周月明，雷陽(yáng)明，夏家?guī)?，任春?/p>

（1.中國(guó)科學(xué)院　重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶　400714；2.重慶大學(xué)　城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶　400044；3.重慶工商大學(xué)　環(huán)境與資源學(xué)院，重慶　400067）

近年，農(nóng)業(yè)正朝著集約化和規(guī)?；姆较虬l(fā)展，破壞了傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)已有的廢棄物循環(huán)利用模式，形成了大量隨意堆積的農(nóng)業(yè)廢棄物，主要包括家畜糞尿、果皮、菜葉、秸稈等[1-2]，其中作物秸稈就地焚燒，畜禽糞便與腐爛果蔬隨意丟棄，既污染環(huán)境，又浪費(fèi)資源[3-4]。堆肥化技術(shù)即利用微生物的轉(zhuǎn)化作用，將這些廢物轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)豐富的土壤肥料，具有效率高、成本低、污染低等多方面優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為重要的農(nóng)業(yè)廢物資源化利用技術(shù)之一[5]。

秸稈、糞便等廢物中含有大量木質(zhì)素及纖維素類物質(zhì)，此類物質(zhì)由β-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，鍵與鍵之間化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且氫鍵和非共價(jià)鍵連接構(gòu)成微纖絲，微纖絲有規(guī)律地排列成空間結(jié)構(gòu)，這種長(zhǎng)期進(jìn)化出的復(fù)雜結(jié)構(gòu)可以保護(hù)植物的整體性，也增加了纖維素類物質(zhì)的難降解性，阻礙堆肥化進(jìn)程[6]。

通過(guò)添加纖維素降解菌劑，使基質(zhì)中的微生物協(xié)同作用，產(chǎn)生大量纖維素降解酶，將秸稈以及柑橘渣中的纖維素類物質(zhì)降解，轉(zhuǎn)化為易于植物吸收的小分子多糖，提高堆肥產(chǎn)品質(zhì)量。

李瑞鵬[7]以秸稈與奶牛場(chǎng)廢棄物為堆肥原料，通過(guò)60 d的堆肥處理，產(chǎn)品達(dá)到無(wú)害化要求，50℃持續(xù)時(shí)間10 d，高溫有利于堆肥產(chǎn)品的腐熟，并且不同處理組中纖維素酶活性隨堆肥反應(yīng)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，最大值達(dá)到27.1 U，這與溫度變化趨勢(shì)基本一致，另外，堆肥物料有機(jī)碳的降解和熱值減少亦呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)[8]。

田偉[9]以牛糞與秸稈為堆肥原料，在112 d的堆肥周期內(nèi)，水分、揮發(fā)性固體物質(zhì)、全碳的含量均逐漸降低，并且都在前42 d降低的幅度最大，這與有機(jī)質(zhì)損失率的研究結(jié)果相一致，在前42 d有機(jī)質(zhì)的損失最多，達(dá)到了43.8%。在堆肥第42 d纖維素酶的酶活達(dá)到最大值85.7 U之后有所降低，在整個(gè)高溫階段，纖維素酶的酶活均處于較高水平。進(jìn)入降溫階段后，由于纖維素被大量分解，纖維素酶的酶活也逐漸下降，纖維素的降解趨勢(shì)與堆肥化進(jìn)程基本一致[10]。

本文以秸稈、柑橘渣以及動(dòng)物糞便為堆肥原料，通過(guò)考查溫度、pH、含水率、水溶性有機(jī)碳、總養(yǎng)分等指標(biāo)的變化規(guī)律，綜合評(píng)價(jià)堆肥化進(jìn)程；并且探索堆肥化過(guò)程中總纖維素含量與酶活性變化的相關(guān)性，找到影響堆肥品質(zhì)的因素以及纖維素降解的關(guān)鍵酶，為農(nóng)業(yè)廢棄物快速資源化利用提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)原料：秸稈、收集自重慶市榮昌縣高田村的糞便及采自附近某小型柑橘榨汁廠的柑橘皮渣。堆肥菌劑：如金菌劑（北京康源綠洲有限公司），主要成分為釀酒酵母及植物乳桿菌等。原料主要成分見(jiàn)表1。

