童超英,　彭密軍,　施樹云*(. 中南大學化學化工學院, 湖南 長沙 40003; . 廣東省測試分析研究所, 中國廣州分析測試中心, 廣東 廣州 50070)

中藥活性成分的分析鑒定是闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的前提,也是中藥質(zhì)量控制的基礎(chǔ)和核心。中藥活性成分的分析鑒定一般包括樣品前處理和色譜分析兩部分。傳統(tǒng)的樣品前處理方法(如加熱回流、索氏提取等)需要使用大量的提取溶劑(乙醇、甲醇和水等)、經(jīng)過長時間的加熱回流和去溶劑濃縮過程,占整個分析時間的90%以上,同時在提取過程中還存在熱不穩(wěn)定性成分流失的現(xiàn)象。因此,繁瑣耗時的樣品前處理過程是中藥成分快速分析的瓶頸。近年來發(fā)展的新型提取方法,如超臨界流體萃取法[1]、負壓空化萃取法[2]、微波或超聲輔助提取法[3]、機械化學輔助提取法[4]、可轉(zhuǎn)換溶劑和離子液體提取法[5]等,旨在減少樣品前處理過程中時間、能量和溶劑的消耗。另外,在樣品的前處理過程中一般需要克級樣品,這增加了微量樣品的操作難度。因此,建立快速、簡便、高效的樣品前處理方法迫在眉睫。Ferreira等[6]提出了在線提取(online extraction, OLE)技術(shù):通過將微量固體樣品填入固相萃取小柱,與HPLC在線聯(lián)用,無需額外的提取時間、溶劑消耗和提取設(shè)備,可實現(xiàn)樣品的高效提取和分析。因此,在線提取技術(shù)可加快中藥活性成分分析鑒定的進程,縮短研究周期。

高效液相色譜-二極管陣列檢測-四極桿飛行時間質(zhì)譜法(HPLC-DAD-QTOF-MS)被廣泛應(yīng)用于分析鑒定中藥活性成分[7]。高分辨率質(zhì)譜可提供準確的元素組成,為活性成分的定性分析提供了可靠的手段[8,9]。因此,OLE和HPLC-DAD-QTOF-MS在線聯(lián)用可快速提取并分析鑒定中藥中的活性成分。

黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗微生物等活性[10,11],廣泛存在于柑橘屬植物中[12]。陳皮(PericarpiumCitriReticulatae)是柑橘屬植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮,具有理氣健脾、燥濕化痰等功效。目前陳皮中黃酮類化合物的分析鑒定步驟主要為溶劑提取和基于HPLC-MS的主成分分析[13-17]。本文以陳皮為研究對象,建立了OLE-HPLC-DAD-QTOF-MS在線聯(lián)用方法,快速分析鑒定出陳皮中24種黃酮類化合物,其中新圣草次苷、檸檬黃素-3-O-(3-羥基-3-甲基戊二酸)-葡萄糖苷及其異構(gòu)體在陳皮中被首次報道。OLE方法與傳統(tǒng)的溶劑回流提取法相比具有更高的提取效率。因此,OLE-HPLC-DAD-QTOF-MS在線聯(lián)用方法為復(fù)雜樣品的快速分析鑒定提供了新的可行手段,在中藥樣品快速真?zhèn)舞b別、定性定量分析、質(zhì)量控制等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

1　實驗部分

1.1　儀器、試劑與材料

Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(配有在線脫氣機、四元泵、恒溫柱溫箱、手動進樣閥和二極管陣列檢測器)、6530 Accurate-Mass QTOF質(zhì)譜儀(Agilent,美國); RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海賢德儀器有限公司); KQ-500B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); CP224C萬分之一電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司); 400Y多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)。

甲醇和甲酸(色譜純)均購自國藥集團化學試劑有限公司; C18填料(500 μm)購自加拿大Silicycle公司;超純水(18.2 MΩ5cm)由Milli-Q水凈化系統(tǒng)(Millipore,美國)制備。圣草次苷、新圣草次苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、橙皮素、橙黃酮、川陳皮素、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮和橘皮素均購自中藥藥品生物制品檢定所(北京);陳皮購自康美藥業(yè)有限公司(廣東)。

1.2　OLE-HPLC-DAD-QTOF-MS分析

首先將陳皮樣品置于粉碎機中粉碎10 min,得到粒徑約為48～250 μm的陳皮粉末。在空的預(yù)柱芯(10 mm×4.6 mm)內(nèi)填入一半體積的C18填料,然后裝入2.0 mg粉碎的陳皮樣品,再用C18填料填滿,最后將裝有樣品的固相萃取柱連接于手動進樣閥上(見圖1)。在樣品分析過程中,進樣閥首先處于“Load”位置,使用0.1%(v/v)甲酸水-甲醇(75∶25, v/v)平衡Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, Agilent,美國),流速為0.7 mL/min,溫度為25 ℃;將手動進樣閥切換至“Inject”狀態(tài),使用0.1%(v/v)甲酸水(A)和甲醇(B)進行梯度洗脫(0～42 min, 25%B～95%B),檢測波長為254 nm。

