朱　博，滿枋霖，劉　鵬，佟海濱，田　丹， 孫　新

(1.北華大學生命科學研究中心，吉林 吉林 132013；2.北華大學附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，吉林 吉林 132011)

近三十年來我國男性的生育能力呈逐年下降趨勢，男性生育能力下降及男性不育發(fā)病率增加的原因，除了遺傳因素、性腺感染、獲得性睪丸損傷及免疫性因素等明確原因外，約70%的男性不育病因未明確，有研究者[1-2]認為導致男性精液質(zhì)量下降的主要原因是近年來工業(yè)化帶來的不良影響。近年來室內(nèi)裝修引起的室內(nèi)空氣污染問題越來越多地引起了人們的普遍關注，甲醛是一種常見的室內(nèi)空氣污染物，室內(nèi)裝修用的膠合板等人造板材、絕緣保溫材料以及為了提高粘合度不可避免地釋放一些甲醛[3-4]。在室內(nèi)環(huán)境中苯和苯系物是各種油漆和溶劑型涂料(如聚氨脂樹脂等)的添加劑、稀釋劑[5]。一些防水材料及家具中多使用氨水作為添加劑和增白劑；氨類物質(zhì)也存在于混凝土中，隨著溫度、濕度等環(huán)境因素變化而還原成氨氣從混凝土中慢慢釋放出來，導致室內(nèi)空氣中氨濃度不斷增高，形成氨氣污染[6]。研究[7]顯示：暴露于甲醛環(huán)境中雄性小鼠的睪丸間質(zhì)細胞中睪丸激素(StAR、P450scc和3β-HSD)的表達受到抑制，從而抑制了小鼠的性功能和精子發(fā)生。Naghdi等[8]研究發(fā)現(xiàn)：甲醛對雄鼠附睪尾部精子造成嚴重損傷，包括明顯增加非運動精子的百分比以及降低性成熟系數(shù)。

目前的研究主要集中在甲醛等單一揮發(fā)性污染物對雄鼠生殖系統(tǒng)及生殖功能的影響方面，然而在新裝修室內(nèi)甲醛伴隨著其他揮發(fā)性污染物共同存在，因此本研究采用甲醛、二甲苯和氨復合氣體(formaldehyde,xylene and ammonia，F(xiàn)XA)模擬室內(nèi)裝修主要揮發(fā)性污染物環(huán)境，探討其與雄鼠不育的關系。本研究通過雄性小鼠靜式染毒動物實驗，初步闡明裝修污染與雄性小鼠精子質(zhì)量的關系，尤其是與雄鼠少精癥和弱精癥的關系，在此基礎上分析其可能的機制。本研究旨在為探索構建有益于人類健康的生活空間提供有利的依據(jù)，并為裝修污染物導致男性不育的治療藥物的開發(fā)提供新的靶點。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器健康清潔級ICR雄性小鼠20只，購于吉林省長春市億斯實驗動物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)-2011-0004，7周齡，體質(zhì)量(20±2)g。飼養(yǎng)于北華大學生命科學中心動物房，環(huán)境溫度為(23±3)℃，相對濕度為35%～55%，每天12 h日光與12 h黑暗交替，清潔衛(wèi)生按本實驗室相關標準操作規(guī)程要求進行。Caspase-9抗體、Cleaved-Caspase-3抗體和β-Actin抗體購于美國Abcam公司，Goat anti-Mouse IgG(HRP)第二抗體和Goat anti-Rabbit IgG(HRP)第二抗體購于美國ProteinTech公司。CX31生物顯微鏡和CX21FS1光學顯微鏡(日本Olympus公司)，WLJY-9000精子質(zhì)量分析儀(北京偉力公司)，F(xiàn)ACS Aria流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2實驗分組將20只ICR雄性小鼠隨機分為實驗組(染毒組)和對照組(未染毒組)，每組10只，采用3%～5%苦味酸(黃色)在小鼠背部皮毛上染色標記，將每只小鼠標號。于2個鼠籠分別飼養(yǎng)，實驗期間小鼠自由飲食。

