田大川，李海樂，肖大偉，周山健，蘇永蔚，劉丹平，綦　惠

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院運動與關(guān)節(jié)科，遼寧 錦州 121000; 2.河南省漯河市中心醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，河南 漯河 462000；3.北京市創(chuàng)傷骨科研究所，北京 100035)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)終末期往往造成關(guān)節(jié)缺損且易累及軟骨下骨，主要表現(xiàn)為軟骨組織退變，其發(fā)病機制尚不明確[1]。由于關(guān)節(jié)軟骨本身缺乏血供，因此關(guān)節(jié)軟骨組織發(fā)生損傷后依靠自體修復(fù)的能力有限[2]。近年來，組織工程技術(shù)為軟骨缺損修復(fù)提供了新途徑，軟骨再生支架材料的應(yīng)用現(xiàn)已成為軟骨再生領(lǐng)域的熱點[3]。OA患者的軟骨組織處在低氧和炎癥的環(huán)境中，研究[4]顯示：骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)來源的外泌體在炎癥抑制方面有顯著作用。外泌體是真核細胞內(nèi)多泡體與來源細胞膜融合后分泌到細胞外的膜性小囊泡，直徑為60～100 nm，表面富含膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂和神經(jīng)酰胺等脂類物質(zhì)，其內(nèi)載有蛋白質(zhì)、mRNA和microRNA 等生物信息，在細胞微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。實驗[5-6]證實：突變型低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)可以誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細胞方向分化，生理狀態(tài)下表達的HIF-1α在常氧狀態(tài)下容易降解，要在軟骨缺損處有穩(wěn)定表達，必須有在常氧狀態(tài)下不易被降解的活性HIF-1α存在，在此基礎(chǔ)上通過使基因三點突變而產(chǎn)生一種在常氧下不易降解的HIF-1α。但是并無聯(lián)合應(yīng)用軟骨再生支架與突變型HIF-1α修飾的BMSCs分泌的外泌體(BMSCs-ExoMU)能更有效促進晚期軟骨缺損修復(fù)的相關(guān)報道。因此，本實驗聯(lián)合應(yīng)用真皮來源的軟骨再生支架和BMSCs-ExoMU共同作用于打破兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的動物模型，探討軟骨再生支架聯(lián)合BMSCs-ExoMU對晚期軟骨缺損修復(fù)的作用機制，并將在細胞水平上探討在白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境中BMSCs-ExoMU對軟骨細胞的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器

4周齡清潔級新西蘭兔6只，用于制備軟骨細胞和間充質(zhì)干細胞；2個月齡清潔級新西蘭兔12只，用于動物實驗，所有實驗兔均由錦州醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK(遼)2014-0004。表達人突變型HIF-1α的重組腺病毒[ad-HIF-1α，含綠色熒光蛋白(GFP)基因](上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司),胰蛋白酶、小牛血清和DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，兔抗AKT、p-AKT、p-ERK、p38、p-p38抗體和鼠抗ERK抗體及二抗(英國Abcam公司)，兔Ⅱ型膠原酶、白細胞介素1-β和細胞膜紅色熒光探針(Dil)(美國Sigma-Aldrich公司)，HE、蕃紅O、油紅O、阿爾新藍、茜素紅染色試劑盒和兔間充質(zhì)干細胞成脂肪、成骨誘導(dǎo)液(北京索萊寶生物科技有限公司)，軟骨再生支架(北京積水潭醫(yī)院組織工程研究所)。超速離心機(日本Olympus公司)，凝膠成像儀和凝膠成像分析儀ChemiDocMP(美國Bio-Rad公司)，凝膠電泳裝置JM-250(大連邁捷科貿(mào)有限公司)，正置顯微鏡和倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2細胞培養(yǎng)、細胞轉(zhuǎn)染和鑒定

