陳　琦，李雄英，唐夏燾

(1杭州市第三人民醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 310009； 2浙江省特種設(shè)備檢驗研究院，浙江 杭州310020)

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)經(jīng)近10年的上市應(yīng)用，對EGFR突變的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者有較好的臨床療效，但頻繁出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象限制了其進一步的應(yīng)用[1-3]。因此，如何克服 EGFR-TKIs 耐藥以及尋找能夠逆轉(zhuǎn)這種耐藥作用的藥物是目前研究的重要內(nèi)容。欖香烯(β-elemene)是提取于莪術(shù)根莖具有廣泛抗癌作用的有效成分，是我國自行研發(fā)的一種抗癌藥物，對多種腫瘤細胞具有抑制作用并且已經(jīng)引入到臨床的治療使用中[4-6]。有文獻報道肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)能誘導(dǎo)肺癌細胞對吉非替尼(gefitinib，Gef)產(chǎn)生原發(fā)和繼發(fā)性耐藥[7-8]。本研究旨在研究欖香烯對HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥人肺腺癌PC-9細胞的影響，并探討其可能機制。

材　料　和　方　法

1　材料

欖香烯、DMSO、SU11274(c-Met抑制劑)和HGF購自Sigma；吉非替尼購自阿斯利康制藥有限公司；非小細胞肺癌PC-9細胞購自上海中國科學(xué)院細胞庫；MTT購于碧云天生物技術(shù)有限公司；抗GAPDH、c-Met、p-Met、AKT及p-AKT抗體購自Cell Signaling。

2　主要方法

2.1細胞培養(yǎng)及藥物處理PC-9細胞于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中。細胞貼壁生長良好，每3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。后續(xù)實驗細胞加藥處理順序及時間如下：HGF處理24 h后,再分別加入SU11274、欖香烯或吉非替尼處理24 h。

2.2MTT法檢測細胞活力取對數(shù)生長期細胞以5.0×107/L的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度藥物處理。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，每孔再加DMSO 150 μL，在酶標(biāo)儀490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。每個濃度設(shè)平行重復(fù)6孔，實驗重復(fù)3次。計算細胞存活率：細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

2.3Transwell小室實驗取對數(shù)生長期PC-9細胞，消化細胞于無血清培養(yǎng)基，制成8×107/L的細胞懸液，在Transwell小室的上室中加入含有不同濃度藥物的細胞懸液200 μL，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦掉基質(zhì)膠及上室未穿膜的細胞，甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色40 min。100倍鏡下隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)目，取平均值。

2.4Western blot法檢測蛋白水平各組細胞經(jīng)RIPA裂解液裂解30 min，冰上進行操作。收集到EP管，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度定量，加入緩沖液于95～100 ℃煮沸5 min，即為樣本蛋白。每個泳道蛋白樣品10 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE后，利用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別加入對應(yīng) I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入對應(yīng) II 抗室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影、定影后進行分析。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗均重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用Bonferroni檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　欖香烯對肺癌PC-9細胞活力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，隨著給藥劑量的增加，欖香烯對肺癌細胞的生長抑制率呈顯著上升趨勢，在給藥24 h后，欖香烯的半數(shù)抑制濃度(half maximal mhibitory concentration，IC50)為169.31 mg/L。結(jié)果表明，欖香烯作用肺癌PC-9細胞后，細胞活力被顯著抑制，見圖1。

Figure 1.The effect of β-elemene on the cell viability in diffe-rent groups after 24 h.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L.
圖1不同濃度的欖香烯對肺癌PC-9細胞活力的影響

2　c-met抑制劑SU11274對HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥細胞的影響

首先，我們用MTT法檢測不同濃度的SU11274對PC-9細胞生長的抑制作用，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的不斷增加，其生長抑制率也隨之增加。由于1 μmol/L的SU11274對PC-9細胞生長幾乎沒有抑制作用，故選擇1 μmol/L的SU11274進行后續(xù)實驗。吉非替尼作用于HGF(50 μg/L)誘導(dǎo)的細胞后，其IC50值比吉非替尼單獨作用組明顯增高，而SU11274聯(lián)合不同濃度吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)的細胞后，在相同藥物濃度下細胞存活率比單獨吉非替尼作用組明顯降低，其IC50值明顯降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.SU11274 increased inhibition of cell activity induced by Gef.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L.
圖2SU11274增強Gef誘導(dǎo)的細胞生長抑制

3　欖香烯逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥

MTT實驗結(jié)果顯示，肺癌PC-9細胞對吉非替尼敏感，隨著吉非替尼濃度的增加，其對PC-9細胞生長的抑制作用不斷增強，IC50為0.30 μmol/L。加入外源性HGF(50 μg/L)作用24 h對肺癌PC-9細胞的生長具有明顯的促進作用，且能誘導(dǎo)PC-9細胞對吉非替尼耐藥，其IC50為0.66 μmol/L。由上述欖香烯MTT實驗結(jié)果可知，低濃度的欖香烯對細胞活力無明顯的抑制作用，故選擇10 mg/L濃度作為后續(xù)實驗濃度。10 mg/L欖香烯與吉非替尼聯(lián)合作用于由HGF誘導(dǎo)吉非替尼耐藥的PC-9細胞時，欖香烯可有效地逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥，吉非替尼的IC50值為0.31 μmol/L，見圖3。

