黃　琦，沙　輝，陳　龍，呂龍龍，徐聲鳴，張澤天，趙　松，靳鳳艷，牛　豐

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院脊柱外科，吉林 長春 130021；2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種以骨組織局灶性、軟組織病變和彌漫性骨髓浸潤為主要病理特征的骨髓惡性B淋巴細(xì)胞疾病，多發(fā)于中老年人群，近年來其發(fā)病率出現(xiàn)了逐漸增高的趨勢。慢性淋巴細(xì)胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)是主要發(fā)生在中老年人群的一種成熟淋巴細(xì)胞克隆增殖性腫瘤，其特征為外周血、骨髓、脾臟和淋巴結(jié)等處的小淋巴細(xì)胞聚集。MM與CLL存在著相似的發(fā)病機(jī)制和演進(jìn)過程，特別是當(dāng)MM患者某種首發(fā)癥狀突出時(shí)，極易導(dǎo)致與CCL混淆，造成誤診[1-2]。因此，探討這2種疾病的分子生物學(xué)標(biāo)志物的區(qū)別與聯(lián)系具有重要的臨床意義。近年來的研究[3-4]顯示：長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，很多種lncRNA在特定腫瘤中呈現(xiàn)特異性的表達(dá)，針對(duì)lncRNA在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)中應(yīng)用價(jià)值的研究已成為近年來的熱點(diǎn)問題。研究[3,5]顯示：lncRNA MALAT1、LincRNA-p21和GAS5的表達(dá)異常可能參與了MM和CLL的病理過程，但國內(nèi)外目前缺乏將這3種lncRNA作為血液標(biāo)志物用于MM臨床診斷的研究報(bào)道，基于這一研究現(xiàn)狀，本研究針對(duì)MM和CLL患者血漿lncRNA MALAT1、LincRNA-p21和GAS5的表達(dá)水平及其診斷意義進(jìn)行檢測和分析，旨在闡明3種lncRNA在MM與CLL鑒別診斷中的意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2014年6月—2015年6月本院收治的60例MM患者(MM組)、60例CLL患者(CLL組)和60名健康體檢者(對(duì)照組)作為研究對(duì)象，MM組和CLL組患者均符合吳曉芝主編的《血液病診斷與鑒別診斷圖譜(2009年版)》[6]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，均表現(xiàn)為B細(xì)胞的克隆性增殖，患者均為首診病例且未接受過任何抗腫瘤治療；排除并發(fā)有活動(dòng)性傳染性疾病、急慢性肝炎、其他種類惡性腫瘤、精神疾患、腦卒中、重要器官器質(zhì)性病變及入組前1個(gè)月有嚴(yán)重創(chuàng)傷或手術(shù)史的患者。對(duì)照組研究對(duì)象均經(jīng)各項(xiàng)臨床檢查排除血液系統(tǒng)惡性腫瘤、心肝腎等器官嚴(yán)重?fù)p害，各組研究對(duì)象的臨床資料見表1和2。所有納入研究對(duì)象均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)本院醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

表1各組研究對(duì)象的臨床資料

Tab.1Clinical data of subjects in various groups

(n=60)

表2　MM組和CLL組患者臨床分期

“-”：No data.

1.2觀察指標(biāo)和檢測方法采集各組研究對(duì)象的空腹外周靜脈血標(biāo)本，分離血漿后采用Tripure分離試劑(德國Roche公司)提取血漿總RNA，提取過程按照生產(chǎn)商的產(chǎn)品推薦流程進(jìn)行，提取物保存于-80℃的冰箱中待測，根據(jù)生產(chǎn)商的推薦采用第一鏈基因cDNA合成試劑盒(美國Themo Scientific公司)、LightCyler 480實(shí)時(shí)定量PCR儀(德國Roche公司)對(duì)血漿標(biāo)本中的lncRNA MALAT1、LincRNA-p21和GAS5進(jìn)行擴(kuò)增和定量檢測，以cel-miR-39為內(nèi)參，初始熱啟動(dòng)為10 min，經(jīng)45個(gè)周期的擴(kuò)增，每個(gè)周期包括變性(10 s、95℃)、退火(60℃、20 s)，擴(kuò)增(72℃、30 s)等過程，目的lncRNA的引物序列見表3。讀取目的lncRNA及內(nèi)參的循環(huán)閾值(Ct值)，并計(jì)算目的lncRNA 與cel-miR-39的Ct 值差值(△Ct)，以2-△△Ct的數(shù)值代表目的lncRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表3　目的lncRNA引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由于目的lncRNA相對(duì)表達(dá)水平不服從正態(tài)分布，故采用中位數(shù)+四分位數(shù)(M，Q1，Q3)的形式表示，多組間比較采用多組計(jì)量數(shù)據(jù)的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H法)，兩兩比較采用Mann-Whitney U法，應(yīng)用Bonferroni法調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)，目的lncRNA在CLL和MM診斷中的價(jià)值應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC曲線)進(jìn)行分析，以ROC曲線下面積(AUC)作為評(píng)價(jià)診斷價(jià)值的指標(biāo)，取約登指數(shù)最大時(shí)為最佳篩選界值(Cutoff值)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Bonferroni法調(diào)整后檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.017)。

