袁軍海，沈鳳英，吳偉剛，張愛香(河北北方學院 植物保護系，河北 宣化 075131)

葉銹病是我國小麥的重要病害，主要發(fā)生在小麥生長的中后期，因夏孢子堆的出現(xiàn)造成發(fā)病部位水分過度散失，最終導(dǎo)致小麥減產(chǎn)甚至死亡。小麥葉銹病的主要防治措施有種植抗病品種和噴灑化學藥劑。其中，種植抗病品種經(jīng)濟、有效、簡便且對環(huán)境安全，更易被種植者采用?；诿系聽栠z傳規(guī)律的經(jīng)典遺傳分析，可以明確抗病基因的顯隱性、對數(shù)和相互作用關(guān)系等，一直是培育抗病品種的理論基礎(chǔ)，但由于該分析一般需要3～4 a的時間，所以更適宜對重要材料進行深入研究。我國關(guān)于小麥抗葉銹病遺傳分析方面的研究始于20世紀90年代[1]，到目前為止，用于篩選分子標記的相關(guān)研究較多[2-3]，而真正較為深入的、傳統(tǒng)意義上的遺傳分析仍然很少[4]，難以對抗病育種形成系統(tǒng)的理論指導(dǎo)。川育19由中國科學院成都生物研究所選育，區(qū)試代號為46648-1，系譜為川育5號/墨460//綿陽26,屬春性、早熟品種，綜合農(nóng)藝性狀較好[5-6]。2003—2009年，分別在北京冬麥區(qū)接種優(yōu)勢致病類型、在張家口春麥區(qū)自然發(fā)病，多次進行抗病性測定發(fā)現(xiàn)，該品種對葉銹病一直表現(xiàn)為慢病。通過基因推導(dǎo)認為，川育19含有Lr1、Lr3和其他未知基因[7]。本試驗在此基礎(chǔ)上，結(jié)合等位性驗證，分別在苗期和成株期進行抗病性測定，對川育19的抗葉銹性進行了遺傳分析，以期為小麥抗葉銹病育種提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　試驗材料

小麥品種川育19最初由中國科學院成都生物研究所提供，小麥抗葉銹病近等基因系Lr1和Lr3的載體品系Tc*6/Centenario和Tc*6/Democrat最初由國際小麥玉米改良中心(CIMMYT)提供，感病對照品種為Thatcher；小麥葉銹病菌致病類型BGD/HL、FBC/GN、PHT/RP、SHJ/GL、THT/TP，從采自我國不同地區(qū)的小麥葉銹病標樣中分離鑒定而來，按照Long等[8]和Singh[9]提出的密碼規(guī)則命名。上述材料均由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所麥病組繁殖、保存并提供。

1.2　試驗方法

配制了Thatcher×川育19、Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19和Tc*6/Democrat(Lr3)×川育19共3個雜交組合。獲得F1代種子后，隨機選取6～8粒播種，花期套袋自交，6～8株所獲得的種子混合即為F2群體，再從中隨機選取180粒種子播種，每粒種子的后代作為1個F3株系。

