楊　易,包康達(dá),周彥兵,袁　超,李　勇,劉曉明,徐金瑞

(寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021)

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的一類癌癥[1-3]。肺腺癌占非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的50%，其主要特征是無限增殖，因此抑制肺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡是治療肺癌的主要策略[4-5]。Wnt5a是一種旁分泌、自分泌型糖蛋白，Wnt5a配體與細(xì)胞跨膜受體結(jié)合，可將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而產(chǎn)生一系列反應(yīng)。研究[6-8]顯示：Wnt5a參與不同腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。Wnt5a可介導(dǎo)不同受體參與調(diào)節(jié)不同Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并最終導(dǎo)致不同的結(jié)果。目前尚未見有關(guān)Wnt5a信號(hào)調(diào)控人肺腺癌細(xì)胞作用的文獻(xiàn)報(bào)道，因此本研究探討Wnt5a對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549凋亡的作用并闡明其機(jī)制，旨在為深入研究靶向抑制藥物和肺腺癌治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞來源小鼠Wnt 5a過表達(dá)細(xì)胞系(L Wnt-5a ATCC○RCRL-2814TM)和對(duì)照細(xì)胞系(L Cell ATCC○RCRL-2648TM)來源于ATCC細(xì)胞庫，人肺腺癌A549細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑和儀器RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco 公司，美國)，Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒(BD 公司，美國)，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(碧云天公司，中國)，活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(Sigma 公司，美國)，TUNEL原位末端凋亡檢測(cè)試劑盒(Roch公司，德國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR檢測(cè)試劑盒和羊抗兔IgG-HRP(全式金公司，中國)。Wnt5a、C-Capase3 和C-PARP1(CST公司，美國)，Bcl-2、Bax、AIF、Mcl-1和CtyoC(Proteintech公司，美國)，胎牛血清(Thermo公司，美國)，青霉素和鏈霉素(Hyclone公司，美國)。CyFlow○RCube流式細(xì)胞儀(Partec公司，德國)，iQ5熒光定量PCR儀和BioRAD凝膠成像系統(tǒng)(BioRAD公司，美國)。

1.3Wnt5a和C條件培養(yǎng)液制備和細(xì)胞培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[9] 的方法制備Wnt5a和C條件培養(yǎng)液(Wnt5a條件培養(yǎng)液富含Wnt5a蛋白，而C條件培養(yǎng)液中檢測(cè)不到Wnt5a蛋白表達(dá))，-20℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)按1∶1加入新鮮培養(yǎng)液用于細(xì)胞培養(yǎng)。A549細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 2～3 d 傳代1次。

1.4Wnt5a蛋白表達(dá)檢測(cè)將收集的C和 Wnt5a條件培養(yǎng)液離心取上清，定量后煮沸，蛋白上樣量為30 μg。經(jīng)SDS-PAGE后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBS室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，4℃過夜孵育Wnt5a一抗，TBST洗滌3次，加羊抗兔IgG-HRP，繼續(xù)室溫孵育1.5 h后TBST洗滌3次，顯影和定影，X 光片顯色，檢測(cè)Wnt5a蛋白表達(dá)情況。

1.5Wnt5a mRNA表達(dá)檢測(cè)A549細(xì)胞以3×105mL-1接種于6孔板培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁6～8 h，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別加入C和Wnt5a培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，采用RT-PCR法檢測(cè)Wnt5a mRNA表達(dá)。反應(yīng)體系為20 μL，β-actin mRNA退火溫度為58℃，F(xiàn):5′-GGCACCCAGCACAATGAAG-3′，R:5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′；Wnt5a mRNA退火溫度為60℃，F(xiàn): 5′-ACTGTGCCACTTGTATCAGG-3′，R: 5′-CTTCGATGTC-

GGAATTGATA-3′。

1.6A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)以3×105mL-1細(xì)胞密度將A549細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁6～8 h，分別加入Wnt5a(實(shí)驗(yàn)組)和C(對(duì)照組)條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，采用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄拍照。