表1　堆肥原料主要成分Table 1　Main ingredients of compost material

DNS試劑：稱取3，5-二硝基水楊酸（C7H4N2O7）7.3 g，置于1 000 mL燒杯中，加600 mL蒸餾水，逐漸加入氫氧化鈉（NaOH）10.0 g，在50℃水浴中攪拌溶解，再依次加入酒石酸鉀鈉（C4O6H4KNa） 192.0 g，苯酚（C6H5OH） 2.5 g，無(wú)水亞硫酸鈉（Na2SO3）5.0 g，混勻，冷卻至室溫，定容至1 000 mL，過(guò)濾，于棕色瓶中保存，暗處放置7天后使用。

中性洗滌劑：稱取乙二胺四乙酸二鈉（EDTA·2H2O）18.6 g和硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）6.8 g，放入1 000 mL燒杯中，加200 mL蒸餾水，加熱溶解，依次加入十二烷基磺酸鈉（C12H25NaO4S）30 g和乙二醇乙醚（C4H10O2）10 mL，再稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4）4.56 g，于另一燒杯中，加入200 mL蒸餾水微熱溶解，將兩燒杯內(nèi)液體混合，定容至1 000 mL，pH范圍為6.9～7.1，一般不需要調(diào)節(jié)pH。

釩鉬酸銨試劑：A液，稱取25.0 g鉬酸銨溶于400 mL水中；B液，稱取1.25 g偏釩酸銨溶于300 mL沸水中，冷卻后加250 mL硝酸，冷卻。邊攪拌邊將A液緩緩注入B液中，用水稀釋至1 L，混勻，貯于棕色瓶中。

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將秸稈切成5 cm小段，秸稈與糞便、柑橘皮渣質(zhì)量按照4∶1∶5比例混勻，添加菌劑，控制含水率在60%左右。試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理，接種菌劑（A組），不接種菌劑（B組）處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。添加菌劑處理按照菌料質(zhì)量比1∶1000（w/w）添加菌劑，各處理將發(fā)酵原料置于500×400×300塑料整理箱中，整理箱四壁均勻分布孔徑80 mm圓孔，用于通風(fēng)，每天中午12點(diǎn)測(cè)定堆體中心溫度，在中溫及高溫階段，每2 d翻堆一次，在降溫階段，每3 d翻堆一次，共持續(xù)40 d。分別于第0 d，3 d，12 d，20 d，30 d，40 d取樣，測(cè)定羧甲基纖維素 酶（Carboxymethyl Cellulase,CMCase）， 漆 酶（Laccase），濾紙酶（Filter Paper Lyase,FPase）活性，總纖維素（Total Fiber，TF），總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O），微生物數(shù)量，pH與含水率等指標(biāo)。

1.3　測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1　粗酶液制備

取10 g堆肥樣品浸入100 mL蒸餾水中，震蕩培養(yǎng)4 h，靜置30 min，隨后用紗布過(guò)濾，于4℃，8 000 r/min的離心機(jī)內(nèi)離心20 min，取上清液作為粗酶液，測(cè)量其酶活性[11]。酶活性測(cè)定中，每個(gè)試驗(yàn)處理均設(shè)置以蒸餾水代替粗酶液的對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2　漆酶活性（Laccase）

以2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（C18H24N6O6S4，ABTS）為底物。取2.5 mL濃度為0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 5.0）和0.3 mL濃度為1 mmol/L的ABTS置于比色管中，另取酶液0.2 mL，組成3 mL反應(yīng)體系，反應(yīng)15 min。于λ=420 nm處測(cè)吸光度值。酶活性定義：每分鐘氧化1μmol ABTS所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，單位為U。氧化產(chǎn)物的消光系數(shù)為3.6×104mol/（L·cm）[5]。

1.3.3　濾紙酶活性（FPase）

稱取30 mg剪碎的濾紙，置于比色管中，依次加入0.8 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.8）和0.2 mL粗酶液。混勻后，置于50℃恒溫水浴鍋中，反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫，加入0.5 mL DNS顯色劑，置于沸水浴中5 min，取出冷卻至室溫，加蒸餾水定容至10.0 mL，在540 nm處測(cè)吸光度[12]。酶活性定義：每分鐘水解濾紙產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位，單位為U。

1.3.4　羧甲基纖維素酶（CMCase）

以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液為底物，取2 mL底物溶液于10 mL比色管中，加入粗酶液0.5 mL，50℃水浴反應(yīng)30 min，再加入3 mL DNS試劑，置于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，定容至10 mL，540 nm下測(cè)定吸光度[13]。酶活性定義：每分鐘水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位，單位為U。