苗期抗病性測定在小型塑料盒內(nèi)進行，預(yù)先放入營養(yǎng)土，種子穴播，穴深1 cm、穴距5 cm，每穴5～7粒種子。雜交親本川育19、Tc*6/Centenario(Lr1)、Tc*6/Democrat(Lr3)和Thatcher分別播種5～7粒種子，各雜交組合的F1和F2分別播種8粒和600粒種子，F(xiàn)3播種150個株系，每個株系約70粒種子。當小麥第一葉片充分展開時，先用清水去蠟，然后噴灑含0.05%吐溫20的夏孢子粉懸浮液，放入保濕桶內(nèi)，在室溫、黑暗條件下保濕約16 h，然后置于RXZ-280B型人工氣候箱(寧波江南儀器廠生產(chǎn))中培養(yǎng)，條件為：溫度18 ℃、相對濕度95%以上、光照強度12 000 lx，每天光照14 h。10～12 d后，當感病對照充分發(fā)病時，按照Roelfs[10]確定的侵染型標準，劃分為0、；、1、2、X、3、4等7個級別調(diào)查；若同時出現(xiàn)2種侵染型，則多者列前少者列后，如“;1”表示以“;”為主，還有少量“1”，根據(jù)前者判斷抗病或感病類型；X表示同時出現(xiàn)“；”、“1”、“2”、“3”和“4”等侵染型中的3個或3個以上類型。將7個級別轉(zhuǎn)換為抗感反應(yīng)，具體為0—免疫、；—近免疫、1—高度抗病、2和X—中度抗病、3—中度感病、4—高度感病，遺傳分析時 0～X歸為抗病類型，3～4歸為感病類型。由于工作量較大，F(xiàn)3僅判斷整個株系屬全部抗病、抗感分離或全部感病，未做單株調(diào)查。

成株期抗病性測定在河北北方學院南校區(qū)農(nóng)場進行。小區(qū)寬2.2 m、長11 m，行距0.333 3 m，即每小區(qū)34行，兩端為保護行，中間每隔10行設(shè)1行誘發(fā)行，其余30行為鑒定行。各鑒定行橫向分為3部分：左、右各1 m播種待鑒定材料，中間留出約0.2 m空間，與各鑒定行垂直方向，縱向播種1行誘發(fā)行。保護行和誘發(fā)行品種均為Thatcher。雜交親本均條播1行，行長1 m；各雜交組合播種量同苗期，但F1和F2均點播，株距10 cm，F(xiàn)3條播，每個株系行長1 m。小麥返青后拔節(jié)前，選擇晴天無風的傍晚，用致病類型PHT/RP和THT/TP的等比混合菌種接種。先在植株基部澆水至土壤含水量過飽和，然后將葉片用清水去蠟、噴灑含0.05%吐溫20的夏孢子粉懸浮液，最后蓋塑料膜保濕，次日日出前揭膜。管理同一般大田。待感病對照品種充分發(fā)病后，調(diào)查各植株旗葉的抗感反應(yīng)和嚴重度?？垢蟹磻?yīng)根據(jù)Roelfs[10]確定的侵染型標準調(diào)查后轉(zhuǎn)換為抗感反應(yīng)類型；嚴重度根據(jù)Peterson等[11]確定的方法估測，記為0～100%。

2　結(jié)果與分析

2.1　供試小麥品種(系)抗葉銹性測定

川育19在苗期對PHT/RP和THT/TP表現(xiàn)高度感病，對其他供試致病類型均表現(xiàn)免疫，在成株期表現(xiàn)感病，但嚴重度僅為5%～10%。在苗期，Lr1的載體品系Tc*6/Centenario對致病類型BGD/HL和FBC/GN，及Lr3的載體品系Tc*6/Democrat對BGD/HL和SHJ/GL，均表現(xiàn)為近免疫，其他組合均表現(xiàn)為高度感??；二者在成株期均表現(xiàn)為高度感病。Thatcher在苗期和成株期均表現(xiàn)為高度感病(表1)。