2　結(jié)　果

2.1各組研究對(duì)象血漿目的lncRNA相對(duì)表達(dá)水平各組研究對(duì)象血漿目的lncRNA相對(duì)表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=71.903、47.212、45.822，P<0.05)；MM組患者血漿lncRNA MALAT1和GAS5相對(duì)表達(dá)水平明顯高于其他2組(P<0.05)，CLL組患者血漿LincRNA-p21相對(duì)表達(dá)水平明顯低于其他2組(P<0.05)；CLL組與對(duì)照組研究對(duì)象血漿lncRNA MALAT1和GAS5相對(duì)表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MM組與對(duì)照組研究對(duì)象血漿LincRNA-p21相對(duì)表達(dá)水平比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4　各組研究對(duì)象血漿目的lncRNA相對(duì)表達(dá)水平

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with CLL group.

2.2目的lncRNA在MM和CLL診斷中的價(jià)值ROC曲線分析顯示：在剔除CLL組患者后，MM組患者血漿lncRNA MALAT1和GAS5的 AUC分別為0.898和0.815，95% 置信區(qū)間(CI)分別為0.836～0.959和0.740～0.890，與對(duì)角線下面積0.5(對(duì)照組)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明lncRNA MALAT1和GAS5對(duì)于MM有診斷價(jià)值；而LincRNA-p21對(duì)于MM無診斷價(jià)值(P>0.05)。見表5和圖1。在剔除MM組患者后，CLL組患者血漿LincRNA-p21 AUC為0.850，95% CI為0.780～0.921，與對(duì)角線下面積0.5(對(duì)照組)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明LincRNA-p21對(duì)于CLL有診斷價(jià)值；而lncRNA MALAT1和GAS5 對(duì)于CLL無診斷價(jià)值(P>0.05)。見表6和圖2。

表5　目的lncRNA在MM診斷中的價(jià)值分析

“-”:No data.

A:MALAT1； B:LincRNA-p21； C:GAS5.

表6　目的lncRNA 在CLL診斷中的價(jià)值分析

“-”:No data.

A:MALAT1； B:LincRNA-p21； C:GAS5.

2.3目的lncRNA在CLL和MM鑒別診斷中的價(jià)值在剔除對(duì)照組研究對(duì)象后，以CLL組患者為對(duì)照病例進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示：MM組患者血漿lncRNA MALAT1、LincRNA-p21和GAS5的AUC分別為0.878、0.778和0.805，95% CI分別為0.814～0.942、0.691～0.865和0.727～0.882，與CLL組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明其對(duì)MM和CLL的鑒別診斷均有價(jià)值。見表7和圖3。

表7　 目的lncRNA在MM和CLL鑒別診斷中的價(jià)值分析

A:MALAT1; B:LincRNA-p21; C:GAS5.

3　討　論

在人類的基因組中，編碼蛋白質(zhì)基因僅占2%，多達(dá)70%的人類基因只被轉(zhuǎn)錄成RNA，故人類基因組包含更多的非編碼RNA信息，在RNA轉(zhuǎn)錄本中，除了經(jīng)典的rRNA和tRNA等“看家”RNA和最近發(fā)現(xiàn)并明確定義的微小RNA(microRNAs, miRNAs)外，還包括lncRNA，其長度超過200個(gè)核苷酸并具有高度的保守性。目前的研究[5，7]已證實(shí)：哺乳動(dòng)物的基因組能夠編碼產(chǎn)生1 000多種lncRNA，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)了5 446個(gè)lncRNA相關(guān)基因。每種lncRNA均具有一定的結(jié)構(gòu)和生化特性，能夠參與細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控、免疫監(jiān)視、胚胎干細(xì)胞的功能發(fā)育等多種生物學(xué)過程。研究[3,8]顯示：lncRNA參與腫瘤的發(fā)病和進(jìn)展過程，但這些lncRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響機(jī)制并不十分清楚。腫瘤細(xì)胞和組織中RNA表達(dá)水平具有一定的不穩(wěn)定性，而且取材較為困難，相比之下，非細(xì)胞系統(tǒng)的循環(huán)RNA表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，特別是血漿或血清中RNA檢測數(shù)據(jù)的可重復(fù)性更高。雖然目前針對(duì)外周循環(huán)中tRNA和miRNA表達(dá)量的研究較多，而對(duì)于循環(huán)lncRNA與腫瘤相關(guān)性的研究較少，但血液中游離的lncRNA是對(duì)于B淋巴細(xì)胞性惡性腫瘤具有重要意義的生物學(xué)標(biāo)志物。