1.3染毒方法裝修后室內(nèi)揮發(fā)性有機污染物甲醛、二甲苯和氨復合氣體濃度分別波動于0.1～4.0 mg·m-3、0.05～5.00 mg·m-3和≤0.4 mg·m-3[9]。由于考慮到種系差異系數(shù)和接觸作用時間及空間的差異，將參考文獻[9]結果中濃度最大值的100倍設為實驗組染毒濃度。甲醛、二甲苯和氨復合氣體濃度分別為60、50和40 mg·m-3。根據(jù)染毒濃度、受試物比重及染毒柜的容積采用下列公式計算出加入液態(tài)受試物的量。M= n×L/100×ρ。公式中：n表示實驗設計受試物量(mg·L-1)，L表示染毒柜容積(L)，ρ表示受試物密度，M表示應加入受試物的量(mL)。將得到的濃度換算整理后，甲醛、二甲苯和氨復合氣體的使用量分別為28、29和22 μL·m-3。自制硬質(zhì)塑料透明染毒柜(正在申報專利)，容積為50 L，適用于10只小鼠2 h呼吸量。將實驗組小鼠逐一放入染毒柜中，分別取甲醛、二甲苯和氨于燒杯中，將燒杯置于染毒柜進行受試物的混配吸入染毒，每天密閉靜式染毒2 h，小鼠染毒期間禁食水，其余時間自由飲食；同時對照組小鼠每天放于充滿空氣的受試物染毒柜中，每天密閉2 h，期間禁食水，其余時間自由飲食。35 d后處死，進行各項指標檢測。

1.4小鼠行為學觀察染毒期間，每天觀察并記錄小鼠的外觀特征、毛發(fā)光亮程度、食水量、行為、大小便及中毒情況。觀察小鼠是否有籠頂爬行、懸掛、后翻和高跳等異常行為。

1.5小鼠體質(zhì)量觀察染毒期間每天固定時間(16:00)稱小鼠體質(zhì)量，記錄其體質(zhì)量增長情況，以染毒第1天的體質(zhì)量增長率為0.00%，分別計算對照組和實驗組每7 d的體質(zhì)量增長率。第n個7 d體質(zhì)量增長率=[第n個7 d的體質(zhì)量-第(n-1)個7 d的體質(zhì)量]/[第(n-1)個7 d的體質(zhì)量]×100%。實驗組和對照組雄性小鼠每7 d的平均體質(zhì)量增長率可說明2組小鼠體質(zhì)量差異及染毒期間雄性小鼠體質(zhì)量變化情況。

1.6小鼠精子濃度、活力和畸形率測定染毒35 d后，小鼠頸椎脫臼處死，固定于鼠板，75%乙醇消毒小鼠下腹部，剖開腹腔，取出睪丸及附睪，剔除周邊筋膜組織，生理鹽水漂洗，濾紙吸干，準確稱量附睪質(zhì)量，置于1 mL、37℃預熱的PBS中，用眼科剪將附睪剪碎，放置于37℃恒溫箱靜置15 min，待精子游離出來，300目尼龍網(wǎng)過濾入1.5 mL EP管中。然后取10 μL精子懸液置于精子計數(shù)板，用精子質(zhì)量分析儀進行分析，并記錄精子密度和活力[10]。根據(jù)Cooper等[10]提供的小鼠精子畸形率判定標準計算精子畸形率。精子畸形率=(畸形精子數(shù))/(計數(shù)精子總數(shù))×100%。

1.7小鼠精子凋亡率測定實驗組和對照組各取3只小鼠，按1.6分別制作精子懸液，然后用PBS(4℃預冷)調(diào)整精子濃度為2×106mL-1。取1 mL精子懸液，預冷PBS洗滌，離心(300 g，10 min)，棄上清重復2次，加入1 mL Annexin Ⅴ Binding Buffer 重懸混勻，取出100 μL放入EP管中，加入FITC-Annexin Ⅴ 5 μL和PI 10 μL染色，室溫下避光15 min后加入400 μL孵育緩沖液，1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測。結果以細胞凋亡率表示。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。每組做3次平行試驗并進行統(tǒng)計學分析。