軟骨細胞提取：將4周齡新西蘭兔處死，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織，消毒后轉(zhuǎn)移入超凈臺內(nèi)，剪碎軟骨組織成1 mm×1 mm×1 mm小塊置于離心管中室溫400 g離心5 min，去上清，加入胰酶置于細胞培養(yǎng)箱中，30 min后400 g離心，棄上清，冷PBS清洗后加入0.2%Ⅱ型膠原酶，置于細胞培養(yǎng)箱，30 min后取出，室溫400 g離心5 min，去上清，加入膠原酶并置于培養(yǎng)箱，分別在4、8和12 h收集上清100 g離心5 min，并用8 mL含15%小牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基沖懸，接種于培養(yǎng)皿中置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，待細胞穩(wěn)定增殖后進行阿爾新藍染色，倒置顯微鏡下觀察被染軟骨細胞。BMSCs提?。悍蛛x兔后肢股骨和脛骨于潔凈培養(yǎng)皿中，消毒后移入超凈臺并加入冷PBS浸泡，切斷股骨和脛骨兩端，用10 mL完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔直至骨頭變白。得到混合液接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。待細胞長滿皿底80%時，胰酶消化離心，1∶2傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗，再對第3代BMSCs經(jīng)成脂肪和成骨方向誘導(dǎo)并進行油紅O與茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察被染細胞。BMSCs鑒定完成后，取第3代BMSCs為實驗對象，長至培養(yǎng)皿底面積的80%時計數(shù)，接種于6孔板內(nèi)(3×106個/孔)，待細胞穩(wěn)定增殖后，將感染復(fù)數(shù)(multiply of infection，MOI)值為150的ad-HIF-1α加入到6孔板中，24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察BMSCs內(nèi)GFP的表達。

1.3提取外泌體

上述傳代生長的BMSCs與突變型HIF-1α修飾的BMSCs長至培養(yǎng)皿底面積約90%，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入含1%青鏈霉素DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集條件培養(yǎng)液于4℃保存。收集細胞條件培養(yǎng)液至300 mL后超速離心機梯度離心。首先300 g、4℃離心15 min去除殘余細胞；然后2 000 g、4℃離心15 min再次去除細胞；10 000 g離心30 min去除細胞碎片；上清液用0.22 μm過濾器濾過并100 000 g離心1 h，去上清后用PBS清洗1次后再次100 000 g離心1 h，去上清并用100 μL PBS沖懸，參照相關(guān)文獻[4]，BCA法測定外泌體水平。4℃保存1周或-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4外泌體形態(tài)觀察及鑒定

1.4.1透射電鏡觀察滴10 μL外泌體懸液于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置使樣本干透，透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)特征。

1.4.2 Western blotting 法檢測外泌體表面特異性蛋白的表達收集野生型HIF-1α和突變型HIF-1α修飾的BMSCs來源的條件培養(yǎng)基各300 mL，梯度超速離心得到的外泌體用100 μL PBS沖懸，采用Western blotting法檢測外泌體特異性表面蛋白CD63和CD81表達。

1.5熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞在體外攝取外泌體

將Dil工作液分別加入至含有10 μL(1 μg· μL-1)BMSCs-ExoWT和BMSCs-ExoMUEP管(1.5 mL)中并置于37℃、5%CO2孵箱30 min，再100 000 g離心1 h，棄上清并用PBS沖洗1次，再100 000 g離心1 h，棄上清并用20 μL PBS沖懸。將懸液加入至軟骨細胞不含血清的培養(yǎng)基中并放入37℃、5%CO2孵箱2、4和8 h，采用熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞攝取外泌體。

1.6Western blotting法檢測在IL-1β介導(dǎo)的炎癥環(huán)境中軟骨細胞中p38、p-p38、AKT、p-AKT、ERK和p-ERK蛋白表達

常規(guī)胰酶消化第3代軟骨細胞，吹打均勻接種至6孔板中，待細胞在孔中穩(wěn)定增殖后，棄上清，用PBS沖洗3次，去除PBS后每孔分別加入1 mL(不含IL-1β和外泌體、含有10 μg·L-1IL-1β、含有10 μg·L-1IL-1β+80 mg·L-1BMSCs-ExoWT、含有10 μg·L-1IL-1β+80 mg·L-1BMSCs-ExoMU)DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，分別作為空白組、炎癥組、BMSCs-ExoWT組和BMSCs-ExoMU組。置于細胞培養(yǎng)箱，24 h后收集細胞，加入裂解液后提取總蛋白，BCA法檢測蛋白水平。SDS-PAGE凝膠分離細胞蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下5%的BSA封閉90 min后，按預(yù)染Marker剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入單克隆抗體4℃搖床過夜。次日TBST洗脫3次，加入二抗室溫孵育1 h，再次洗脫3次后ECL法顯影。所得結(jié)果采用Image-J進行分析，計算軟骨細胞中p38、p-p38、AKT、p-AKT、ERK和p-ERK表達水平。

