李文桂,陳雅棠

重慶醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，Pf）和間日瘧原蟲（P.vivax，Pv）是寄生人體的2種常見瘧原蟲，可分別引起惡性瘧和間日瘧。大量研究[1-7]表明，用X線照射的瘧原蟲子孢子或紅內期原蟲、熱滅活的紅內期原蟲以及去除紅細胞的裂殖體免疫小鼠均可有效對抗瘧原蟲子孢子的攻擊。Renia等[8]認為瘧原蟲疫苗大體經歷了全蟲疫苗、減毒活疫苗和分子疫苗這幾個階段，但全蟲疫苗幾乎不能誘導宿主產生有效的保護力，減毒活疫苗存在恢復毒力和臨床感染的風險，單個重組蛋白疫苗的免疫效果較差，這就需要進一步研制新型疫苗。

Pfs25和Pvs25存在于瘧原蟲的配子、合子和動合子的表面，是相對分子質量（Mr）為25 000的受精后抗原，具有4個串聯的表皮生長因子樣結構域、大量半胱氨酸殘基和復雜的四聚體結構，在動合子穿透蚊胃上皮及動合子轉為卵囊的過程中起重要作用。呂芳麗等[9]將100 μg的pCDPfs25肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后10和20 d加強2次，在首次免疫后40 d發(fā)現血清IgG升高，脾細胞增殖，CD8+T細胞數目增加；Shimp等[10]將Pfs25與銅綠假單胞菌的外蛋白A（exopro?tein A，EPA）融合為Pfs25-EPA，將2.5 μg融合蛋白加鋁佐劑皮下注射CD1鼠，在首次免疫后4周加強1次，在首次免疫后6周發(fā)現血清IgG升高75倍；Kongkasuriyachai等[11]將 25 μg的 VR1020-Pvs25肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后5和10周加強2次，在首次免疫后100 d發(fā)現血清IgG、IgG1和IgG2a升高，間接免疫熒光（IFA）證實此血清識別Pv合子內的Pvs25蛋白，這些研究表明Pfs25和Pvs25是2種有希望的疫苗分子。

微生物通常對人體具有一定的致病性，隨著對微生物致病機制研究的深入，人們發(fā)現編碼微生物的毒力因子或編碼關鍵代謝途徑的酶基因突變以及控制微生物在體內生存的調節(jié)基因失活，均可使微生物減毒且保留高度的免疫原性。隨后人們構建了根癌農桿菌、酵母菌、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等微生物的減毒株，這些減毒株均可成為有希望的疫苗載體。在此，我們就微生物介導的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗的研制現狀做簡要綜述。

1 細菌介導的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗

1.1 重組根癌農桿菌

1983年Fraley等[12]首次將細菌基因導入植物細胞，而Curtiss等[13]在煙草種子中成功表達了變形鏈球菌的表面蛋白抗原，這為研制轉基因植物疫苗提供了可行性。Jones等[14]將Pfs25基因插入pGRD4得pGRD-Pfs25，電穿孔轉化根癌農桿菌（Agrobacterium tumefacieu，At）的 GV3101株，真空浸染煙草的子葉，培育轉基因植株；SDS-PAGE證實轉基因植株表達Mr為46 000的Pfs25-FhCMB-6His融合蛋白；將 5 μg融合蛋白加 Al（OH）3佐劑肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后3周加強1次，在首次免疫后6周發(fā)現血清IgG滴度為1∶3318～1∶5835，標準膜飼養(yǎng)試驗（standard membrane feed?ing assay，SMFA）發(fā)現首次免疫后6周的鼠血清在體外抑制蚊胃卵囊的發(fā)育，抑制率為92%。

Blaborough等[15]將Pvs25基因插入pGRD4得pGRD4-Pvs25，電穿孔轉化根癌農桿菌GV3101株，轉染煙草子葉，培育轉基因植株；SDS-PAGE發(fā)現轉基因煙草表達Pvs25-FhCMB融合蛋白；將50 μg融合蛋白加Abisco-100佐劑腹腔注射免疫BALB/c鼠，在首次免疫后3周加強1次，在首次免疫后6周發(fā)現血清IgG升高，IFA證實此血清可識別Pv的合子和動合子；合子發(fā)育試驗（zygote de?velopment assay，ZDA）發(fā)現此血清抑制蚊胃卵囊的發(fā)育，抑制率為65%～74%；在首次免疫后6周腹腔注射106伯氏瘧原蟲ANKA234株的子孢子進行攻擊，在攻擊后6～12 d發(fā)現鼠血瘧原蟲的數目減少。