圖 1　OLE-HPLC-QTOF-MS方法的流程圖Fig. 1　Flow diagram of online extraction-high perform-ance liquid chromatography-diode array detection-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (OLE-HPLC-DAD-QTOF-MS)

掃描模式為正離子掃描;掃描范圍m/z100～1 200;毛細管電壓3 500 V;干燥氣溫度350 ℃,流速10.0 L/min;鞘氣溫度350 ℃,流速12.0 L/min;霧化氣壓強241.3 kPa;毛細管出口電壓180 V;碰撞電壓40 eV。24種黃酮類化合物的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1　樣品粒徑的優(yōu)化

本文研究了陳皮樣品的粉碎粒徑對OLE提取效率的影響。結(jié)果表明,普通粉碎樣品(粒徑48～250μm)和超微粉末(粒徑<10μm)具有相同的提取效率,因此本工作統(tǒng)一使用普通粉碎(粒徑48～250 μm)的粉末樣品。

表 1　陳皮中24種黃酮類化合物的保留時間(tR)、紫外特征吸收波長(λ)、分子式和碎片離子Table 1　Retention times (tR), ultraviolet characteristic absorption wavelengths (λ), formulas and fragment ions of 24 identified flavonoid compounds in Pericarpium Citri Reticulatae

表 1　(續(xù))Table 1　(Continued)

* The compound reported inPericarpiumCitriReticulataefor the first time. Glu: glucoide; Rut: rutinoside; Neo: neohesperidoside; Rha: rhamnoside; HMG: 3-hydroxy-3-methylglutarate.

2.2　流動相的選擇

陳皮中的主要活性成分為黃酮類化合物,流動相中加入酸可以抑制色譜峰拖尾,提高分離效果。實驗優(yōu)化了流動相的組成及添加酸的種類,結(jié)果表明,以0.1%(v/v)甲酸水和甲醇為流動相進行梯度洗脫時各組分能達到較好的分離效果。

2.3　快速鑒定陳皮中的黃酮類化合物

QTOF-MS可精準提供化合物的分子量信息,將其與HPLC聯(lián)用可實現(xiàn)復(fù)雜中藥體系中活性成分的分離分析和鑒定。在對陳皮樣品的分析中,各個成分在正離子模式下具有較高的靈敏度和較低的背景干擾,其色譜圖見圖2。

圖 2　陳皮(2.0 mg)在正離子模式下的總離子流色譜圖Fig. 2　Total ion current chromatogram of Pericarpium Citri Reticulatae (2.0 mg) in positive ion modeNos. 1-24 are the same as those in Table 1.

對圖2中的24種化合物進行紫外檢測,其紫外吸收譜圖表明陳皮中主要包含三類黃酮類化合物:二氫黃酮、黃酮和黃酮醇。二氫黃酮在285 nm左右有一個較強的紫外吸收峰;黃酮和黃酮醇在240～270 nm和320～350 nm有兩個較強的紫外吸收峰[18,19]。通過化合物的紫外吸收、分子離子峰、碎片離子信息以及參考文獻對化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定,鑒定得到的化合物結(jié)構(gòu)信息見圖3。

圖 3　陳皮中鑒定到的24種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式Fig. 3　Structures of the 24 flavonoid compounds identified in Pericarpium Citri ReticulataeNos. 1-24 are the same as those in Table 1.

化合物1、5～8和11～12具有二氫黃酮的紫外吸收特征,在QTOF-MS譜圖中,可以得到失去糖基后的碎片離子峰:m/z273、287、289和303,分別為柚皮素、異野櫻素、圣草酚和橙皮素。糖基丟失的信息:[M+H-162]+為丟失的葡萄糖配基;[M+H-146]+為丟失的失鼠李糖配基;[M+H-308]+可能為丟失的蕓香糖或新橙皮糖配基[20]。因此,通過進一步與標準品比對,化合物5～8確定為圣草次苷(5)、新圣草次苷(6)、柚皮蕓香苷(7)和橙皮苷(8)?；衔?2中丟失的m/z為150的碎片離子為黃酮C環(huán)跨環(huán)斷裂產(chǎn)生的特征碎片,通過與標準品的保留時間、紫外特征吸收和碎片比對,化合物12鑒定為橙皮素。通過碎片分析和文獻[21,22]對照,化合物1和11被依次鑒定為柚皮苷-4′-O-葡萄糖苷和香風草苷?；衔?新圣草次苷為首次從陳皮中分離得到。

化合物2～4、9～10和13～24在240～270 nm和320～350 nm處有兩個較強的紫外吸收峰。化合物3和4具有相同的分子離子峰[M+H]+(m/z625)和子離子峰[M+H-120]+(m/z505)、[M+H-216]+(m/z409),表明化合物3和4為二碳糖苷[23]。通過文獻[23]對比確定化合物3和4分別為金圣草黃素-6,8-二-C-葡萄糖苷和香葉木素-6,8-二-C葡萄糖苷。同理,推測化合物2為芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷[24]。