1.7Hoechst33342染色法在熒光顯微鏡下檢測軟骨細胞凋亡小體

胰酶消化對數(shù)期生長的第3代軟骨細胞，吹打均勻并接種至6孔板，待細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，棄上清，用PBS沖洗3次，去除PBS后每孔分別加入1 mL(不含IL-1β和外泌體、含有10 μg·L-1IL-1β、含有10 μg·L-1IL-1β+80 mg·L-1BMSCs-ExoWT、含有10 μg·L-1IL-1β+80 mg·L-1BMSCs-ExoMU)DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，分別為空白組、炎癥組、BMSCs-ExoWT組和BMSCs-ExoMU組。置于37℃、5%CO2孵箱，培養(yǎng)24 h后進行Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下觀察各組細胞內(nèi)凋亡小體數(shù)目。

1.8動物實驗

1.8.1細胞/軟骨再生支架體外培養(yǎng)上述傳代生長的BMSCs與BMSCsMU，長至約為培養(yǎng)皿底面積65%時，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗1次，常規(guī)胰酶消化制備細胞懸液2 mL，密度為5×107mL-1，將軟骨支架放置于6 cm培養(yǎng)皿中并加入細胞懸液，移至37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)5 h后，加入7 mL DMEM/F12完全培養(yǎng)基，48 h后掃描電鏡下觀察軟骨再生支架上BMSCs黏附情況。

1.8.2 造模實驗兔耳緣靜脈注射10%水合氯醛進行麻醉，把手術(shù)區(qū)域周圍毛剃凈，碘伏消毒，常規(guī)鋪巾。將兔右后肢膝關(guān)節(jié)縱行切開皮膚及關(guān)節(jié)腔，用手搖鉆在股骨髁間受力處鉆一直徑為6 mm深達軟骨下骨的圓形孔洞，造成晚期膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的動物模型。造模后將12只實驗兔隨機分為4組：空白組(注射500 μL生理鹽水于關(guān)節(jié)腔內(nèi))、支架組(注射500 μL生理鹽水并在缺損處填充軟骨支架)、支架+BMSCs-ExoWT組(注射500 μL濃度為20 mg·L-1的BMSCs-ExoWT并填充軟骨支架)和支架+BMSCs-ExoMU組(注射500 μL濃度為20 mg·L-1的BMSCs-ExoMU并填充軟骨支架)。術(shù)后6周處死實驗兔并取材，觀察軟骨缺損愈合程度。

1.8.3軟骨缺損修復(fù)的組織學觀察對各組膝關(guān)節(jié)軟骨進行大體形態(tài)觀察，軟骨標本經(jīng)10%多聚甲醛固定、10%乙二胺四乙酸脫鈣4周、石蠟包埋、切片(2～5 μm)后進行HE和蕃紅O染色，鏡下觀察軟骨修復(fù)程度。

1.9統(tǒng)計學分析

2　結(jié)　果

2.1細胞轉(zhuǎn)染與鑒定

BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色鏡下觀察：部分細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)被染成紅色；BMSCs經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)后油紅O染色鏡下觀察：部分細胞內(nèi)出現(xiàn)被染橘紅色脂肪滴。軟骨細胞阿爾新蘭染色鏡下觀察：細胞呈淡藍色。BMSCs轉(zhuǎn)染4 h后熒光顯微鏡下觀察：細胞內(nèi)有GFP表達。見圖1(插頁一)。

2.2外泌體鑒定

透射電鏡下觀察收集的外泌體，其形態(tài)多為近圓形，有完整膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)有低電子密度小顆粒(圖2A)。Western blotting 法結(jié)果顯示: BMSCs-ExoWT和BMSCs-ExoMU均表達了外泌體表面特異性分子標志物CD63和CD81(圖2B)。