1.2 重組酵母菌

酵母菌及其菌體成分是有效的佐劑，與抗原結合后形成免疫刺激復合物，促進免疫應答。Gozar等[16]將Pfs25基因插入pIXY154得pIXY155，轉化釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2905株，篩選培養(yǎng)陽性菌株；免疫印跡發(fā)現Pf患者血清識別重組菌表達Mr為39 000的Pfs25蛋白；將1250 pmol重組蛋白加Al（OH）3佐劑腹腔注射免疫CAF1鼠，在首次免疫后3和6周加強2次，在首次免疫后12周發(fā)現脾細胞增殖，血清IgG升高，該血清可抑制血涂片中Pf配子體的發(fā)育。Zou等[17]將 25 μg重組蛋白加 Al（OH）3佐劑腹腔注射免疫BALB/c鼠，在首次免疫后3、6和9周加強3次，在首次免疫后12周發(fā)現血清IgG升高，該血清在體外可抑制血涂片中Pf配子體的發(fā)育。雷青等[18]將Pfs25基因分別插入pPIC9和pGAPZαA得pPIC10和pGAP-10，分別電穿孔轉化畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115株，篩選陽性菌株，命名為IC-PfS25和GAP-PfS25；然后再將pIC10電轉GAP-PfS25株，篩選培養(yǎng)陽性菌株IC-GAP-PfS25；免疫印跡發(fā)現Pf患者血清識別血涂片中的Pfs25蛋白，但未進行保護力試驗。

2 病毒介導的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗

2.1 重組腺病毒

Schuldt等[19]認為腺病毒血清型 5（Adenovirus serotype 5，Ad5）以及猩猩腺病毒血清型63（Chim?panzee adenovirus serotype 63，ChAd63）是2種有希望的疫苗載體，均可有效表達瘧原蟲的外源抗原；重組腺病毒可誘導記憶性T細胞，誘發(fā)長期應答，可誘導CD8+T細胞反應；外源抗原表達在衣殼蛋白纖維或六環(huán)上可以提高疫苗效率，降低毒副作用。Goodman等[20]將 1×1010病毒顆粒（viral particles，VP）的 ChAd63-Pfs25肌肉注射 BALB/c鼠，在首次免疫后10周肌肉注射1×107PFU的MVA-Pfs25進行加強，發(fā)現血清IgG在首次免疫后2～12周升高，在首次免疫后12周達較高水平，血清IgG1和IgG2a增加；SMFA試驗表明首次免疫后12周血清抑制蚊胃卵囊的發(fā)育；在首次免疫后12周腹腔注射106伯氏瘧原蟲ANKA234株子孢子進行攻擊，在攻擊后3 d用斯氏按蚊（Anopheles stephensis）叮咬24 h，叮咬24 h后解剖蚊胃，發(fā)現蚊胃的卵囊數目減少67%～93%。Miyata等[21]將5.1×109PFU的rAd5-Pvs25皮下或肌肉注射BALB/c鼠,在首次免疫后3、5和7周加強3次，在末次反應后2周發(fā)現血清IgG升高，SMFA試驗證實皮下或肌肉注射組的血清顯著降低蚊胃的卵囊數目，減囊率分別為82.4%～87.8%和82.9%～98.6%。

2.2 重組牛痘病毒

Sutter等[22]發(fā)現牛痘病毒的減毒株可表達流感病毒的核殼蛋白、麻疹病毒的融合蛋白F以及呼吸道合胞病毒的糖蛋白等。Tine等[23]以Pf基因組DNA為模板擴增Pfs25基因，插入pMLB得pMLB-Pfs25，加牛痘病毒減毒株NYVAC共同轉化HeLa細胞，篩選培養(yǎng)重組病毒；免疫印跡發(fā)現Pf患者血清識別MYVAC-Pfs25表達Mr為25 000的Pfs25蛋白；將108PFU重組病毒肌肉注射恒河猴，在首次免疫后2和26周加強2次，發(fā)現血清IgG在首次免疫后2～35周升高，在首次免疫后6周達較高水平；IFA表明首次免疫后28周血清識別血涂片Pf的Pfs25蛋白。

