菊酯的降解作用符合米氏方程線性特征。其標準曲線的R2為0.994，表明線性擬合較好，可以用于反應動力學參數(shù)的計算。通過線性回歸方程計算后得到，Km為0.825 mmol/L，Vmax為0.748 mmol/(L·min)。

圖7　菌株XU-3中甲醚菊酯降解酶對底物作用的Lineweaver-Burk曲線

3　結論與討論

本研究采用平板劃線培養(yǎng)的方法從湖北省襄陽市農(nóng)藥廠下水道活性污泥中分離獲得了對甲醚菊酯有降解作用的細菌菌株XU-3，經(jīng)過VITEK-32全自動細菌鑒定儀分析，綜合其形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列分析結果，將其鑒定為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。陰溝腸桿菌XU-3可以生長于甲醚菊酯農(nóng)藥作為唯一碳、氮源的無機鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時間為60 h時，可以獲得最大量的甲醚菊酯降解酶，降解酶活力達到8.5 U/mL。隨后使用DEAE-52和CM-52陰陽離子交換層析柱對陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶進行了部分純化，經(jīng)檢測分析，純化了4.4倍，酶活力回收率為66.8%。使用SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，純化酶的分子質(zhì)量約為74.8 ku，屬于小分子質(zhì)量酶蛋白，后續(xù)研究中可以對其進行基因序列測定。本研究獲得純酶后，測定了酶促反應最適溫度、最適pH值及反應動力學等基本性質(zhì)，有助于甲醚菊酯降解酶的實際應用。測定結果表明，酶促反應最適溫度為35 ℃，最適pH值為8.5，在溫度25～40 ℃和pH值7.5～9.0內(nèi)，甲醚菊酯降解酶具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，該范圍和農(nóng)藥廠下水道的環(huán)境相匹配。酶促反應動力學測定表明，該降解酶對底物甲醚菊酯農(nóng)藥的Km為0.825 mmol/L，Vmax為0.748 mmol/(L·min)，說明該酶對甲醚菊酯的降解屬于正向反應，降解速度較快。研究該酶的純化特性也有助于更深入研究XU-3降解甲醚菊酯農(nóng)藥的機制，后續(xù)研究中可以探討其屬于水解作用、氧化作用還是礦化作用，并且可以研究其反應產(chǎn)物。

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