賈淑青，方銳華，莫金雪

(1廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 511457； 2廣州市第一人民醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510180)

皮膚是人體最大的器官，能夠保護(hù)機(jī)體免于物理?yè)p傷，皮膚經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的紫外線和輻射等損傷后，皮膚組織細(xì)胞中的DNA等發(fā)生斷裂，導(dǎo)致皮膚發(fā)生癌變[1]。皮膚鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱鱗癌)是一種常見的皮膚惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，具有發(fā)展快、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)1參與核小體結(jié)構(gòu)的變化過(guò)程和相關(guān)基因的表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。HDAC1在前列腺癌、腎細(xì)胞癌和卵巢癌等腫瘤組織中表達(dá)升高，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[2-6]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transdu-cer and activator of transcription 3，STAT3)信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，STAT3磷酸化后，STAT3信號(hào)通路激活，細(xì)胞凋亡受到抑制[7-9]。有研究表明，抑制STAT3信號(hào)通路能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[10-13]。本研究以皮膚鱗癌細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)探討HDAC1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，以期為靶向HDAC1治療皮膚鱗癌提供理論基礎(chǔ)。

材　料　和　方　法

1　材料

HDAC1小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和小干擾RNA陰性對(duì)照(siRNA negative control，siRNA NC)為廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑為Invitrogen產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒為Thermo產(chǎn)品；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品； 抗STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3單克隆抗體均為SAB產(chǎn)品；抗HDAC1多克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品。HDAC1和GAPDH引物由TaKaRa合成。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)皮膚鱗癌細(xì)胞A431購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技。用含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將保存于液氮罐中的細(xì)胞放于37 ℃條件下不停地?fù)u動(dòng)，使細(xì)胞在1 min內(nèi)融化，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，將上層液吸除后，加入5 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度超過(guò)80%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化傳代。

2.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，分別轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA和siRNA NC，記為HDAC1 siRNA組和siRNA NC組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(control)組，control組細(xì)胞不進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分別取HDAC1 siRNA和siRNA NC各12.5 μL，分別與250 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基混合，室溫環(huán)境下孵育5 min；取Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑與250 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基混合，在室溫靜置5 min；將稀釋后的siRNA和稀釋后的Lipofectamine 2000混合后，室溫環(huán)境下靜置20 min，后加入到細(xì)胞密度約為60%的A431細(xì)胞中，孵育6 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HDAC1的mRNA表達(dá)分別取培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞，加入1 mL Trizol，混勻后裂解5 min。加200 μL氯仿，劇烈振蕩反應(yīng)15 s后，靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。吸取500 μL上清液于EP管中，加入500 μL的異丙醇溶液，混合后，靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。用75%的乙醇洗滌RNA 2次后，室溫條件下晾干。用DEPC水溶解后，保存于-80 ℃。HDAC1 的上游引物序列為5’-AACTGGGGACCTACGG-3’，下游引物序列為5’-ACTTGGCGTGTCCTT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游引物序列為5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。 PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min； 95 ℃ 20 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，分析HDAC1的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.4Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HDAC1的蛋白表達(dá)分別取培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞完全裂解后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取蛋白上清液，按照BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合煮沸后進(jìn)行凝膠電泳，使用10%的分離膠和5%的濃縮膠，90 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入到分離膠的底部；100 V電壓將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%牛血清白蛋白在37 ℃封閉90 min。加入 I 抗 (1∶1 000倍稀釋)，4 ℃雜交過(guò)夜；再加入II抗(1∶2 000倍稀釋)，室溫孵育90 min。顯色后，用Quantity One對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析，內(nèi)參照基因?yàn)镚APDH，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力取各組細(xì)胞以每孔3 000個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃孵育4 h。棄上清液，在細(xì)胞中加入二甲基亞砜150 μL，待細(xì)胞結(jié)晶物融化后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔波長(zhǎng)490 nm處的吸光度(A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集106個(gè)細(xì)胞，用200 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，于室溫環(huán)境下，避光反應(yīng)15 min，再加300 μL緩沖液，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.7Western blot檢測(cè)細(xì)胞中STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3的蛋白水平取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，按照2.4的方法提取細(xì)胞蛋白，并用Western blot檢測(cè)STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3的蛋白水平，內(nèi)參照為GAPDH，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.8抑制STAT3信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡的影響HDAC1 siRNA組細(xì)胞用STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490(40 μmol/L)處理后48 h(記為HDAC1 siRNA+AG490組)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力(步驟參照2.5)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡(步驟參照2.6)，Western blot檢測(cè)STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3水平(步驟參照2.7)。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用方差分析并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HDAC1的表達(dá)

RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與control組比較，siRNA NC組中HDAC1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均無(wú)顯著差異；HDAC1 siRNA組細(xì)胞中 HDAC1 的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，說(shuō)明HDAC1 siRNA能夠有效抑制皮膚鱗癌細(xì)胞中HDAC1的mRNA和蛋白表達(dá)，見圖1。

2　HDAC1對(duì)細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組比較,HDAC1 siRNA組的細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，說(shuō)明干擾HDAC1表達(dá)能抑制皮膚鱗癌細(xì)胞的活力，見圖2。

3　HDAC1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與control組比較，HDAC1 siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明干擾HDAC1表達(dá)能促進(jìn)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡，見圖3。

Figure 1.The expression level of HDAC1 in transfected cells.A:the mRNA level of HDAC1; B:Western blot was used to determine the protein expression of HDAC1.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HDAC1表達(dá)水平的變化

Figure 2.The effect of HDAC1 on the cell viability.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖2HDAC1對(duì)細(xì)胞活力的影響

4　HDAC1對(duì)細(xì)胞STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與control組比較HDAC1 siRNA組細(xì)胞中的STAT3水平無(wú)顯著差異，p-STAT3水平明顯降低(P<0.05)，cleaved caspase-3水平明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明干擾HDAC1表達(dá)能夠促進(jìn)皮膚鱗癌細(xì)胞中cleaved caspase-3的蛋白水平，抑制p-STAT3的蛋白水平，見圖4。

Figure 3.The effect of HDAC1 on the apoptosis.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖3HDAC1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4.The effect of HDAC1 on the protein levels of STAT3,p-STAT3 and cleaved caspase-3 in the cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖4HDAC1對(duì)細(xì)胞中STAT3、p-STAT3和cleavedcaspase-3蛋白水平的影響

5　STAT3信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞活力的影響

如圖5所示，與HDAC1 siRNA組比較，HDAC1 siRNA+AG490組的細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，說(shuō)明STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490能夠協(xié)同HDAC1 siRNA抑制皮膚鱗癌細(xì)胞的活力，見圖5。

Figure 5.The effect of STAT3 signaling pathway inhibitor AG490 on the cell viability.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHDAC1 siRNA group.
圖5STAT3信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞活力影響

6　STAT3信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

如圖6所示，與HDAC1 siRNA組比較，HDAC1 siRNA+AG490組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，STAT3蛋白水平無(wú)顯著差異，p-STAT3蛋白水平明顯降低(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490能夠協(xié)同HDAC1 siRNA促進(jìn)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡。

討　　論

HDAC1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙?；?，其編碼的蛋白含有482個(gè)氨基酸，在非組蛋白和組蛋白的去乙酰過(guò)程化中發(fā)揮重要作用，能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1在腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)[15]。朱鑫等[16]通過(guò)免疫組化和RT-PCR的方法檢測(cè)了51例腎透明細(xì)胞癌標(biāo)本和24例癌旁組織中HDAC1的陽(yáng)性表達(dá)率依次為62%和37%，HDAC1的mRNA水平依次為0.35和0.10。鐘麗穎等[17]研究表明，小干擾RNA靶向抑制HDAC1表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的凋亡率增加，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢。研究表明，干擾HDAC1 siRNA表達(dá)后的大腸癌細(xì)胞SW480的細(xì)胞凋亡率高達(dá)31%[18]。之后的研究報(bào)道稱，干擾HDAC1 siRNA表達(dá)能夠抑制舌鱗癌、宮頸癌和胃癌等多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[19-20]。本研究結(jié)果顯示，干擾HDAC1 siRNA表達(dá)后的皮膚鱗癌細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡率增加，與之前的研究報(bào)道相符合，均說(shuō)明干擾HDAC1表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