1.7A549細(xì)胞凋亡率檢測(cè)以3×105mL-1細(xì)胞密度將A549細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁6～8 h，C培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h作為對(duì)照組，處理組Wnt5a條件培養(yǎng)液培養(yǎng)2、4、12、24和48 h后，離心收集細(xì)胞，按說明書方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.8A549細(xì)胞中ROS水平檢測(cè)以3×105mL-1細(xì)胞密度將A549細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁6～8 h， C培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h作為對(duì)照組，同時(shí)處理組Wnt5a條件培養(yǎng)液培養(yǎng)2、12、24和48 h后，離心收集細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗2次，按說明書方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS水平，獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.9線粒體膜電位檢測(cè)以3× 105mL-1細(xì)胞密度將A549細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁6～8 h， C培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h作為對(duì)照組，同時(shí)處理組Wnt5a條件培養(yǎng)液培養(yǎng)2、12、24和48 h，按說明書方法采用用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位。

1.10Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)A549細(xì)胞以3×105mL-1細(xì)胞密度接種于6孔板培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁6～8 h，依次加入C和Wnt5a條件培養(yǎng)液，培養(yǎng) 24 h 后，按照全蛋白提取試劑盒說明提取各組全蛋白，并參考BCA蛋白檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行定量。SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，含5%脫脂奶粉TBS室溫封閉2 h，加入特異性一抗于4℃過夜孵育，次日平衡至室溫，TBST漂洗(酶標(biāo)二抗) ，室溫孵育1.5 h；TBST洗滌3次，用Western Enhance Bright ECL底物顯色，BioRAD成像系統(tǒng)曝光。

2　結(jié)　果

2.1Wnt5a條件培養(yǎng)液中Wnt5a蛋白的表達(dá)Wnt5a處理組能檢測(cè)到Wnt5a蛋白的表達(dá)，而對(duì)照組未檢測(cè)到Wnt5a蛋白表達(dá)。見圖1。

圖1　2組條件培養(yǎng)基中Wnt5a蛋白表達(dá)

Fig.1Expressions of Wnt5a protein in conditioned mediums in two groups

2.2 2組A549細(xì)胞中Wnt5a mRNA表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：Wnt5a處理12 h組和24 h組Wnt5a mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，其中24 h組高出對(duì)照組6倍(P<0.05)，且Wnt5a的刺激呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。見圖2。

2.32組A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)照組未見TUNEL陽性細(xì)胞，經(jīng)DAPI染色，核呈圓形或卵圓形，且大小均一。Wnt5a處理組能觀察到一定數(shù)量的TUNEL染色細(xì)胞，但與DNAase陽性處理組比較，TUNEL染色細(xì)胞明顯減少。見圖3(插頁三)。

*P<0.05 compared with control group.

Fig.2Expression levels of Wnt5a mRNA in A549 cells in two groups

2.4 2組A549細(xì)胞凋亡率在雙變量流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)散點(diǎn)圖中可見：細(xì)胞分落在4個(gè)象限：左下(LL)象限、右下(LR)象限、右上(UR)象限和左上(UL)象限，其中AV陽性細(xì)胞(右上和右下象限)為凋亡細(xì)胞，PI染色單陽細(xì)胞(左上象限)為壞死細(xì)胞。Wnt5a處理A549細(xì)胞后隨時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；與對(duì)照組比較，處理12、24和48 h時(shí)，Wnt5a處理組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；處理2和4 h時(shí)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4和表1。

A:Control group;B-F:Treatment group(2,4,12,24， and 48 h).

GroupApototicrate(η/%)ROSMitochondrialmembranepotentialControl3．70±1．3339．30±1．210．008±0．001Treatment(t/h)24．02±0．4940．72±2．890．013±0．00345．54±1．13-0．036±0．0016--0．078±0．0011212．00±1．111606．51±43．590．097±0．0022410．25±1．56380．77±31．860．117±0．0014812．03±0．431557．51±47．30-

“-”:No data.