研究[8]顯示：血液疾病患者的基因異常表達(dá)可通過多個(gè)相互作用的途徑對(duì)骨髓瘤細(xì)胞、骨髓細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和基質(zhì)細(xì)胞表面受體產(chǎn)生影響，從而參與腫瘤的生長、存活、遷移和耐藥。本研究選取MALAT1、LincRNA-p21和GAS5作為目的lncRNA，其中，LincRNA-p21被認(rèn)為是一種具有抑癌活性的lncRNA，LincRNA-p21的命名源于其是鄰近p21基因的1個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，能夠形成1個(gè)復(fù)雜并互相作用的RNA復(fù)合物，參與抑制腫瘤細(xì)胞抑制P53蛋白過程[9]。GAS5作為一種生長抑制特異基因，可對(duì)糖皮質(zhì)激素及其受體發(fā)揮抑制作用并對(duì)淋巴和乳腺細(xì)胞的存活發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10-11]。目前的研究[12-13]已證實(shí)：GAS5與前列腺癌、腎細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均有相關(guān)性。MALAT1是轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌基因1的基因符號(hào)，已被證明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)等多種組織系統(tǒng)中表達(dá)，MALAT1主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)并對(duì)其基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用[14-15]。MALAT1能夠在細(xì)胞周期的選擇性剪接調(diào)控中發(fā)揮作用，研究[16-17]已證實(shí)：MALAT1的過表達(dá)與發(fā)生在肺、結(jié)腸和膀胱等處實(shí)體腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示：MM患者血漿lncRNA MALAT1和GAS5相對(duì)表達(dá)水平較高，提示血漿lncRNA MALAT1和GAS5的高表達(dá)與MM的發(fā)病有關(guān)，而血漿LincRNA-p21的低表達(dá)則與CLL的發(fā)病有關(guān)，檢測上述3種lncRNA的血漿相對(duì)表達(dá)水平在MM和CLL診斷中具有重要的價(jià)值，可作為臨床診斷的輔助指標(biāo)。在本研究中嘗試性地計(jì)算出3種lnRNA在診斷MM、CLL及MM與CLL鑒別診斷中的Cutoff值，可供進(jìn)一步研究作為參考。眾所周知，p53基因缺失是與MM和CLL等血液系統(tǒng)疾病的發(fā)病高度相關(guān)的事件，而LincRNA-p21的低表達(dá)可導(dǎo)致對(duì)p53抑制基因的作用下降，且其下調(diào)水平與CLL的疾病分期也具有相關(guān)性，這與17p13缺失與CLL的相關(guān)性具有一致性[18]。而GAS5和MALAT1的高表達(dá)則可對(duì)MM的發(fā)病發(fā)揮促進(jìn)作用，GAS5的上調(diào)可對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用，使細(xì)胞保持更多的細(xì)胞周期，而降低MM腫瘤細(xì)胞的GAS5表達(dá)可提升對(duì)于化療藥物的敏感性，白血病細(xì)胞的GAS5表達(dá)水平也可作為預(yù)測淋巴細(xì)胞存活率的指標(biāo)[19]。研究[20]顯示：在CLL和MM患者外周血中GAS5表達(dá)水平降低，這有待于進(jìn)一步的研究予以討論和證實(shí)。MALAT1具有一定的組織特異性， MALAT1在B細(xì)胞惡性腫瘤組織中的表達(dá)水平低于在實(shí)體瘤中的表達(dá)水平，但很多實(shí)體瘤患者外周循環(huán)中的MALAT1表達(dá)水平并不呈現(xiàn)明顯的上調(diào)[21]。循環(huán)MALAT1與B細(xì)胞惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有更加密切的聯(lián)系，MM患者血漿MALAT1的高表達(dá)可能發(fā)揮干擾骨髓微環(huán)境、促進(jìn)骨髓腫瘤細(xì)胞的增殖等作用[20, 22-24]，但其詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，血漿lncRNA MALAT1和GAS5的高表達(dá)與MM的發(fā)病有關(guān)，而血漿LincRNA-p21的低表達(dá)與CLL的發(fā)病有關(guān)，上述3種lncRNA的血漿相對(duì)表達(dá)水平可作為MM和CLL診斷的輔助指標(biāo)。

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