1.8Western blotting法檢測睪丸組織中Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白水平按照上述步驟解剖小鼠，取出睪丸組織，提取小鼠睪丸組織總蛋白。在96孔板中依次加入不同濃度的蛋白標準品和蛋白樣品10 μL，再加入200 μL BCA工作液，將酶標板放在振蕩器上震蕩30 s，37℃孵育15 min。用酶標儀測定562 nm處波長的吸光度(A)值，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

Western blotting法參照Sun等[11]的實驗方法。一抗：分別用Caspase-9抗體、Cleaved Caspase-3抗體和β-actin抗體。二抗：Goat anti-Rabbit IgG抗體。對電泳條帶采用Image J軟件進行灰度值掃描，與β-actin條帶進行對比獲得各自蛋白的相對表達水平，并對各目的蛋白進行半定量分析。

2　結　果

2.12組小鼠的行為學染毒開始，實驗組小鼠受到FXA的刺激有明顯的抓耳、搔鼻現(xiàn)象，并且有興奮(跳躍、躁動不安)及多動行為；30 min后大多數(shù)小鼠表現(xiàn)為直立、持續(xù)跳動和狂躁等行為，個別小鼠出現(xiàn)神經(jīng)刺激癥狀，但無死亡與中毒現(xiàn)象；1 h后小鼠基本處于抑制狀態(tài)(群居和少動)，出現(xiàn)皮毛蓬松和稀便等癥狀。對照組小鼠未受到受試物的刺激，小鼠表現(xiàn)為眺望、修飾、游走和探究等正常行為。

2.22組小鼠體質(zhì)量增長率與對照組比較，實驗組小鼠在染毒后的第1周(0～7 d)、第2周(8～14 d)、第3周(15～21 d)和第4周(22～28 d)小鼠體質(zhì)量增長緩慢(P<0.05)；在染毒的第5周(29～35 d)2組小鼠體質(zhì)量增長率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.32組小鼠精子濃度、活力和畸形率實驗組小鼠精子濃度、活力及畸形率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。染毒35 d后，取對照組和實驗組小鼠附睪精子，精子濃度分別為(28.03±2.03)×106mL-1和(20.23±1.96)×106mL-1，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；精子活力分別為(62.70±4.00)%和(38.24±8.03)%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；精子畸形率分別為(31.21±6.61)%和(24.20±4.29)%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組小鼠精子中出現(xiàn)斷頭精子比率明顯多于對照組。見圖1。

表12組小鼠體質(zhì)量增長率

GroupIncreaserateofbodyweight1-7d8-14d15-21d22-28d29-35dControl20．04±4．9913．09±4．5612．26±3．0011．29±2．268．08±2．17Experimental9．09±2．97?6．85±0．75?7．63±1．78?7．99±1．42?6．54±1．40

*P<0.05 compared with control group.

A: Control group; B: Experimental group.

Fig.1Morphology of epididymal sperms of mice in two groups

2.42組小鼠附睪中精子凋亡率染毒35 d后實驗組小鼠附睪精子凋亡率(53.95%±0.57%)明顯高于對照組(1.03%±0.01%)(P<0.01)。見圖2。

A: Control group; B: Experimental group.

Fig.2Apoptosis of epididymal sperms of mice in two groups

2.52組小鼠睪丸組織中Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平實驗組Caspase-9蛋白和Cleaved Caspase-3蛋白表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，內(nèi)參蛋白β-actin表達量基本相同。見圖3。通過Image J軟件進行灰度分析結果顯示：實驗組Caspase-9蛋白表達水平(45.73±1.47)與對照組(47.11±4.98)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而Cleaved Caspase-3蛋白表達條帶很淺，幾乎無表達(4.22±0.20vs4.18±1.33)。

Lane 1:Control group;Lane 2:Experimental group.