1.3.5　總纖維素含量（Total Fiber，TF）

準(zhǔn)確稱取1.0 g干樣品記為W，置于直筒燒杯中，分別加入100 mL中性洗滌劑，0.5 mL十氫化萘，0.5 g無(wú)水亞硫酸鈉，將燒杯套上冷凝裝置，置于電爐上，盡快煮沸，后保持微沸60 min，注意加水保持刻度在100 mL，煮沸完畢，取下直筒燒杯，將燒杯中的殘?jiān)恳迫氩Ａ靶韭┒?，以沸水沖洗漏斗內(nèi)殘?jiān)?，直到濾液為中性。用20 mL丙酮沖洗并抽濾。將玻璃砂芯漏斗置于105℃烘箱中烘4 h后，在干燥器中冷卻30 min后稱重，直至衡重W1。稱重后，將玻璃砂芯漏斗放入馬弗爐中，550℃灰化3 h，在干燥器中冷卻30 min后再次稱重W2。

總纖維素含量計(jì)算公式如下：

1.3.6　pH

稱取鮮樣品10.0 g，置于含有90 mL無(wú)菌水的無(wú)菌干燥錐形瓶中，在120 r/min搖床中震蕩30 min，后靜置10 min，用pH計(jì)測(cè)定過(guò)濾后浸提液的pH。

1.3.7　水溶性有機(jī)碳（WSC）

前處理同節(jié)1.3.1，所得粗酶液即為WSC測(cè)定母液，稀釋至適當(dāng)濃度后用總有機(jī)碳分析儀測(cè)定水溶性有機(jī)碳含量[9]。

式中：C為提取液中有機(jī)碳濃度；單位為mg/g；G為樣品中水溶性有機(jī)物的原始濃度，單位為mg/g；W為固體質(zhì)量，單位為g；K為吸著系數(shù)，單位為L(zhǎng)/g；V為水相體積，單位為L(zhǎng)。

1.3.8　總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O）

（1）采用凱氏定氮儀測(cè)定N含量

將樣品置于CuSO4，K2SO4，H2SO4的混合溶液中消解、稀釋、過(guò)濾。將稀釋液進(jìn)行蒸餾，收集蒸餾產(chǎn)生的NH3，并溶于H3BO3溶液中，最后通過(guò)滴定H3BO3溶液來(lái)計(jì)算樣品中N的含量[5]。

（2）采用H2SO4-H2O2消煮—釩鉬酸銨比色法測(cè)定P2O5含量

取試樣1.0 g，加5 mL優(yōu)級(jí)純硫酸和1.5 mL 30%過(guò)氧化氫溶液，搖勻，瓶口放一彎頸小漏斗，放置過(guò)夜。在電爐上緩慢升溫至硫酸冒煙，取下稍冷卻，加15滴過(guò)氧化氫溶液，加熱10 min，稍冷后再加5～10滴過(guò)氧化氫溶液并分次消煮，直至溶液澄清后，繼續(xù)加熱10 min，除盡剩余的過(guò)氧化氫。取下稍冷，小心加水至20 mL，加熱煮沸。取下冷卻，用少量水沖洗彎頸小漏斗，洗液收入原凱氏燒瓶中。將消煮液移入100 mL容量瓶中，加水定容，靜置澄清，作為儲(chǔ)備液。

吸取此儲(chǔ)備溶液10.0 mL于容量瓶中，加水至30 mL，加2滴質(zhì)量濃度為0.2%的 2，4-二硝基酚指示劑溶液，用10%氫氧化鈉溶液和5%硫酸溶液調(diào)節(jié)溶液呈微黃色，加10.0 mL釩鉬酸銨試劑，搖勻，定容至50 mL，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)440 nm處測(cè)定吸光度[14]。

式中：c2為顯色液磷濃度，單位μg/mL；V3為顯色液體積，50 mL；D為分取倍數(shù)，定容體積/分取體積（100/10）；m為風(fēng)干樣質(zhì)量，單位g；X0為風(fēng)干樣含水量；2.29表示將P換算成P2O5的因數(shù)；0.000 1為將μg/g換算為質(zhì)量分?jǐn)?shù)的因數(shù)。

