,　,　,　,,

單增李斯特菌(L.monocytogenes)是一種革蘭陽(yáng)性、兼性厭氧的食源性致病菌，廣泛分布于自然界，常見(jiàn)于生冷食品中[1]。它主要通過(guò)污染食品使老年人、孕婦、新生兒和免疫力低下等易感人群感染，并誘發(fā)敗血癥、腦膜炎、早產(chǎn)甚至死亡等嚴(yán)重病發(fā)癥[2]。因此，簡(jiǎn)單、快速、敏感和特異的檢測(cè)方法對(duì)李斯特菌的監(jiān)測(cè)尤為重要。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法是檢測(cè)單增李斯特菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但其過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)[3]。隨后，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、多重PCR和熒光定量PCR等雖優(yōu)于分離培養(yǎng)方法，但仍然耗時(shí)、繁瑣且受昂貴實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的限制[4-5]。相比于PCR方法，恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法克服了以上劣勢(shì)并且能夠在野外、臨床和實(shí)驗(yàn)室中高效地檢測(cè)目的病原菌[6]。多交叉置換擴(kuò)增(MCDA)是本實(shí)驗(yàn)室近期建立的一種新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[7]，它能夠在恒溫(60～67 ℃)條件下、1 h內(nèi)快速、敏感和特異地?cái)U(kuò)增核酸，明顯提高了檢測(cè)效率。

在本實(shí)驗(yàn)中，以單增李斯特菌種特異性基因lmo0733為靶標(biāo)，應(yīng)用MCDA方法建立了一個(gè)快速、敏感和有效的診斷方法，并驗(yàn)證了該方法的特異性和敏感性。同時(shí)與LAMP和CPA方法進(jìn)行了檢測(cè)閾值的比較，評(píng)價(jià)了本方法對(duì)實(shí)際樣本的檢測(cè)能力。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株55株單增李斯特菌和28株非單增李斯特菌被用于本研究，見(jiàn)表1。所有菌株使用前在腦心浸液(BHI)瓊脂平板37 ℃過(guò)夜生長(zhǎng)。

1.1.2試劑與儀器FRASER BROTH BASE、BRILLIANCETMLISTERIA AGAR BASE培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；API Listeria生化試劑條購(gòu)自法國(guó)bioMérieux公司；腦心浸液購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒(Bacteria Gene DNA kit)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL100DNA Marker購(gòu)自大連寶生物公司；Loopamp○RDNA反應(yīng)試劑盒與Loopamp○R熒光檢測(cè)試劑購(gòu)自北京葵沫生物科技有限公司。凝膠成像系統(tǒng)(GEL Doc2000)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；Loopamp○R實(shí)時(shí)濁度儀LA-320C購(gòu)自于榮研生物科技(中國(guó))公司；引物合成由北京擎科生物科技公司完成。

表1本研究所使用的菌株
Tab.1Bacterial strains used in this study

aU，未知血清型；bATCC，美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；NCTC，國(guó)際生物品收藏中心；ICDC，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。

aU,unidentified serotype.bATCC, American Type Culture Collection; NCTC, National Collection of Type Cultures; ICDC, National Institude for Communicatable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention.

1.1.3DNA模板制備細(xì)菌基因組按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，制備好的菌株DNA模板保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)本研究單增李斯特菌EGD-e菌株的lmo0733基因(Genbank number: NC_003210.1)作為檢測(cè)靶標(biāo)，使用PRIMERPRIMER 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，序列見(jiàn)表2。

1.2.2單增李斯特菌-MCDA檢測(cè)MCDA反應(yīng)體系為25 μL：F1和F2引物各0.4 mmol/L，C1和C2引物各0.8 μmol/L，R1、R2、D1和 D2引物各1.2 μmol/L，CP1和CP2引物各2.4 μmol/L，2×reaction mix 12.5 μL，Loopamp熒光檢測(cè)試劑12.5 μL，BstDNA聚合酶(10U)1.25 μL，DNA模板1 μL。MCDA產(chǎn)物采用三種方法判斷結(jié)果：熒光染料的顏色變化觀察、瓊脂糖凝膠電泳和Loopamp 實(shí)時(shí)熒光濁度儀LA-320C(Eiken Chemical Co., Ltd, Japan)濁度檢測(cè)。