化合物14、16～24中存在[M+H-2CH3]+的分子離子峰,表明其為多甲氧基黃酮類化合物[25]。通過與標準品的紫外譜圖、保留時間以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對,化合物16～17、20～21、24分別確定為異橙黃酮(16)、橙黃酮(17)、川陳皮素(20)、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮(21)和橘皮素(24)。通過分子離子峰的精確分子量、碎片、保留時間和紫外吸收特征與文獻[21,26]對比,鑒定化合物14、18、19、22和23依次為:柚皮黃素-3-O-葡萄糖苷(14)、3,5,6,7,3′,4′-六甲氧基黃酮(18)、四甲基-O-異黃芩素(19)、柚皮黃素(22)和5-羥基-6,7,8,3′,4′-五甲氧基黃酮(23)。

化合物9、10、13和15存在[M+H-144]+分子離子峰,是3-羥基-3-甲基戊二酸取代的黃酮類化合物[27]?；衔?和10具有相同的分子離子峰(m/z653),推測其為檸檬黃素-3-O-(3-羥基-3-甲基戊二酸)-葡萄糖苷及其異構(gòu)體,該物質(zhì)在桔葉[28]、枳實[21]中已有報道,在陳皮中為首次報道。同理,化合物13和15分別被鑒定為柚皮黃素-3-O-(5-葡萄糖苷-3-羥基-3-甲氧基戊二酸)-葡萄糖苷和柚皮黃素-3-O-(3-羥基-3-甲基戊二酸)-葡萄糖苷[21]。

共從陳皮中鑒定出24種黃酮類化合物:7種二氫黃酮,9種黃酮和8種黃酮醇,其中新圣草次苷、檸檬黃素-3-O-(3-羥基-3-甲基戊二酸)-葡萄糖苷及其異構(gòu)體為首次在陳皮中報道。

圖 4　不同提取方式下陳皮樣品的色譜圖Fig. 4　Chromatograms of Pericarpium Citri Reticulatae by different extraction methods a. reflux extraction (39.6 g/L); b. first OLE (2.0 mg); c. second sequential OLE (2.0 mg).

2.4　OLE-HPLC-DAD-QTOF-MS法可行性驗證

本工作參照文獻[8]用熱回流法提取了陳皮粗提物。采用定量環(huán)手動注射進樣法對粗提物溶液(39.6 g/L, 20 μL)進行HPLC分析,與用OLE-HPLC法對固體樣品(2.0 mg)的分析結(jié)果進行比較。如圖4所示,采用OLE法提取黃酮類化合物時的提取效率明顯高于溶劑回流提取法;對上述同一陳皮樣品(2.0 mg)進行二次提取,可以明顯觀察到其色譜圖(見圖4c)中幾乎沒有殘留物質(zhì),因此證明一次梯度洗脫基本能提取完全。

為進一步闡明OLE的高提取效率,對陳皮中的兩個主要成分柚皮蕓香苷(7)和橙皮苷(8)進行外標法定量分析。在10～100.0 mg/L范圍內(nèi)兩個物質(zhì)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99(見表2)。以3倍和10倍信噪比(S/N)計算兩個物質(zhì)的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),柚皮蕓香苷和橙皮苷的檢出限均為2.0 mg/L,定量限分別為6.0 mg/L(柚皮蕓香苷)和5.0 mg/L(橙皮苷)。

表 2　柚皮蕓香苷和橙皮苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限和含量Table 2　Regression equations, correlation coefficients (r), linear range, LODs, LOQs and contents of narirutin and hesperidin

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

對柚皮蕓香苷和橙皮苷進行定量分析,計算出采用OLE法和回流提取法時其在陳皮中的含量,結(jié)果見表2。結(jié)果表明,OLE法對柚皮蕓香苷和橙皮苷提取效率高于回流提取方法,可能是OLE-HPLC-DAD-QTOF-MS體系中的高壓狀態(tài)以及梯度溶劑提取的原因。

對陳皮固體(2.0 mg)進行平行3次的OLE-HPLC分析,鑒定得到的24種化合物峰面積的RSD均在5%以內(nèi),表明該方法具有很好的可重復(fù)性。

綜上所述,OLE-HPLC-DAD-QTOF-MS法具有操作簡便、提取效率高、樣品用量少、重復(fù)性好等優(yōu)勢,剔除了傳統(tǒng)復(fù)雜的樣品前處理過程,在中藥活性成分快速分析領(lǐng)域具有十分突出的優(yōu)勢。

3　結(jié)論

本文建立了OLE-HPLC-DAD-QTOF-MS法在線提取和分離鑒定陳皮中的黃酮類化合物。在線提取技術(shù)簡單、快速,無需額外的溶劑、時間和設(shè)備用于陳皮樣品的前處理,所需樣品量少,且提取效率高于傳統(tǒng)的溶劑回流提取法。方法最終鑒定出24種黃酮類化合物,其中新圣草次苷,檸檬黃素-3-O-(3-羥基-3-甲基戊二酸)-葡萄糖苷及其異構(gòu)體在陳皮中首次被報道。該方法可以直接應(yīng)用于快速提取和分離鑒定其他中藥復(fù)雜體系中的活性成分。

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