（3）采用H2SO4-H2O2消煮—火焰光度法測(cè)定K2O含量

吸取5.0 mL儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中，定容。在火焰光度計(jì)上測(cè)定，記錄儀器示值[14]。

式中：c3為測(cè)定液K濃度，單位μg/mL；V4為測(cè)定體積，50 mL；D為分取倍數(shù)，定容體積/分取體積（100/5）；m為風(fēng)干樣質(zhì)量，單位g；X0為風(fēng)干樣含水量；1.20表示將K換算成K2O的因數(shù)；0.000 1表示將μg/g換算為質(zhì)量分?jǐn)?shù)的因數(shù)。

1.3.9　微生物數(shù)量

采用稀釋涂布平板法測(cè)定細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量[8]。

1.3.10　含水率

用烘干恒重法測(cè)定堆肥樣品的含水率。稱取10 g左右新鮮堆肥樣品置于已知重量平皿中，測(cè)定質(zhì)量，將平皿置于烘箱中60℃烘干12 h，在干燥器中冷卻并稱重。堆肥樣品烘干前后的重量差與新鮮樣品重量的比值即為含水率（%）[15]。

1.4　數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所用數(shù)據(jù)均為三組平行數(shù)據(jù)的平均值，采用OriginPro 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　堆肥過(guò)程中理化指標(biāo)變化

2.1.1　溫度

溫度是堆肥化最直觀也是最重要的參數(shù)，微生物的生長(zhǎng)、繁殖都與溫度變化密切相關(guān)，有些微生物不適應(yīng)堆體溫度的變化，數(shù)量逐漸減少，甚至死亡，另一部分微生物則大量繁殖，成為堆體中的優(yōu)勢(shì)種群[5]。堆肥過(guò)程中溫度變化如圖1所示。

圖1　堆肥過(guò)程中溫度變化Fig.1　The changes of temperature during composting

根據(jù)溫度變化堆肥過(guò)程分為3個(gè)階段，對(duì)于添加堆肥菌劑的A組，1～4 d為升溫階段，5～14 d為高溫階段，15～17 d為降溫階段，18～40 d為腐熟階段；對(duì)于未添加堆肥菌劑的B組，1～7 d為升溫階段，8～12 d為高溫階段，13～17 d為降溫階段，18～40 d為腐熟階段。在升溫階段，細(xì)菌和真菌將簡(jiǎn)單有機(jī)物（蛋白質(zhì)、淀粉、多糖等）降解產(chǎn)生大量熱量，由于堆體不易散熱，中心溫度快速上升，達(dá)到55℃，進(jìn)入高溫期，A組高溫期持續(xù)10 d，B組高溫期持續(xù)5 d，由于高溫可殺死堆肥基質(zhì)中的病原菌等有害物質(zhì)，因此長(zhǎng)時(shí)間的高溫可以使堆肥達(dá)到衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[7]，A組高溫期持續(xù)時(shí)間比B組多5 d，且高溫期平均溫度比B組高2.76℃（A組高溫期平均溫度58.22℃，B組高溫期平均溫度55.46℃），A組堆肥進(jìn)行到第 15 d時(shí)溫度迅速降低進(jìn)入降溫階段，B組第13 d進(jìn)入降溫階段，這是由于微生物活動(dòng)減弱，導(dǎo)致堆體溫度逐漸下降，B組先于A組進(jìn)入降溫階段，這說(shuō)明添加菌劑的A組微生物活性高于B組，從第18 d開(kāi)始，A組與B組同時(shí)進(jìn)入腐熟期，此階段溫度波動(dòng)不大，趨于平穩(wěn)，堆肥實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)堆體溫度接近于室溫。堆體溫度的變化又會(huì)通過(guò)影響微生物的生長(zhǎng)與代謝來(lái)影響堆肥進(jìn)程。

2.1.2　pH

如圖2所示，在整個(gè)堆肥過(guò)程中，A組pH從初始的7.07迅速降低到第3 d的6.53，微生物快速分解堆肥基質(zhì)中的有機(jī)物，產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，pH值較低；隨著堆肥化的進(jìn)行，有機(jī)酸被分解，pH值逐漸變大，第20 d達(dá)到最大值8.16，在堆肥的腐熟期稍有降低，第40 d達(dá)到7.78。與A組相比，B組pH在第3 d降低為6.71，隨后逐漸升高，在第30 d達(dá)到最大值7.80，腐熟后期略有降低，這說(shuō)明堆肥初期A組產(chǎn)酸能力強(qiáng)于B組，隨著堆肥化的進(jìn)行微生物分解有機(jī)酸的能力也強(qiáng)于B組，即添加菌劑的A組微生物活性高于B組。本次堆肥過(guò)程中的pH維持在6.53～8.16，與Bernal報(bào)道的堆肥最適pH 5.5～8.0基本吻合[16]。