表2本研究使用的單增李斯特菌-MCDA引物
Tab.2L. monocytogenes-MCDA primers used in this study

引物Primers序列Sequence(5′?3′)長(zhǎng)度LengthCP1ACAGTCCTTGCTCCCATTTAGA?AGAAAT?TGCCATCAAACTGAA43merCP2GCTTGAAACACCAGTAAGCACT?TTCG?GAAATTGCTTTTACATCA44merF1AAATCAAAAGGACTTTCGCA20ntF2CAAACTGTAAGTTTATAATCTCCAG25ntC1ACAGTCCTTGCTCCCATTTAGA22ntD1GATTGTTTGTCGCACCACA19ntR1ATATCGGAATCAGGAACTG19ntC2GCTTGAAACACCAGTAAGCACT22ntD2CTTGGAGAAACTGTTATGGT20ntR2GTTAATCTCCATATCGGAAGT21ntP1AGAAATTGCCATCAAACTGAA21ntP2TTCGGAAATTGCTTTTACATCA22nt

單增李斯特菌-MCDA最佳反應(yīng)條件確定：分別在60 ℃～67 ℃ 8個(gè)溫度下恒溫?cái)U(kuò)增1 h，然后95 ℃加熱5 min后終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)使用單增李斯特菌EGD-e作為陽(yáng)性對(duì)照，豬鏈球菌(革蘭陽(yáng)性菌)和腸侵襲性大腸桿菌(革蘭陰性菌)作為陰性對(duì)照，蒸餾水作為空白對(duì)照，各取1 μL DNA模板用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3單增李斯特菌-MCDA方法的特異性和敏感性驗(yàn)證55株單增李斯特菌和28株非單增李斯特菌株(表1)用于確認(rèn)MCDA方法的特異性。

將EGD-e 菌株DNA進(jìn)行倍比稀釋(10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg)來(lái)評(píng)估MCDA方法的檢測(cè)下限。每個(gè)反應(yīng)需1 μL稀釋好的模板，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)兩次。同時(shí)比較MCDA、LAMP和CPA三種方法的敏感性。其中單增李斯特菌-LAMP和單增李斯特菌-CPA檢測(cè)下限值來(lái)自參考文獻(xiàn)[6, 8]。

1.2.4MCDA、LAMP、CPA和PCR方法對(duì)鼠糞便增菌培養(yǎng)物的檢測(cè)能力比較本實(shí)驗(yàn)室另一項(xiàng)研究中使用ISO11290-1方法[6]對(duì)153份鼠腸道糞便進(jìn)行了單增李斯特菌檢測(cè)，結(jié)果為24份單增李斯特菌陽(yáng)性，129份為單增李斯特菌陰性(結(jié)果未發(fā)表)。將該研究中153份糞便標(biāo)本在Fraser培養(yǎng)基中的增菌培養(yǎng)物1 mL提取DNA(100 ℃金屬浴10 min)，同時(shí)使用針對(duì)單增李斯特菌的MCDA、LAMP、CPA 和PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。其中LAMP、CPA和PCR的操作方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6, 8-9]。

2　結(jié)　果

2.1單增李斯特菌-MCDA檢測(cè)引物該方法共5對(duì)引物，其引物特異性通過(guò) NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 驗(yàn)證，具體信息見(jiàn)表2。

2.2單增李斯特菌-MCDA產(chǎn)物的檢測(cè)與驗(yàn)證陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果如圖1A和1B。在擴(kuò)增反應(yīng)60 min后，產(chǎn)物顏色由亮灰色變?yōu)榫G色；在2%的瓊脂糖凝膠電泳上顯示為典型的階梯狀分布圖像。僅單增李斯特菌分離陽(yáng)性的反應(yīng)管出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，而空白對(duì)照和陰性對(duì)照無(wú)上述現(xiàn)象。最佳反應(yīng)溫度，本研究的其它評(píng)估檢測(cè)均在此溫度下進(jìn)行。

(A)單增李斯特菌MCDA反應(yīng)管的顏色變化：1，陽(yáng)性擴(kuò)增；2、3和4分別為陰性對(duì)照(豬鏈球菌和侵襲性大腸桿菌)和空白對(duì)照。(B)單增李斯特菌MCDA產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果：1，單增李斯特菌擴(kuò)增產(chǎn)物；2，豬鏈球菌(陰性對(duì)照)擴(kuò)增產(chǎn)物；3，侵襲性大腸桿菌(陰性對(duì)照)擴(kuò)增產(chǎn)物；4，空白對(duì)照；M，100 bp DNA marker。(A) Color change of the L. monocytogenes-MCDA tubes; tube 1, positive amplification; tube 2, 3, 4, negative control (Streptococcus suis), negative control (Enteroinvasive E. coli) and blank control, respectively. (B) 2% agarose gel electrophoresis of the lmo0733-MCDA products; lane 1, MCDA products of L. monocytogenes; lane 2, MCDA products of Streptococcus suis (negative control); lane 3, MCDA products of Enteroinvasive E. coli (negative control); lane 4, blank control; lane M, DNA marker DL 100 bp.圖1　MCDA產(chǎn)物的驗(yàn)證和鑒定Fig.1　Verification and identification of MCDA products