表1　供試小麥品種(系)抗葉銹性測定結(jié)果

2.2　川育19苗期抗葉銹病遺傳分析

對Thatcher×川育19雜交組合接種致病類型BGD/HL，8株F1均表現(xiàn)抗病，F(xiàn)2共測定523株，484株歸為抗病類型、39株歸為感病類型，符合15(抗病)∶1(感病)的期望比例，說明川育19對致病類型BGD/HL的抗病性由2對獨立遺傳的顯性抗葉銹病基因控制；F3共測定150個株系，其中58個株系全部抗病、80個株系抗感分離、12個株系全部感病，符合7(全部抗病)∶8(抗感分離)∶1(全部感病)的期望比例，可驗證F2的結(jié)果(表2)。對Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合接種致病類型BGD/HL，F(xiàn)2共測定517株，全部抗病，說明川育19含有Lr1，或群體尚小未出現(xiàn)感病植株。若為后者，則Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合至少含有4對獨立遺傳的顯性抗葉銹病基因，才能滿足517(抗病)∶0(感病)的分離情況，即川育19中至少含有3對顯性抗葉銹病基因，但這與相同情況下Thatcher×川育19雜交組合的分離情況不符合，故否定此可能性，認為川育19含有Lr1。同理可推斷川育19亦含有Lr3。綜合判斷，在Thatcher×川育19雜交組合中，控制對致病類型BGD/HL抗病性的2對顯性抗葉銹病基因是川育19所含有的Lr1和Lr3。

對Thatcher×川育19雜交組合接種致病類型FBC/GN，6株F1均抗病，F(xiàn)2的分離符合3(抗病)∶1(感病)的期望比例，說明川育19對FBC/GN的抗病性由1對顯性抗葉銹病基因控制，F(xiàn)3的分離情況可驗證上述結(jié)果(表2)。相同情況下對于Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合，538株F2全部抗病，同上述分析，可認為川育19含有Lr1。即在Thatcher×川育19雜交組合中，控制對致病類型FBC/GN抗病性的1對顯性抗葉銹病基因是Lr1。相同條件下，Tc*6/Democrat(Lr3)×川育19雜交組合的F2符合3(抗病)∶1(感病)的分離比例，考慮到FBC/GN對Lr3有毒性而對Lr1無毒性(表1)，故起作用的1對顯性抗葉銹病基因是川育19所含有的Lr1，否則，若川育19含有其他對FBC/GN有抗病作用的基因，則與相同情況下Thatcher×川育19雜交組合的分離情況無法相互驗證。同理可推斷，在Thatcher×川育19和Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合中，控制對致病類型SHJ/GL抗病性的1對顯性抗葉銹病基因均為川育19所含有的Lr3。

表2　川育19苗期抗葉銹病遺傳分析

2.3　川育19成株期抗葉銹病遺傳分析

對Thatcher×川育19雜交組合，6株F1均表現(xiàn)為中度抗病，且嚴重度均低于30%；F2共測定557株，其中65株中度抗病、228株中度感病至感病，且嚴重度均低于30%，可歸為抗病類型，20株中度感病至感病，且嚴重度為31%～60%，考慮到在生產(chǎn)上尚有一定應(yīng)用價值，也歸為抗病類型，其余188株中度感病至感病及56株感病，且嚴重度均高于60%，可歸為感病類型，313株抗病、244株感病，符合9(抗病)∶7(感病)的期望比例，說明在Thatcher×川育19雜交組合中，成株期的抗病性由2對互補遺傳的顯性抗葉銹病基因控制；根據(jù)上述F2的抗病與感病的分界線判斷，F(xiàn)3有13個株系全部抗病、77個株系抗感分離、60個株系全部感病，符合1(全部抗病)∶8(抗感分離)∶7(全部感病)的期望比例，可驗證F2的結(jié)果(表3)。

表3　川育19成株期抗葉銹病遺傳分析

注：S.感??；MS-S.中度感病至感病。

對Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合，5株F1均表現(xiàn)為中度抗病，除1株嚴重度為31%～60%外，其余4株均低于30%；根據(jù)上述分析確定的F2的抗感分界線判斷，F(xiàn)2有317株抗病、225株感病，符合9(抗病)∶7(感病)的期望比例；F3有5個株系全部抗病、75個株系抗感分離、70個株系全部感病，也符合1(全部抗病)∶8(抗感分離)∶7(全部感病)的期望比例。說明Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合在成株期的抗病性亦由2對互補遺傳的顯性抗葉銹病基因控制，與Thatcher×川育19雜交組合相同，同時也說明在Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合中，抗病性由川育19提供，Tc*6/Centenario(Lr1)的抗病性在成株期不起作用，可驗證表1結(jié)果。同理，Tc*6/Democrat(Lr3)×川育19雜交組合在成株期的抗病性也由川育19提供的2對互補遺傳的顯性抗葉銹病基因控制，Tc*6/Democrat(Lr3)的抗病性在成株期亦不起作用。