Caspase蛋白家族成員的活性位點(diǎn)上均含有一個(gè)半胱氨酸蛋白酶，能夠特異性地切割某些蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。Caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活后細(xì)胞凋亡發(fā)生[21]。Caspase-3是caspase蛋白家族成員之一，是凋亡的執(zhí)行因子，caspase-3活化后生成cleaved caspase-3，標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段。Caspase-3參與多種腫瘤相關(guān)基因和藥物調(diào)控胃癌、肺癌和口腔癌等癌細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程[22]。Ho 等[23]研究表明，小檗堿能夠通過(guò)調(diào)控caspase-3的表達(dá)影響舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，干擾HDAC1表達(dá)后的皮膚鱗癌細(xì)胞中cleaved caspase-3水平升高，這提示，干擾HDAC1表達(dá)可能通過(guò)提高cleaved caspase-3的水平促進(jìn)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡。

STAT3信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡過(guò)程，與腫瘤、心血管等疾病的發(fā)生有關(guān)[24]。有研究表明，腫瘤組織中p-STAT3水平異常升高，細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路異常激活[25]。AG490是STAT3信號(hào)通路是上游酪氨酸激酶JAK的抑制劑，能夠抑制細(xì)胞內(nèi)STAT3信號(hào)通路的激活[26]。用AG490作用于腫瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制作用，細(xì)胞凋亡增加[27]。本研究結(jié)果顯示，干擾HDAC1表達(dá)后皮膚鱗癌細(xì)胞中p-STAT3水平下降，而用AG490作用后細(xì)胞凋亡率升高更多，細(xì)胞活力下降更多。這提示，降低HDAC1表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控STAT3信號(hào)通路影響皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡。

Figure 6.The effect of STAT3 signaling pathway inhibitor on apoptosis.A:the results of flow cytometry for analyzing the cell apoptosis; B:the results of Western blot for determining the protein levels of p-STAT3,STAT3 and cleaved caspase-3.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHDAC1 siRNA group.
圖6STAT3信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡影響

HDAC1除了能夠通過(guò)調(diào)控STAT3信號(hào)通路影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以外，還可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase-1，DNMT-1)結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)控影響E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄[28]。在T淋巴細(xì)胞惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)HDAC1能夠與STAT3結(jié)合形成HDAC1-DNMT1-STAT3復(fù)合物，隨后有關(guān)學(xué)者又在骨肉瘤細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物的形成，并且該復(fù)合體還可以通過(guò)調(diào)控SHP-1酪氨酸磷酸酶(SHP-1 tyrosine phosphatase)與STAT結(jié)合區(qū)域SIE/GAS 的表觀遺傳性抑制細(xì)胞增殖[29-30]。HDAC1對(duì)腫瘤的作用機(jī)制十分復(fù)雜，對(duì)于HDAC1影響皮膚鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的作用機(jī)制還需要后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，降低HDAC1表達(dá)能夠抑制皮膚鱗癌細(xì)胞活力，促進(jìn)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本研究為后續(xù)進(jìn)一步探討HDAC1在皮膚鱗癌中的作用奠定了基礎(chǔ)，為靶向HDAC1治療皮膚鱗癌提供了理論依據(jù)。本研究只在體外初步探討了HDAC1在皮膚鱗癌中的作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)HDAC1在癌癥中的具體作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，并會(huì)對(duì)HDAC1調(diào)控STAT3信號(hào)通路影響癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制做深入探討。

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