2.3 重組桿狀病毒

昆蟲桿狀病毒表達系統是一個真核表達系統，可提高外源基因的表達效率，可對表達產物進行糖基化、磷酸化和蛋白切割等。Blagborough等[24]用桿狀病毒雙表達系統（Baculovirusdual ex?pression system，BDES）表達 Pvs25，將 5×107PFU的BDES-Pvs25肌肉注射或滴鼻免疫BALB/c鼠，在首次免疫后3、6和9周加強3次，在首次免疫后11周發(fā)現血清 IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b升高，此時腹腔注射106伯氏瘧原蟲ANKA234株的子孢子進行攻擊，在攻擊后3 d用50只斯氏按蚊叮咬小鼠，叮咬后24 h解剖蚊胃，計數卵囊數目，發(fā)現肌肉注射組和滴鼻免疫的卵囊數目分別下降83.8%和92.1%。

環(huán)子孢子蛋白（circumsporozoite protein，CSP）位于成熟子孢子的表面，是Mr為40 000～60 000的細胞前期抗原，在子孢子入侵肝細胞時起關鍵作用。Epstein等[25]發(fā)現pCD-PfCSP肌肉注射健康志愿者可產生有效的免疫應答。由于宿主MHC分子的多樣性和瘧原蟲抗原結構的復雜性，宿主將針對抗原的多個表位產生免疫反應，使得單一抗原成分誘導宿主產生的保護性免疫應答效果往往較低，因此，將PvCSP和Pvs25抗原的編碼基因連接起來可能更為有效。Mizutani等[26]用BDES表達Mr為110 000的PvCSP-Pvs25融合蛋白，將1×108PFU的BDES-PvCSP-Pvs25肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后3和6周加強2次，在首次免疫后8周用3～7只感染伯氏瘧原蟲的斯氏按蚊叮咬15 min進行攻擊，攻擊后5～7 d發(fā)現免疫組的原蟲血癥為0.01%～0.77%，而對照組為0.12%～1.69%。

3 結語

盡管大部分現有微生物介導的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗可誘導宿主產生一定的保護性免疫應答，但它們產生的保護力通常較低，遠未達到人們所期望的水平；轉基因植物疫苗的質量控制和認證較難，普遍不被公眾認可和接受[27]；酵母表達系統的蛋白表達水平較高，但其加工修飾與天然蛋白質存在差異；腺病毒的自身蛋白及其雙鏈RNA可作為免疫佐劑，但病毒載體有潛在致癌和致病性，人群普遍存在抗腺病毒的抗體，影響其免疫效果；重組牛痘病毒的安全性和有效性值得進一步的關注；昆蟲桿狀病毒表達蛋白可以糖基化和磷酸化，但其修飾位點與天然蛋白不同。

隨著現代分子生物學和分子免疫學等技術的發(fā)展，人們將對瘧原蟲的基因組學、蛋白質組學、代謝組學、轉錄組學及表觀遺傳學進行深入研究，從而弄清瘧原蟲的抗原結構與功能的關系，篩選新的抗原分子，構建由各期抗原分子組成的多期多價疫苗；研究這些疫苗的免疫原性、轉化效率、MHC限制性以及能否長期在宿主體內表達；研制新型佐劑、疫苗載體和制備融合抗原，提高疫苗的免疫原性；在人體內正確評價新型疫苗分子的保護力及其免疫機制；積極開展瘧原蟲抗原蛋白家族及其他相關蛋白生物學功能研究，提高疫苗的設計水平；探索瘧原蟲的體外培養(yǎng)、功能試驗、遺傳變異、分子病理和理想的動物模型；由于瘧原蟲已對氯喹產生抗藥性以及蚊媒對殺蟲劑DDT產生耐受性，還需要研制新型滅瘧藥和殺蟲劑。相信隨著這些問題的闡明，必將推動微生物介導的瘧原蟲Pfs25和Pvs25疫苗研究躍上一個新的臺階。

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