圖2　堆肥過(guò)程中pH變化曲線Fig.2　The changes of pH during composting

2.1.3　含水率

水分是微生物進(jìn)行新陳代謝及反應(yīng)的介質(zhì)，堆體中可降解的物質(zhì)只有先溶于水才能被微生物吸收并利用。另外，微生物只有不斷從環(huán)境中吸收水分才能維持自身生長(zhǎng)繁殖并降解纖維素[5]。從圖3中可以看出，物料初始含水率為60.6%，隨著堆肥化的進(jìn)行，含水率不斷降低，到堆肥化結(jié)束時(shí)，A組的含水率為29.5%，堆肥過(guò)程中含水率下降了31.1%，其中22.5%的水分是在堆肥的第1～12 d散失；堆肥結(jié)束時(shí)B組含水率為38.1%，下降了22.7%，其中15.7%的水分是在堆肥的第1～12 d散失，A組與B組在堆肥13 d以后水分散失速率較低，這與堆體中心溫度變化相一致，含水率降低會(huì)使物料與空氣的接觸面積變大，加快堆體中熱量和水分的散失，從而降低微生物新陳代謝與產(chǎn)酶能力，使腐熟速率變慢。A組最終含水率低于B組，再次說(shuō)明A組微生物活性高于B組，更多的水分被微生物用于代謝與降解。

圖3　含水率變化曲線Fig.3　The changes of moisture content during composting

2.1.4　水溶性有機(jī)碳（WSC）

WSC是堆肥微生物最直接的碳源，可被微生物直接利用來(lái)合成自身物質(zhì)，WSC的變化反映堆肥微生物的活躍水平[10]。WSC的含量變化是動(dòng)態(tài)的，當(dāng)基質(zhì)降解速率低于利用速率時(shí)，堆肥體系中的WSC含量就上升，相反就會(huì)降低[9]。如圖4所示，WSC在堆肥前期略有上升，A組由開(kāi)始的222.14 mg/kg上升到最高的239.60 mg/kg干樣，B組由開(kāi)始的220.45 mg/kg上升到最高的230.12 mg/kg干樣，堆肥初期部分細(xì)菌和真菌種群能夠較快適應(yīng)堆肥環(huán)境，并產(chǎn)生相關(guān)酶，這些酶使有機(jī)物從堆肥物料上脫落并將其降解，產(chǎn)生大量WSC。隨著堆體中微生物的繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，對(duì)碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求越來(lái)越大，WSC被迅速利用，合成大量的酶，將難降解有機(jī)質(zhì)逐漸降解，導(dǎo)致堆體WSC在堆肥后期迅速降低[17]，A組低至70.35 mg/kg，B組低至86.97 mg/kg。

圖4　水溶性碳水化合物（WSC）變化曲線Fig.4　The changes of WSC during composting

2.2　總纖維含量（TF）

纖維素、半纖維素與木質(zhì)素靠分子間共價(jià)鍵與非共價(jià)鍵緊密相連，形成植物細(xì)胞壁，三者可占植物細(xì)胞干重的90%以上[18]，由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難被降解。如圖5所示，在堆肥升溫階段，TF含量略有降低，A組降解率為3.43 g/（kg·d），B組降解率為0.33 g/（kg·d）；在高溫及降溫階段，A組TF含量降低了11.60%，B組TF含量降低了7.59%，A組降解率為6.44 g/（kg·d），B組降解率為4.46 g/（kg·d）；在腐熟階段，TF降解率有所降低，A組降解率為3.40 g/（kg·d），B組降解率為2.69 g/（kg·d），A組TF最終含量為15.70%，B組TF最終含量為22.08%，由此可見(jiàn)，添加菌劑的A組對(duì)纖維素類的降解優(yōu)于不加菌劑的B組。