圖32組小鼠睪丸組織中Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表達電泳圖

Fig.3Electrophoregram of expressions of Caspase-9 and Cleaved Caspase-3 proteins in testis tissue of mice in two groups

3　討　論

人類處于室內(nèi)環(huán)境的時間可長達生命的87%[12]，而老弱病殘者、孕產(chǎn)婦和嬰幼兒等敏感人群在室內(nèi)的時間更長，因此室內(nèi)環(huán)境的居住質(zhì)量直接影響著人類的學習與工作，關系著人類的生存與健康。近年來，由于含有能夠揮發(fā)出有害化學物質(zhì)的建筑、人造板裝飾及家具材料的大量使用使得室內(nèi)環(huán)境的污染日益嚴重[13]。民居中常見且被大家熟知的室內(nèi)揮發(fā)性有機物主要有甲醛、苯及苯系物和氨。企業(yè)在生產(chǎn)人造板材過程中使用以甲醛為主要成分的脲醛樹脂膠黏劑，板材中殘留的和未參與反應的甲醛會逐漸向周圍環(huán)境釋放，導致室內(nèi)環(huán)境空氣污染嚴重。甲醛釋放期：一般板材(夾芯板)3～5 年；人造密度板(高密纖維板)則長達15 年[14]；在室內(nèi)環(huán)境中苯和苯系物是各種油漆和溶劑型涂料的添加劑、稀釋劑[5]；一些防水材料及家具中多使用氨水作為添加劑和增白劑，另外混凝土的防凍劑、高堿混凝土膨脹劑和早強劑中多使用氨水作為添加劑[6]。新房裝修后，甲醛以很高的濃度共存于室內(nèi)，可能對暴露人群發(fā)揮著聯(lián)合毒性效應[14-15]。

本研究結果顯示：染毒開始受到甲醛、二甲苯及氨刺激的實驗組小鼠有明顯的抓耳、搔鼻且有興奮(跳躍、躁動不安)及多動行為。30 min后大多數(shù)小鼠表現(xiàn)為直立、持續(xù)跳動和狂躁等行為，但無死亡與中毒現(xiàn)象。1 h后基本處于抑制狀態(tài)(群居和少動)，出現(xiàn)皮毛蓬松、稀便等癥狀。對照組小鼠未受到受試物的刺激，小鼠表現(xiàn)為眺望、修飾、游走和探究等正常行為。此類不良反應可能是由受試物刺激小鼠呼吸道導致的呼吸道黏膜刺激癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)刺激癥狀所致。

目前關于室內(nèi)揮發(fā)性污染物的生殖發(fā)育毒性的研究主要是研究單一毒物的作用，各種污染物的聯(lián)合生殖與發(fā)育毒性研究相對較少，這與現(xiàn)實人群聯(lián)合暴露的實際環(huán)境不相符合。因此本實驗以3種主要室內(nèi)裝修污染物模擬裝修污染內(nèi)環(huán)境，實驗結果顯示：染毒28 d后室內(nèi)裝修污染物能夠明顯抑制雄性小鼠體質(zhì)量增長，降低雄性小鼠附睪尾部精子數(shù)量和活力、增加雄性小鼠附睪尾部精子畸形率，同時導致雄性小鼠附睪尾部精子凋亡率增加。本研究結果顯示：本實驗所用的染毒劑量和暴露時間，未造成雄性小鼠睪丸組織中凋亡蛋白Caspase-9和Cleaved Caspase-3表達變化。鄒學敏等[14]研究發(fā)現(xiàn)：苯與甲醛聯(lián)合染毒可觀察到睪丸組織結構出現(xiàn)曲細精管形態(tài)不規(guī)則，邊緣極度不完整，各級精母細胞有不同程度的變性、缺失和管腔發(fā)育成熟的精子明顯減少等病變?？紤]本實驗可能是由于染毒劑量小、染毒時間短，尚未引起睪丸組織中凋亡相關因子改變。另一方面，室內(nèi)裝修主要污染物損傷雄鼠附睪精子，但其睪丸組織未發(fā)生損傷時，若及時脫離污染環(huán)境是否會使雄鼠附睪精子質(zhì)量得以恢復有待于進一步深入研究。

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