Figure 3.The effects of β-elemene on IC50value of Gef in PC-9 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGef;##P<0.01vsGef+HGF.
圖3欖香烯逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥

4　在外源性HGF存在的情況下，欖香烯聯(lián)合吉非替尼對肺癌PC-9細胞侵襲能力的影響

Transwell小室實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，HGF能顯著提高肺癌PC-9細胞的侵襲能力(P<0.01)；在外源性HGF存在的情況下，與吉非替尼單獨作用組相比，欖香烯聯(lián)合吉非替尼能明顯抑制肺癌PC-9細胞的侵襲能力(P<0.01)，見圖4。

5　欖香烯聯(lián)合吉非替尼對由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥PC-9細胞c-Met通路相關(guān)蛋白的影響

Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，HGF可顯著上調(diào)p-Met及其下游p-AKT的蛋白水平，提示HGF能明顯刺激肺癌PC-9細胞中c-Met和AKT蛋白的磷酸化；在外源性HGF存在的情況下，與吉非替尼作用組相比，欖香烯聯(lián)合吉非替尼能明顯抑制由HGF激活的c-Met和AKT磷酸化水平(P<0.01)，各作用組對c-Met和AKT總蛋白表達變化不大，見圖5。

討　　論

近年來我國肺癌死亡率呈明顯上升趨勢，已躍居腫瘤死因的第1位，其中非小細胞肺癌約占肺癌的80%。由于大多數(shù)肺癌患者在診斷時已處晚期，因而失去了很多早期治療的機會[9]。隨著分子靶向藥物的面世，尤其是EGFR-TKIs的出現(xiàn)，為晚期NSCLC的治療開辟了新的治療途徑。吉非替尼是一種口服的可逆性EGFR抑制劑，其可進入細胞內(nèi)，直接作用于EGFR的胞內(nèi)區(qū)，干擾三磷酸腺苷結(jié)合，抑制酪氨酸激酶的磷酸化，從而阻斷細胞增殖和血管生成，促進腫瘤細胞調(diào)亡[10-11]。吉非替尼在臨床應(yīng)用過程中，對EGFR突變的NSCLC患者有較好的臨床療效[12]，然而頻繁出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象限制了其進一步的發(fā)展[13-14]。

Figure 4.The impact of β-elemene on HGF-induced resistance to Gef in PC-9 cells was determined by Transwell migration assay (×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsGef+HGF group.
圖4欖香烯對由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥PC-9細胞侵襲能力的影響

Figure 5.The protein levels of p-Met and p-AKT in HGF-induced resistance to Gef in PC-9 cells treated with β-elemene.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsGef+HGF group.
圖5欖香烯對由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥PC-9細胞中c-Met及其下游通路相關(guān)蛋白表達水平的影響

盡管近年來關(guān)于腫瘤細胞耐藥性的研究很多，但是，由于這些逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物本身具有的毒性而阻礙了其臨床廣泛應(yīng)用，所以真正進入臨床的藥物就更少了。中草藥毒副作用較小，是逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的重要研究方向。欖香烯是從天然中草藥姜科姜黃屬植物莪術(shù)中提取分離的倍半萜烯類化合物，目前廣泛用于多種惡性腫瘤的治療，且取得了較好的治療效果[15]，近年研究發(fā)現(xiàn)它可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥[16-17]。

NSCLC患者存在原發(fā)性或獲得性對EGFR-TKIs耐藥，其耐藥機理尚未完全明確，EGFR的二次突變與MET基因的擴增被認為是吉非替尼獲得性耐藥的重要機制。研究報道，在EGFR-TKIs耐藥患者中，?？蓹z測到HGF的過表達。HGF與特異性c-Met受體結(jié)合而發(fā)揮作用，促進多種組織細胞增生分裂、細胞運動和血管生成[18]。c-Met廣泛存在于多種正常組織細胞和體內(nèi)外惡性腫瘤細胞內(nèi)。異常的HGF/c-Met信號途徑與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在NSCLC患者中c-Met陽性表達者比c-Met陰性表達者存活率低，HGF和c-Met共表達者比任何一種陽性表達者或者兩種均陰性表達者相比存活率明顯降低[19]。然而，目前欖香烯逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥是否通過HGF/c-Met信號通路尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，外源性HGF(50 μg/L)對肺癌PC-9細胞的生長有明顯的促進作用，同時誘導(dǎo)吉非替尼耐藥。欖香烯聯(lián)合不同濃度吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)耐藥的PC-9細胞時其存活率比吉非替尼單獨作用時明顯降低，說明欖香烯能逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥。同時，HGF能顯著提高肺癌PC-9細胞的侵襲能力，而欖香烯能削弱由HGF誘導(dǎo)的肺癌PC-9細胞的侵襲能力。HGF能明顯增加肺癌PC-9細胞中p-Met和p-AKT的表達水平；與吉非替尼組相比，欖香烯聯(lián)合吉非替尼能明顯抑制由HGF激活的c-Met和AKT磷酸化。相同的是，使用c-Met抑制劑SU11274聯(lián)合吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)PC-9細胞時其存活率也比吉非替尼單獨作用時明顯降低。

綜上所述，本實驗初步研究表明欖香烯能夠逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)肺癌PC-9細胞的吉非替尼耐藥，其機制可能與抑制HGF活化的c-Met及其下游信號通路有關(guān)。

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