圖5　總纖維素含量(TF)變化曲線Fig.5　The changes of TF during composting

2.3　堆肥過(guò)程中相關(guān)酶活性變化

2.3.1　漆酶活性（Laccase）

Laccase在微生物降解木質(zhì)素中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。如圖6所示，Laccase酶活在堆肥過(guò)程中變化劇烈，對(duì)于添加菌劑的A組，在升溫階段酶活迅速升高至146.7 U，并在高溫及降溫階段穩(wěn)定在146.70～150.79 U之間，在腐熟期，Laccase活性迅速降低，堆肥結(jié)束時(shí)Laccase活性為30.14 U。B組呈現(xiàn)出與A組基本相同的變化趨勢(shì)，但B組高溫及降溫階段酶活性比A組低12.28 U，這是由于B組高溫階段溫度低于A組導(dǎo)致的。Roberts等[19]人報(bào)道大腸桿菌（E.coli）的Laccase最適宜反應(yīng)溫度為55℃，來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌（S.coelicolor）的Laccase最適溫度為80℃[20]，所以Laccase活性在堆肥升溫期及高溫期迅速升高并維持在150 U上下，主要由于功能微生物在這一階段快速增殖且產(chǎn)酶能力較強(qiáng)，當(dāng)堆體溫度降至30℃左右，微生物產(chǎn)酶能力被抑制，已有Laccase被底物不斷利用，導(dǎo)致Laccase活性迅速降低，這與TF含量呈現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)。

圖6　漆酶（Laccase）活性變化曲線Fig.6　The changes of laccase activity during composting

2.3.2　濾紙酶活性（FPase）

FPase可以降解非水溶性纖維素，其活性可以反映堆肥體系降解纖維素與半纖維素的能力[21]。如圖7所示，在堆肥升溫期與高溫期，A組與B組FPase活性都隨著堆肥進(jìn)程迅速增大，在第12 d達(dá)到最大，分別為102.22 U和87.45 U，這是因?yàn)槲⑸锂a(chǎn)酶能力及酶活性都隨溫度的升高而升高，當(dāng)堆肥進(jìn)入降溫階段及腐熟階段后，酶活性隨著溫度的降低而降低，F(xiàn)Pase活性對(duì)溫度變化較為敏感。

2.3.3　羧甲基纖維素酶（CMCase）

CMCase以可溶性纖維素為底物，將其水解成還原性的寡糖，是纖維素酶系的主要成分[12]。如圖8所示，A組與B組中CMCase活性先隨反應(yīng)進(jìn)程不斷升高，到第12 d時(shí)達(dá)到最大值，分別為A組350.56 U，B組320.19 U，后又逐漸降低，到第30 d時(shí)，A組CMCase活性為203.12 U，B組CMCase活性為200.08 U，之后A組酶活略有降低，B組酶活維持不變。由于CMCase以可溶性纖維素為底物，不同于FPase和Laccase，所以CMCase酶活在堆肥后期依舊保持較高的活性，推測(cè)是堆肥后期，堆體內(nèi)仍然有一定濃度的可溶性纖維素類物質(zhì)，所以依舊保持了一定的酶活，且堆肥后期（第30～40 d），A組酶活性降低了17.32 U，B組基本保持不變，這可能與含水率的變化有關(guān)，A組含水率由30.0%降低為29.5%，B組含水率則維持在38%上下，含水率降低導(dǎo)致可溶性纖維素減少，在誘導(dǎo)效應(yīng)的作用下，相應(yīng)酶活性也降低。

2.3.4　TF與Laccase，F(xiàn)Pase，CMCase相關(guān)性

將圖5至圖8中TF值變化與3種酶活性變化趨勢(shì)做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)TF與Laccase，F(xiàn)Pase，CMCase活性相關(guān)性分別為0.836 7，0.760 8，0.389 3，這說(shuō)明TF變化與Laccase活性顯著相關(guān)（R2＞0.8），與FPase活性相關(guān)（R2＞0.6），所以Laccase及FPase活性可以反映總纖維素的降解效果。

