姜文豪，孫　艷，彭　睿，彭惠民，張　政

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是最嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因，約1/3的糖尿病患者會(huì)發(fā)展成為糖尿病腎病[1]。DN的發(fā)生涉及細(xì)胞外基質(zhì)堆積、腎小球肥大、腎臟基底膜增厚以及腎小球硬化等多種病理改變[2]，其分子發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。新近研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的高糖環(huán)境能夠誘發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，造成過(guò)量的免疫細(xì)胞產(chǎn)生及炎癥因子分泌，對(duì)DN的發(fā)生發(fā)展起到一定的促進(jìn)作用[3-5]，但其具體機(jī)制仍不明確。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長(zhǎng)度為21～23個(gè)核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA片段，主要通過(guò)抑制蛋白質(zhì)翻譯及mRNA剪切的方式負(fù)調(diào)控靶基因。研究表明，miRNA在包括細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、脂類代謝、發(fā)育以及激素分泌等多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用，參與糖尿病腎病。本課題組前期芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠相比較，miR-451在糖尿病腎病小鼠腎臟組織內(nèi)表達(dá)異常[6]；且miR-451可通過(guò)Ywhaz/p38 MAPK信號(hào)途徑抑制DN系膜增生[7]，提示miR-451可能是一個(gè)重要的DN調(diào)節(jié)因子。然而，miR-451在DN炎癥中的具體作用如何目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究在前期肺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-451可直接靶向一個(gè)炎癥相關(guān)基因——β型蛋白酶體亞基8(proteasome subunit β type 8，Psmb8)的基礎(chǔ)上[8]，應(yīng)用商品化miR-451 mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染至高、低糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells，MCs)，觀察細(xì)胞炎癥標(biāo)志物的表達(dá)改變，同時(shí)檢測(cè)Psmb8在系膜細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)炎癥相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響，探索miR-451通過(guò)炎癥相關(guān)靶基因調(diào)控DN炎癥的機(jī)制。

材　料　和　方　法

1　主要材料與試劑

永生化腎小球系膜細(xì)胞株SV40-MES13(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；LipofectamineTM2000和Trizol(Invitrogen)；miR-451 mimics和miR-451 inhibitor及其陰性對(duì)照(negative control，NC)mimics NC 和inhibitor NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；高、低糖DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；PVDF膜(Millipore)；兔抗白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-18、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Psmb8和GAPDH多克隆抗體(Abcam)；Psmb8 小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ和PrimeScript? RT reagent Kit(大連寶生物工程有限公司)。

2　主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)為模擬正常及糖尿病狀態(tài)，分別用葡萄糖濃度為5.5 mmol/L和25 mmol/L、含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞，分別為低葡萄糖(low-glucose MCs，L-MC)組和高葡萄糖(high-glucose MCs，H-MC)組，同時(shí)低葡萄糖組中加入19.5 mmol/L的甘露醇以維持等滲環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，800 r/min離心5 min，收集細(xì)胞進(jìn)行傳代或凍存。

2.2設(shè)計(jì)合成 Psmb8 siRNA根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的小鼠Psmb8基因序列，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計(jì)3條siRNA，具體序列如下：No.1:5’-UUUGUUCAUCCUUAAGGAGCU-3’; No.2:5’-UUUCCUAAGACUGAAGUAGUC-3’; No.3:5’-AUUGUACUUAGAAGGUAUCUG-3’。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其干擾效率通過(guò)qPCR檢測(cè)。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組當(dāng)MCs達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，運(yùn)用LipofectamineTM2000將miR-451 mimics及mi-mics NC分別轉(zhuǎn)染到高糖培養(yǎng)的MCs中(即H-MC miR-451組和H-MC miR-NC組),將miR-451 inhibitor及inhibitor NC分別轉(zhuǎn)染到低糖培養(yǎng)的MCs中(即L-MC anti-miR-451組和L-MC anti-miR-NC組)，將Psmb8 siRNA轉(zhuǎn)染到高糖培養(yǎng)的MCs中(即H-MC siPsmb8組)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

2.4miR-451表達(dá)水平的檢測(cè)應(yīng)用qPCR法。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，Trizol法裂解細(xì)胞提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄的體系為 5× gDNA Era-ser Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL和total RNA 1.0 μg，補(bǔ)加RNase-free dH2O至總體積為10 μL。將混合后的反應(yīng)液室溫靜止10 min后于冰上與1.0 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ、1.0 μL miR-451特異的莖環(huán)引物、4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)和4.0 μL RNase-free dH2O混合，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 15 min的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。miR-451逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA-CTG-3’。然后以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)，引物序列為5’-CCGAAACCGTTACCATTAC-3’(forward)和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(reverse)，其反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (2×) 10 μL、 PCR forward primer (10 μmol/L) 0.5 μL、 PCR reverse primer (10 μmol/L) 0.5 μL、cDNA 2 μL和滅菌蒸餾水7 μL。將反應(yīng)液混合均勻后于CFX96TMReal-Time PCR儀完成qPCR反應(yīng)，其反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s、65 ℃ 5 s、95 ℃，每0.5 ℃進(jìn)行熔解曲線分析。最后以U6為內(nèi)參照利用公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-451的相對(duì)表達(dá)量。