3　結(jié)論與討論

川育19含有呈顯性遺傳的Lr1和Lr3，在苗期分別控制對致病類型FBC/GN和SHJ/GL的抗病性，且2對基因相互獨立遺傳，均控制對致病類型BDG/HL的抗病性；Lr1和Lr3的抗病性在成株期不起作用，川育19的成株期抗病性由2對互補遺傳的顯性抗葉銹病基因控制。

Lr1和Lr3在我國小麥品種中的出現(xiàn)頻率分別約為13.42%和9.17%[12]。由于較早的、廣泛性的應(yīng)用，導(dǎo)致病原物中相應(yīng)的毒性基因頻率上升，反過來克服抗病基因的抗病性，故Lr1和Lr3在我國早已經(jīng)失效。我國首次正式報道小麥葉銹菌群體毒性時，Lr1和Lr3的毒性頻率已分別達到30.02%和89.10%[13]，而在近期的許多報道中，二者均已達95%以上[14-15]。美國的情況也很相似[16]。但與合適的基因組合起來，Lr1和Lr3尚可發(fā)揮“殘存”的抗病性，提高整體抗病能力。如Lr1和Lr34在成株期的抗病性分別為90S和T-20M(T表示微量侵染型，M表示混合侵染型，分別與本研究中的近免疫侵染型“；”和中度抗病侵染型“X”近似)，將二者組合在同一品系中抗病性為T-5M[17]；Lr1、Lr3和Lr13在成株期的抗病性分別為80S、70S和60MR(MR表示中度抗病)，而Lr1和Lr13組合起來的抗病性為20MR-30MS，Lr3和Lr13組合起來的抗病性為10MR[18]。

在已正式命名的抗葉銹病基因中，僅Lr27和Lr31呈顯性遺傳且互補起作用[19-20]。陳萬權(quán)等[21]用我國葉銹菌優(yōu)勢致病類型測定發(fā)現(xiàn)，Lr27+Lr31在成株期出現(xiàn)0(免疫)和65S 2種情況，懷疑是種子混雜所致，但在許多關(guān)于小麥葉銹菌群體毒性分析中，Lr27+Lr31的毒性頻率均在60%以上[15,21-22]，故65S的鑒定結(jié)果更可信，說明Lr27+Lr31的抗病性在我國已基本失效。而川育19在成株期的表現(xiàn)為5～10S，僅后期出現(xiàn)少量感病孢子堆，前期接近免疫，說明其抗病性仍比較有效。當然，也可能出現(xiàn)Lr27+Lr31與Lr13或Lr34等基因互作提高抗病性的情況，但若如此，川育19在成株期的抗病性應(yīng)呈現(xiàn)3對及3對以上抗病基因分離的情況。所以，川育19中控制成株期抗病性的2對互補遺傳的顯性抗葉銹病基因更可能是新基因。

抗感分界線的劃分是遺傳分析的關(guān)鍵之一。本試驗的苗期結(jié)果，明顯分為2部分，分別與抗病親本和感病親本的侵染型接近，沒有中間類型，或中間類型很少，且考慮到所有可能的期望比例后，劃歸抗病類型或感病類型均對最終結(jié)果無影響，直接根據(jù)F2即可判斷抗感分界線。但成株期的結(jié)果，中間類型較多，如果仍僅根據(jù)F2判斷，可能存在多個抗感分界線，能夠分別符合各自的期望比例。對此，楊作民[23]認為，根據(jù)F3系統(tǒng)的不同分離情況反過來劃分F2單株類別，才是較合理的做法，這也是本試驗進行抗感分界線劃分時遵循的基本原則。

致謝：中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所的劉太國研究員和馮晶副研究員參與部分工作，謹此致謝！

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