2.3單增李斯特菌-MCDA方法的最佳擴(kuò)增溫度如圖2所示，61 ℃為單增李斯特菌MCDA方法的

2.4單增李斯特菌-MCDA方法特異性和敏感性特異性評(píng)估如圖3所示，單增李斯特菌株均為陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果(在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)典型階梯狀分布圖像)，非單增李斯特菌為陰性結(jié)果。單增李斯特菌-MCDA方法的敏感度評(píng)估結(jié)果如圖4所示，MCDA的檢測(cè)下限為10 fg/反應(yīng)，其中10 ng、10 pg和10 fg濃度的核酸模板分別于12、15和24 min反應(yīng)時(shí)間即可檢測(cè)到。

通過(guò)已有文獻(xiàn)報(bào)道和本研究方法的敏感度檢測(cè)，LAMP、CPA和MCDA方法對(duì)lmo0733 的檢測(cè)下限分別為250 fg/反應(yīng)、2.5 pg/反應(yīng)和 10 fg/反應(yīng)[11, 14]。

2.5MCDA、LAMP、CPA和PCR方法對(duì)鼠糞便標(biāo)本增菌培養(yǎng)物的檢測(cè)比較檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。MCDA的檢測(cè)能力優(yōu)于LAMP、CPA和PCR方法，其分離結(jié)果與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)得出的24份陽(yáng)性分離株一致。

表4MCDA、LAMP、CPA和PCR方法對(duì)鼠糞便標(biāo)本增菌培養(yǎng)物的檢測(cè)
Tab.4Identification of L. monocytogenes for the rat feces samples by MCDA, LAMP, CPA and PCR methods

No．ofL．monocytogenespositivesamples(陽(yáng)性樣本數(shù))PCRCPALAMPMCDASecondenrichmentbrothsample?(二次增菌液樣本)1281724

*153份老鼠腸道糞便增菌液樣本，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法檢測(cè)為24份單增李斯特菌陽(yáng)性。

*24L.monocytogenespositive second enrichment broth samples were come from the 153 rat intestinal feces samples based on culture-biotechnical method.

MCDA反應(yīng)通過(guò)實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)進(jìn)行分析，并顯示相應(yīng)的DNA濃度曲線。閾值> 0.1視為陽(yáng)性擴(kuò)增。在不同溫度(60-67 ℃)下獲得8個(gè)動(dòng)力學(xué)圖(A-H)，每個(gè)反應(yīng)中模板為1 pg，A到F圖顯示出良好的擴(kuò)增。The MCDA reactions were analyzed by means of real-time turbidity detection and the corresponding curves of DNA concentrations were shown in the figure. The threshold value of >0.1 was regarded to be positive. Eight kinetic graphs (A-H) were obtained at different temperature (60-67 ℃)with L. monocytogenes DNA at the level 1 pg per reaction and from A to F graphs displayed robust amplification.圖2　MCDA方法的最佳反應(yīng)溫度Fig.2　The optimal temperature for MCDA assay