2.5IL-18和TNF-α的mRNA表達(dá)檢測(cè)應(yīng)用qPCR檢測(cè)，操作步驟同前。TNF-α的上游引物序列為5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3’，下游引物序列為5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’； IL-18的上游引物序列為5’-GACTCTTGCGTCAACTTCAAGG-3’，下游引物序列為5’-CAGGCTGTCTTTTGTCAACGA-3’；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5’-ATATCGCTGCGCTG GTCGTC-3’，下游引物序列為5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。

2.6Western blot法檢測(cè)IL-18、TNF-α和Psmb8蛋白的相對(duì)表達(dá)水平將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞收集于EP管中，加入適量蛋白裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每組取50 g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，分別加入兔抗IL-18、TNF-α、Psmb8和GAPDH多克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次后分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h，覆蓋ECL發(fā)光劑后于化學(xué)發(fā)光儀上攝取圖像。以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行校正，通過(guò)CM-2000B型生物醫(yī)學(xué)成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上進(jìn)行比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　miR-451和Psmb8在高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中呈顯著低表達(dá)

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，H-MC組miR-451的表達(dá)水平明顯低于L-MC組(P<0.01)，提示miR-451可能與DN的發(fā)生相關(guān)，見(jiàn)圖1A。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，H-MC組中Psmb8蛋白表達(dá)量與L-MC組相比較顯著升高(P<0.01)，提示Psmb8可能在DN中發(fā)揮作用，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The expression of miR-451 and Psmb8 protein in mouse mesangial cells under high-and low-glucose conditions.A:the expression of miR-451 was down-regulated in H-MC group compared with L-MC group； B:the protein expression of Psmb8 was increased in H-MC group compared with L-MC group.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsL-MC group.
圖1腎小球系膜細(xì)胞中miR-451及Psmb8的表達(dá)水平

2　高、低表達(dá)miR-451對(duì)炎癥標(biāo)志物IL-18和TNF-α表達(dá)水平的影響

qPCR結(jié)果表明，IL-18和TNF-α的mRNA表達(dá)水平在H-MC miR-451組較H-MC組顯著降低(P<0.01)；L-MC anti-miR-451組較L-MC組IL-18和TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖2A、B。Western blot檢測(cè)IL-18和TNF-α的蛋白表達(dá)水平結(jié)果與qPCR結(jié)果相一致，見(jiàn)圖2C。以上結(jié)果均提示miR-451對(duì)DN炎癥的發(fā)生具有抑制作用。

3　高、低表達(dá)miR-451對(duì)Psmb8蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，H-MC miR-451組Psmb8蛋白表達(dá)水平較H-MC和H-MC miR-NC組降低 (P<0.01)。同時(shí)，L-MC anti-miR-451組Psmb8蛋白表達(dá)水平較L-MC和L-MC anti-miR-NC組增高(P<0.01)，見(jiàn)圖3。結(jié)合前期螢光素酶檢測(cè)結(jié)果[8]，我們認(rèn)為miR-451在DN可通過(guò)種子序列與Psmb8基因的3’UTR結(jié)合，從而靶向抑制Psmb8的表達(dá)。

4　沉默Psmb8對(duì)IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示合成的3條Psmb8 siRNA中，與另外2條siRNA相比較，第2條siRNA對(duì)Psmb8 mRNA表達(dá)的干擾效率最高(P<0.01)，因此選擇該條siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖4A。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明H-MC組IL-18和TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)水平較L-MC組明顯升高(P<0.01)，與高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)炎癥發(fā)生的結(jié)果相一致；H-MC siPsmb8組中IL-18和TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)水平較H-MC組顯著降低(P<0.01)，提示Psmb8可能參與DN炎癥的發(fā)生，見(jiàn)圖4B。

Figure 2.The effect of miR-451 on inflammatory markers IL-18 and TNF-α in mouse mesangial cells.A and B:the mRNA expression of IL-18 and TNF-α detected by qPCR； C:the protein expression of IL-18 and TNF-α detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsL-MC anti-miR-451 group;△△P<0.01vsH-MC miR-451 group.
圖2腎小球系膜細(xì)胞中高低表達(dá)miR-451對(duì)炎癥標(biāo)記物IL-18和TNF-α的影響