2.5 2組A549細(xì)胞中ROS水平流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：Wnt5a組A549細(xì)胞中ROS水平高于對(duì)照組，但是Wnt5a處理不同時(shí)間產(chǎn)生的ROS水平不同。Wnt5a處理12 h時(shí)處理組A549細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平最高(Geo mean值=1 605.51)，24 h時(shí)Wnt5a處理組ROS水平下降(Geo mean值=263.77)，48 h時(shí)處理組ROS水平又回升但未超過12 h時(shí)(Geo mean值=1 557.51)。見圖5和表1。

2.62組A549細(xì)胞線粒體膜電位與對(duì)照組比較，處理組 A549細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低(P<0.01) 。見圖6和表1。

A:Control group;B-E:Treatment group(2,12,24,and 48 h).

A:Control group;B-F:Treatment group(2,4,6,12, and 24 h).

2.72組A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：Wnt5a處理組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族的促凋亡蛋白BAX表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，AIF蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1 表達(dá)量與對(duì)照組比較無明顯變化(P>0.05)。見圖7。

3　討　論

NSCLC占肺癌的85%，大多數(shù)NSCLC就診時(shí)已處于ⅢB期或Ⅳ期，失去根治的機(jī)會(huì)，只能通過化療方法緩解癥狀、延長生存。但化療毒副作用大，尋找有效的分子靶向治療是目前腫瘤專家和科研工作者共同關(guān)注的焦點(diǎn)。目前已有針對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制劑被用于抑制腫瘤細(xì)胞增長，Wu等[10]證實(shí)抑制劑XAV939可以抑制Wnt信號(hào)通路進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。Jia等[11]研究發(fā)現(xiàn)：DKK1表達(dá)水平直接反映了胃癌發(fā)展進(jìn)程，miR-493介導(dǎo)的DKK1下調(diào)了胃癌細(xì)胞的增殖侵襲。Vuga等[12]研究發(fā)現(xiàn)：Wnt5a基因在普通間質(zhì)性肺炎中高表達(dá)，在正常的肺成纖維細(xì)胞中Wnt5a能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，并抑制由H202誘導(dǎo)的凋亡。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)：牛皮癬患者高表達(dá)Wnt5a 基因；在HaCaT和NHK細(xì)胞中采用Knockdown法降低Wnt5a表達(dá)后，抑制了細(xì)胞增殖且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。Yao等[14]研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者Wnt5a高表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良。

圖7　2組A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

Fig.7Expressions of apoptosis-related proteins in A549 cells in two groups

本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，Wnt5a處理組早期凋亡小體明顯增多，利用AV/PI雙染流式術(shù)檢測(cè)Wnt5a組凋亡率較對(duì)照組有增高趨勢(shì)，隨處理時(shí)間延長細(xì)胞凋亡率明顯升高，Wnt5a組A549細(xì)胞中ROS水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其是12和48 h時(shí)。Wnt5a處理組線粒體膜電位低于對(duì)照組，且隨處理時(shí)間延長膜電位下降更明顯。促凋亡蛋白Bax在Wnt5a處理組高表達(dá)，活化的Caspase3蛋白亦為高表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Wnt5a可導(dǎo)致人肺腺癌A549細(xì)胞線粒體膜破壞，JC-1不能聚集到線粒體內(nèi)，而是以單體的形式游離在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，使R3 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，因此 JC-1 單體與多聚體的比值高于對(duì)照組，且隨Wnt5a處理時(shí)間延長而表現(xiàn)為線粒體膜電位降低更明顯。由此可見，Wnt5a是通過降低線粒體膜電位來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Wnt5a通過降低抗凋亡蛋白的表達(dá)水平，提高促凋亡蛋白的含量使線粒體膜孔打開，活化的Caspase3蛋白表達(dá)上調(diào)，活化的PRAP1蛋白表達(dá)上調(diào)，積累放大使細(xì)胞色素C(CytoC)進(jìn)入細(xì)胞，故檢測(cè)到CytoC蛋白表達(dá)上調(diào)，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡發(fā)生。

綜上所述，Wnt5a可以成為肺腺癌的分子靶向基因之一，通過激活Wnt5a誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療肺腺癌的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究治療肺腺癌提供了理論依據(jù)。

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