(A1-4)實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)圖及相應(yīng)DNA濃度曲線　閾值>0.1視為陽(yáng)性擴(kuò)增。(B1-4)2%瓊脂糖凝膠電泳成像圖，陽(yáng)性擴(kuò)增為典型階梯圖像　1-12，單增李斯特菌血清型1/2a(EGD-e)、1/2a(ATCC51772)、1/2b(ATCC-BAA-2658)、1/2c(ATCC51779)、3a(ATCC51782)、3b(ICDC)、4a(ATCC19114)、4b(ATCC19115)、4c(ATCC19116)、4d(ATCC19117)、4e(ATCC19118)、7(NCTC10890)；13-17，其它李斯特菌參考菌株-綿羊李斯特菌(ATCCBAA-678)、威爾李斯特菌(ATCC35897)、英諾克李斯特菌(ATCC-BAA-680)、格氏李斯特菌(ATCC25402)、西爾李斯特菌(ATCC35967)；18-32，豬鏈球菌、糞鏈球菌、腸球菌、肺炎鏈球菌、副傷寒沙門(mén)菌，類志賀鄰單胞菌、腸桿菌、普通變形桿菌、志賀菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腸聚集性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌。M，DL100-bp DNA marker。(A1-4) Specificity of L. monocytogenes-MCDA was detected by real-time measurement of turbidity and the corresponding curves of DNA concentrations were shown in figure. The threshold value of >0.1 was considered to be positive. (B1-2) The positive products of MCDA were able to produce a ladder-like pattern by 2% agarose gel eletrophoresis. Line (lane) 1-12, L. monocytogenes of serovar 1/2a (EGD-e),1/2a(ATCC51772),1/2b (ATCC-BAA-2658), 1/2c(ATCC51779),3a(ATCC51782),3b(ICDC),4a(ATCC19114), 4b(ATCC19115), 4c(ATCC19116), 4d(ATCC19117), 4e(ATCC19118), 7(NCTC10890); line(lane) 13-17, other Listeria reference strains of L. ivanovii(ATCCBAA-678), L. welshimeri(ATCC35897), L. innocua(ATCC-BAA-680), L. grayi(ATCC25402), L. seeligeri(ATCC35967); line(lane), 18-32, non-Listeria strains of Streptococcus suis, Streptococcus faecalis, Streptococcus oralis, Enterobacter cloacae, Streptococcus pneumoniae, Salmonella paratyphi, Plesiomonasshigelloides, Enteric bacilli, Proteusbacillus vulgaris, Shigelladysenteriae, Enteropathogenic E. coli, Enterotoxigenic E. coli, Enteroaggregative E. coli, Enteroinvasive E. coli, Enterohemorrhagic E. coli. Lane M, DL100-bp DNA maker.圖3　不同菌株驗(yàn)證單增李斯特菌-MCDA方法特異性Fig.3　Specificity of L. monocytogenes-MCDA detection for different strains

(A)敏感性實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)圖。MCDA方法的檢測(cè)下限為10 fg/反應(yīng)。(B) lmo0733-MCDA敏感性驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳圖，陽(yáng)性擴(kuò)增為典型階梯圖像。1，DL 100 bp DNA marker；2-6, EDG-e DNA濃度分別為10 ng、10 pg、10 fg、1 fg、0.1 fg；7，陰性對(duì)照(豬鏈球菌)；8，陰性對(duì)照(腸侵襲性大腸桿菌)；9，空白對(duì)照。(A) Sensitivity of lmo0733-MCDA was detected by real-time measurement of turbidity. The LoD for MCDA assay was 10 fg genomic DNA per reaction. (B)Sensitivity of lmo0733-MCDA was detected by 2% agrose gel electrophoresis and positive products produced a ladder-like pattern. Lane 1, DL 100-bp DNA marker. 2-6, 10 ng, 10 pg, 10 fg, 1 fg, 0.1 fg of EDG-e DNA; Lane 7, negative control (Streptococcus suis); Lane 8, negative control (Enteroinvasive E.coli), Lane 9, blank control.圖4　使用連續(xù)倍比稀釋的單增李斯特菌EGD-e DNA模板驗(yàn)證lmo0733-MCDA方法的敏感性Fig.4　Sensitivity of lmo0733-MCDA assays using serially diluted genomic DNA with L. monocytogenes strain EGD-e as template

3　討　論

本研究以單增李斯特菌種特異性基因lmo0733為靶標(biāo)，建立了一種快速、敏感和特異的多交叉置換擴(kuò)增(MCDA)檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便，僅需在61 ℃維持恒溫1 h。單增李斯特菌-MCDA方法的敏感度為10 fg，分別是LAMP和CPA方法的25倍和250倍[6, 8]。同時(shí)，該方法的高敏感度也在實(shí)際標(biāo)本應(yīng)用評(píng)價(jià)中得到了驗(yàn)證。153份鼠糞便標(biāo)本增菌培養(yǎng)物樣本中，MCDA方法的檢測(cè)能力優(yōu)于LAMP、CPA和PCR方法，其檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法一致(24份單增李斯特菌陽(yáng)性)，且僅需2次增菌液的水煮模板即可檢測(cè)。

此外，該方法具有良好的特異性。單增李斯特菌檢測(cè)的靶基因通常是hlyA和iap[12, 16-17]，但它們并非單增李斯特菌所特有，也存在于綿羊李斯特菌和希爾李斯特菌[2-3]。本研究靶標(biāo)lmo0733是單增李斯特種特異性基因，并且在83株菌特異性評(píng)估中也成功地被驗(yàn)證。因此，單增李斯特菌-MCDA方法能夠方便、快速、有效的檢測(cè)單增李斯特菌。

本研究可用于食品行業(yè)、臨床標(biāo)本中單增李斯特菌的檢測(cè)，為監(jiān)測(cè)和預(yù)防控制提供技術(shù)支持。

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