2.4　堆肥過(guò)程中堆體微生物數(shù)量變化

如表2所示，堆肥前后A組細(xì)菌數(shù)量降低了1.09×109cfu/g，真菌數(shù)量降低了8.50×102cfu/g，放線菌數(shù)量降低了1.27×105cfu/g；B組細(xì)菌數(shù)量降低了8.90×108cfu/g，真菌數(shù)量降低了5.30×102cfu/g，放線菌數(shù)量降低了9.20×104cfu/g。細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量隨著溫度升高逐漸降低，在第12 d即高溫期后期降至最低，隨著堆肥進(jìn)入降溫期及腐熟期，微生物數(shù)量又呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，這主要是溫度變化導(dǎo)致的，堆肥過(guò)程中有害微生物被抑制作用，數(shù)量降低，有益微生物大量生長(zhǎng)，成為堆肥過(guò)程的主導(dǎo)微生物，并且A組中微生物總量的減少值高于B組，再次印證較高的溫度有利于抑制堆體中的有害微生物，大大提高堆肥產(chǎn)品的品質(zhì)。

表2　堆肥過(guò)程中微生物數(shù)量的變化Table 2　The changes of microbial quantity during composting

2.5　總養(yǎng)分

總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O）是微生物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是堆肥產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。如圖9所示，總養(yǎng)分含量隨著堆肥進(jìn)程逐漸增加，A組增加了1.58%，B組增加了1.24%。有機(jī)質(zhì)在堆肥過(guò)程中被微生物分解利用，部分有機(jī)氮轉(zhuǎn)化成氨氮和硝氮，氨氮進(jìn)一步分解，以氨氣的形式散失到空氣中，使總質(zhì)量有一定的損失；而P素和K素性質(zhì)穩(wěn)定，盡管P素與K素存在不同形態(tài)間的轉(zhuǎn)化，但不會(huì)揮發(fā)損失[22-23]，所以綜合N，P，K的變化趨勢(shì)，總養(yǎng)分含量略有升高。

圖9　堆肥過(guò)程中總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O）含量變化Fig.9　The changes of N+P2O5+K2O during composting

2.6　堆肥產(chǎn)品品質(zhì)分析

農(nóng)業(yè)廢棄物經(jīng)過(guò)40 d的堆肥處理后，各項(xiàng)指標(biāo)變化如表3所示，pH由7.0左右上升到7.7～7.8，A組與B組保持一致。A組含水率降低了29.5%，B組含水率下降了22.7%，較低的含水率有利于有機(jī)肥的長(zhǎng)期保存，A組優(yōu)于B組。A組WSC含量降低了151.79 mg/kg，B組WSC含量降低了133.48 mg/kg，A組添加功能菌劑，微生物活性強(qiáng)，利用WSC的能力也強(qiáng)，所以A組WSC降低值高于B組。A組TF降低了19.42%，B組TF降低了13.06%，A組對(duì)纖維素的降解率更高。A組細(xì)菌、真菌、放線菌菌落數(shù)分別低于B組2.1×108cfu/g、2.5×102cfu/g、3.2×104cfu/g，并且A組N+P2O5+K2O含量高于B組0.34%，所以，A組所得堆肥產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)于B組。

表3　堆肥前后主要成分對(duì)比Table 3　Comparison of main components before and after composting

3　結(jié)論

（1）堆肥過(guò)程中，物料顏色逐漸加深，變?yōu)樯詈稚?，堆肥初期堆體散發(fā)惡臭，有大量蚊蠅圍繞，隨堆體溫度升高并保持穩(wěn)定，惡臭及蚊蠅逐漸消失，堆體逐漸失水，堆體表面呈現(xiàn)干涸狀，堆至40 d，獲得堆肥產(chǎn)品。

（2）添加菌劑有助于推動(dòng)堆肥進(jìn)程，微生物的快速大量增殖可以促進(jìn)堆體提前進(jìn)入高溫期，并維持較高的溫度（最高溫度60.3℃），持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間（10 d），使含水率、總養(yǎng)分、總纖維素、可溶性碳水化合物等指標(biāo)都優(yōu)于對(duì)照組，并且較高溫度抑制了有害微生物的繁殖，促進(jìn)了堆肥化進(jìn)程，提高了堆肥產(chǎn)品質(zhì)量。

（3）總纖維素含量與Laccase，F(xiàn)Pase，CMCase活性相關(guān)性分別為0.836 7，0.760 8，0.389 3，這說(shuō)明Laccase及FPase活性可以反映纖維素的降解效果，相關(guān)性較強(qiáng)，Laccase可以降解木質(zhì)素，F(xiàn)Pase可以降解不溶性纖維素及半纖維素，CMCase可以降解可溶性纖維素及半纖維素，也就是說(shuō)，以固態(tài)纖維素類為降解底物的酶，其活性可以反映總纖維素類物質(zhì)的降解效果。

[1]MAYSD，TERMAN G，DUGGAN J.Municipal compost：Effects on crop yields and soil properties[J].Journal of En?vironmental Quality，1973，2（1）：89-92.