討　　論

當(dāng)機(jī)體中存在血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子產(chǎn)生防御性反應(yīng)時(shí)誘發(fā)炎癥，該過(guò)程大多數(shù)情況下是機(jī)體清除有害物質(zhì)的自我保護(hù)過(guò)程，但有時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定的損傷[9]。已有充分的證據(jù)表明miRNA對(duì)炎癥及其相關(guān)反應(yīng)的發(fā)生具有一定的影響。miRNA與潰瘍性結(jié)腸炎[10]、幽門螺桿菌感染[11]和病毒性肝炎[12]等炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展有著極為密切的聯(lián)系。有研究顯示miR-21可作為DN診斷的標(biāo)志物[13]。但miRNA在糖尿病腎病炎癥中的作用，目前未見(jiàn)明確報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以課題組前期芯片篩查DN相關(guān)miRNA結(jié)果為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病小鼠腎臟組織表達(dá)異常的miR-451。qPCR結(jié)果顯示miR-451在高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中較低糖組顯著下降，提示它可能在DN中發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)表明高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞較低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞炎癥標(biāo)志物IL-18和TNF-α顯著升高，明確高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。在高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中高表達(dá)miR-451，IL-18和TNF-α表達(dá)均下降，而在低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中沉默miR-451后，IL-18和TNF-α表達(dá)水平顯著增高，提示miR-451對(duì)DN系膜細(xì)胞炎癥發(fā)生具有調(diào)控作用。然而，miR-451在DN炎癥中的作用究竟如何，需要我們進(jìn)一步研究。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Psmb8的3’UTR存在與miR-451 5’端第2～8個(gè)堿基(即“種子序列”)完全互補(bǔ)的堿基位點(diǎn)，且該序列在包括小鼠、大象、黑猩猩和牛等多種物種中高度保守，同時(shí)通過(guò)雙螢光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明了Psmb8是miR-451的直接靶基因[8]。Psmb8是位于人類6號(hào)染色體短臂、含有6個(gè)外顯子區(qū)域、長(zhǎng)度為4 219 bp的編碼基因，其編碼蛋白能夠與Psmb9和Psmb10共同構(gòu)成由4個(gè)七聚體層疊形成的空心圓柱樣免疫蛋白酶體[14]。免疫蛋白酶體能夠降解甲基化的炎癥核心調(diào)控因子核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的抑制蛋白IκB，使處于抑制狀態(tài)NF-κB活化，啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)相應(yīng)炎癥相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[15]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)[3,5]已經(jīng)證明高糖環(huán)境下，MCs中經(jīng)免疫蛋白酶體活化的NF-κB能夠誘導(dǎo)包括IL-18和TNF-α等在內(nèi)的炎癥相關(guān)因子基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，表明Psmb8能夠通過(guò)構(gòu)成的免疫蛋白酶體而活化NF-κB，促進(jìn)DN炎癥的發(fā)生與發(fā)展。在對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)Psmb8的特異性抑制能夠減少炎癥因子的分泌，從而延緩炎癥的發(fā)生[16]；Koerner等[17]研究發(fā)現(xiàn)Psmb8參與的炎癥反應(yīng)與結(jié)腸直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。以上結(jié)果提示Psmb8與DN炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，且miR-451可靶向調(diào)控Psmb8的表達(dá)，因此Psmb8受到我們的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下，MCs中Psmb8表達(dá)明顯升高，且沉默Psmb8的表達(dá)可顯著抑制炎癥相關(guān)因子IL-18和TNF-α的表達(dá)，提示Psmb8可能參與DN炎癥過(guò)程。同時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中高表達(dá)miR-451后，Psmb8表達(dá)水平下降；反之，在低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中沉默miR-451后，Psmb8表達(dá)水平則增高。以上結(jié)果提示miR-451對(duì)DN系膜細(xì)胞炎癥發(fā)生具有調(diào)控作用，且該作用可能通過(guò)靶向Psmb8得以實(shí)現(xiàn)，從而參與DN的發(fā)生、發(fā)展。

Figure 3.The effect of miR-451 on the expression of Psmb8 in the mouse mesangial cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsL-MC anti-miR-451 group;△△P<0.01vsH-MC miR-451 group.
圖3腎小球系膜細(xì)胞中高、低表達(dá)miR-451對(duì)Psmb8蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.The effect of Psmb8 on the protein expression of IL-18 and TNF-α in mouse mesangial cells.A:the efficiency of siPsmb8 in H-MC siRNA-2 group was the highest when compared with that in H-MC siRNA-1 and H-MC siRNA-3 groups； B:the protein expression levels of IL-18 and TNF-α were increased in H-MC group compared with L-MC group,while those were decreased whenPsmb8 was silenced in H-MC siPsmb8 group compared with H-MC group.Mean±SD.n=3.▲▲P<0.01vsH-MC siRNA-2 group;**P<0.01vsL-MC group;△△P<0.01vsH-MC group.
圖4腎小球系膜細(xì)胞中低表達(dá)Psmb8對(duì)IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)的影響

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