徐　路，于　洋，劉師兵，李松巖，徐　冶

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 132013)

卵巢癌是臨床上最常見、死亡率最高的婦科惡性腫瘤之一[1-2]。順鉑(cisplatin，CDDP)是臨床上廣泛使用的化療藥物[3-4]，能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[5-6]。越來越多的研究表明線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡都參與了順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程[7-8]。那么，線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria associated endoplasmic reticulum membranes，MAMs)作為線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的偶聯(lián)平臺(tái)[9]，是否也參與了順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程，還未有明確的報(bào)道。本文通過觀察順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡過程中MAMs的變化，探討MAMs是否在順鉑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，為明確順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供新的線索。

材　料　和　方　法

1　材料

本研究所用的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone；CDDP購自Sigma；兔抗active caspase-3、B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白31(B-cell receptor-associated protein 31，BAP31)和電壓依賴性陰離子通道蛋白1(voltage-dependent anion channel protein 1，VDAC1)單克隆抗體購于Proteintech；免疫熒光 II 抗 (Alexa Fluor 546標(biāo)記驢抗兔IgG和Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔IgG)購于Invitrogen。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3在含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)及鏈霉素(1×105U/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待有80% 以上細(xì)胞融合，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，按1∶4比例進(jìn)行傳代。

2.2間接免疫熒光法檢測(cè)active caspase-3的水平以及BAP31和VDAC1的共定位水平高壓消毒后用無菌蓋玻片置于24孔板，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×107/L，每孔500 μL接種過夜，次日待細(xì)胞生長至80%融合，藥物作用細(xì)胞24 h后，棄培養(yǎng)基，加入200 μL固定液(4%多聚甲醛)作用10 min，蛋白酶K消化1 min，PBS洗3次，0.1% Triton-PBS作用5 min，PBS洗3次后，加入5%非免疫動(dòng)物血清作用30 min，加入 I 抗(1∶200)4 ℃過夜，次日加入相應(yīng) II 抗，Hoechst33342染色5 min，PBS洗3次，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察取圖。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化取生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期的 SKOV3細(xì)胞接種于6孔板中，接種濃度約為每孔2.0×105個(gè)細(xì)胞，接種24 h后，藥物再作用24 h，胰酶消化，收集細(xì)胞，800 r/min 離心5 min 后棄去上清液，緩慢加入適量無血清RPMI-1640培養(yǎng)液(使細(xì)胞濃度約為1.0×109/L)，用手指輕彈將細(xì)胞懸液混勻，將細(xì)胞懸液與 MuseTMAnnexin V 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑 1∶1 混勻，室溫避光孵育20 min，處理好的樣本用 MuseTM細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，分析不同處理組中細(xì)胞凋亡率的變化。

2.4透射電鏡觀察線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的變化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，然后轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 離心管中，4 ℃、1 000 r/min離心15 min。 隨后，棄掉上清液，先加入500 μL戊二醛(2.5%)進(jìn)行預(yù)固定，之后再用 1%餓酸后固定。固定完成，用梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂Epon812進(jìn)行包埋，用 LKB2 III 型超薄切片機(jī)行半薄切片，定位之后再行超薄切片，醋酸雙氧化鈾及檸檬酸鉛對(duì)樣本行雙重染色。最后，使用 JEM1200EX 型透射電子顯微鏡，進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察并照相、記錄。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中的各組數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均值比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間均值比較采用 Student’st檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞內(nèi)active capspase-3的表達(dá)

用6 mg/L順鉑處理SKOV3細(xì)胞，分別作用0 h、12 h和24 h。激光共聚焦顯微鏡觀察凋亡標(biāo)志性蛋白active caspase-3表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，順鉑能明顯誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞內(nèi)active caspase-3蛋白的表達(dá)，其中12 h熒光表達(dá)最明顯，見圖1。

2　順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞的凋亡

基于上述結(jié)果，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響。6 mg/L順鉑處理SKOV3細(xì)胞0 h、12 h和24 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明順鉑可明顯誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，與control組相比，順鉑作用12 h和24 h組細(xì)胞凋亡率均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而12 h組和24 h組比較，細(xì)胞凋亡率無顯著變化，見圖2。

3　順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞內(nèi)BAP31和VDAC1的共定位

我們用BAP31和VDAC1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的標(biāo)志性蛋白,觀察順鉑是否能夠影響線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的關(guān)聯(lián)。6 mg/L順鉑處理SKOV3細(xì)胞0 h、12 h和24 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Bap31和VDAC1的共定位在24 h熒光表達(dá)最強(qiáng),見圖3。

4　順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞內(nèi)線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的關(guān)聯(lián)

我們通過透射電鏡檢測(cè)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的關(guān)聯(lián)，6 mg/L順鉑處理SKOV3細(xì)胞0 h和8 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對(duì)照組相比，順鉑處理8 h后，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的關(guān)聯(lián)顯著增加，與 control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 1.The effect of cisplatin on the expression of active caspase-3 in SKOV3 cells.The scale bar=20 μm.
圖1順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞內(nèi)activecaspase-3表達(dá)的影響

Figure 2.The effect of cisplatin on the apoptosis in SKOV3 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖2順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

討　　論

已有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性凋亡與線粒體損傷途徑可能存在一定的交聯(lián)[10]，而MAMs將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的功能結(jié)構(gòu)和信號(hào)通路緊密聯(lián)系在一起[11]，在磷脂合成轉(zhuǎn)運(yùn)、線粒體形態(tài)功能調(diào)節(jié)、Ca2+

Figure 3.The effect of cisplatin on the colocalization of BAP31 and VDAC1 in SKOV3 cells.The scale bar=10 μm.
圖3順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞內(nèi)BAP31和VDAC1共定位的影響

Figure 4.The effect of cisplatin on the mitochondria-ER contacts in SKOV3 cells.The scale bar=200 nm.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖4順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞內(nèi)線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)聯(lián)的影響

信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[12-13]，已經(jīng)成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)，但具體的作用機(jī)制還不清楚，仍需進(jìn)一步探討。

BAP31是一類定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)化保守的跨膜蛋白，其在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[14]。電壓依賴性陰離子通道蛋白1是線粒體上主要的Ca2+攝入通道[15]。在順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的過程中，我們發(fā)現(xiàn)兩者共定位顯著增加，即線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的關(guān)聯(lián)顯著增加，推測(cè)MAMs參與了順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的過程。

已有研究發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，Ca2+濃度增高，同時(shí)伴有VDAC1低聚反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)增加VDAC1表達(dá)時(shí)，Ca2+可通過激活一個(gè)未知的信號(hào)通道，促進(jìn)VDAC1發(fā)生低聚反應(yīng)，從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[16]。也有研究者認(rèn)為，細(xì)胞凋亡過程與MAMs上高密度分布的1,4,5三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor，IP3R)鈣離子釋放通道有關(guān)，大量Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)迅速轉(zhuǎn)移到線粒體中從而誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[11]。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體表面連接抗凋亡蛋白(PML、Akt和PTNE等)通過調(diào)控Ca2+濃度也可以誘導(dǎo)凋亡[17]。因此，我們推測(cè)MAMs在順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制可能與Ca2+有關(guān)。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的關(guān)聯(lián)顯著增加，引起Ca2+釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，這可能是順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步探討，該凋亡機(jī)制的研究將為卵巢癌治療提供新的治療靶點(diǎn)。

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