[2]LITTERICK A，HARRIER L，WALLACE P，et al.The role of uncomposted materials，composts，manures，and com?post extracts in reducing pest and disease incidence and severity in sustainable temperate agricultural and horticul?tural crop production-review[J].Critical Reviews in Plant Sciences，2004，23（6）：453-479.

[3]杜艷艷，趙蘊(yùn)華.農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用技術(shù)研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（2）：192-196.

[4]汪建飛，于群英，陳世勇，等.農(nóng)業(yè)固體有機(jī)廢棄物的環(huán)境危害及堆肥化技術(shù)展望[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（18）：4720-4722.

[5]魯倫慧.農(nóng)業(yè)廢物堆肥中木質(zhì)素降解功能微生物群落結(jié)構(gòu)研究[D].長(zhǎng)沙，湖南大學(xué)，2014.

[6]HUANGH L，ZENGG M，TANGL，et al.Effect of biodel?ignification of rice straw on humification and humus quali?tybyPhanerochaetechrysosporiumandStreptomycesbadius[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2008,61（4）：331-336.

[7]李瑞鵬.秸稈與奶牛場(chǎng)廢棄物混合堆肥及其應(yīng)用研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[8]沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（第二版）[M].北京：高等教育出版社，1989.

[9]田偉.牛糞高溫堆肥過(guò)程中的物質(zhì)變化，微生物多樣性以及腐熟度評(píng)價(jià)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[10]GARCIA C，HERNANDZE T，COSTA F，et al.Evalua?tion of the maturity of municipal waste compost using sim?ple chemical parameters[J].Communications in Soil Sci?ence and Plant Analysis，1992，23（13/14）：1501-1512.

[11]YU R T，WANG L S,DUAN X Y.Isolation of cellulolytic enzymes from moldy silage by new culture-independent strategy[J].Biotechnology letters，2007，29（7）：1037-1043.

[12]李興華.纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及纖維素酶基因在家蠶中的表達(dá)研究[D].杭州，浙江大學(xué)，2011.

[13]李世忠.柑橘皮渣降解菌的篩選及其相關(guān)特性研究[D].重慶，西南大學(xué)，2014.

[14]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)：NY525-2012[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[15]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.復(fù)合微生物肥料：NY/T 798-2015[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2015.

[16]BERNAL M，ALBURQUERQUE J，MORAL R.Compost?ing of animal manures and chemical criteria for compost maturity assessment.A review[J].Bioresource Technology.2009，100（22）5444-5453.

[17]SUNDBERG C,SM?RS S,J?NSSONH.Low pH as an in?hibiting factor in the transition from mesophilic to thermo?philicphaseincomposting[J].BioresourceTechnology，2004，95（2）：145-150.

[18]BREZNAK J A，BRUNE A.Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites[J].Annual Review of Entomology，1994，39：453-487.

[19]ROBERTS S A，WEICHSEL A，GRASS G，et al.Crystal structure and electron transfer kinetics of CueO，a multi?copper oxidaserequiredforcopperhomeostasisinEscherich?iacoli[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（5）：2766-2771.

[20]SHERIF M，WAUANG D，KORBECI B，et al.Biochemi?cal studies of the multicopper oxidase（small laccase）from Streptomyces coelicolor using bioactive phytochemicals and site-directed mutagenesis[J].Microbial biotechnology，2013，6（5）：588-597.

[21]張麗麗.整合宏組學(xué)方法揭示天然木質(zhì)纖維素堆肥中的關(guān)鍵功能微生物群落[D].濟(jì)南，山東大學(xué)，2016.

[22]盧秉林，王文麗，李娟，等.牛糞與小麥秸稈混合高溫堆肥的腐熟進(jìn)程研究[J].環(huán)境污染與防理，2010，32（1）：30-34.

[23]王亞飛，李夢(mèng)嬋，邱慧珍，等.不同畜禽糞便堆肥的微生物數(shù)量和養(yǎng)分含量的變化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，52（3）：37-45.