2.3軟骨細胞對外泌體的攝取

采用細胞膜紅色熒光探針(Dil)標記的外泌體與軟骨細胞共孵育2、4和8 h后，熒光顯微鏡下可以觀察到軟骨細胞膜表面存在紅色熒光點，且隨著時間延長細胞表面熒光強度增加，可以進一步證明外泌體被軟骨細胞所攝取。見圖3(插頁一)。

2.4各組軟骨細胞p38、p-p38、AKT、p-AKT、ERK1/2和p-ERK1/2表達水平

與空白組比較，炎癥組p-AKT水平降低(P<0.05)，p-p38和p-ERK水平升高(P<0.05)。與炎癥組比較，BMSCs-ExoWT組p-AKT水平升高(P<0.05)，p-p38和p-ERK水平降低(P<0.05)；BMSCs-ExoMU組p-AKT水平明顯升高(P<0.05)，p-p38和p-ERK水平明顯降低(P<0.05)。與BMSCs-ExoWT組比較，BMSCs-ExoMU組p-AKT水平升高(P<0.05)，p-p38和p-ERK水平降低(P<0.05)。見圖4和表1。

A: Morphology of exosome under transmission electron microscope(×40 000); B: Detection of CD63 and CD81 by Western blotting method;Lane 1: BMSCs-ExoMU; Lane 2: BMSCs-ExoWT.

圖2外泌體的鑒定

Fig.2Identification of exosomes

Lane 1: Blank group; Lane 2: Inflammation group;Lane 3: BMSCs-ExoMUgroup; Lane 4:BMSCs-ExoWTgroup.

圖4各組軟骨細胞中AKT、p-AKT、p38、p-p38、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達電泳圖

Fig.4Electrophoregram of expressions of AKT,p-AKT,p38,p-p38,ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins in chondrocytes in various groups

2.5各組軟骨細胞中凋亡小體的分布

與空白組(2.300±0.949)比較，炎癥組(31.800±4.984)軟骨細胞核內(nèi)凋亡小體明顯增多

表1各組軟骨細胞中蛋白的相對表達水平

Groupp?AKT/β?actinp?ERK1/2/β?actinp?p38/β?actinBlank0．627±0．0620．580±0．0120．489±0．019Inflammation0．601±0．058?1．579±0．024?0．628±0．016?BMSCs?ExoWT0．754±0．531△1．023±0．049△0．547±0．014△BMSCs?ExoMU1．244±0．060△#0．478±0．020△#0．224±0．038△#

*P<0.05 compared with blank group;△P<0.05 compared with inflammation group;#P<0.05 compared with BMSCs-ExoWTgroup.

(P<0.01)；與炎癥組比較，BMSCs-ExoWT組(11.700±2.584)和BMSCs-ExoMU組(3.900±1.524)凋亡小體明顯減少(P<0.01)，且BMSCs-ExoMU組凋亡小體最少。見圖5(插頁一)。

2.6BMSCs與軟骨再生支架的共培養(yǎng)

BMSCs與軟骨再生支架共培養(yǎng)后，BMSCs已滲入軟骨再生支架;BMSCs與軟骨再生支架共培養(yǎng)48 h后，BMSCs穩(wěn)定黏附在軟骨支架孔隙中。見圖6。

2.7各組實驗兔關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)情況

2.7.1 大體形態(tài)空白組缺損面積較大，未能與正常軟骨組織緊密結(jié)合，缺損處與周圍軟骨組織界限明顯，缺損周圍粗糙；支架組軟骨缺損面積較大，缺損處與正常軟骨組織未能緊密結(jié)合，缺損處與周圍軟骨組織界限明顯，缺損深度稍變淺；支架+BMSCs-ExoWT組缺損處有少量修復(fù)組織填充，軟骨缺損面積較前減小，部分軟骨缺損邊際與正常軟骨緊密結(jié)合，深度變淺，表面較前明顯光滑；支架+BMSCs-ExoMU組缺損處被修復(fù)組織填充明顯，富有彈性，缺損面積明顯變小，深度明顯變淺，表面光滑。見圖7(插頁一)。

圖6BMSCs與軟骨再生支架共培養(yǎng)的肉眼(A)和掃描電鏡(B)觀察(Bar=50 μm)

Fig.6Observation of co-culture of cartilage regenerated scaffold with BMSCs by naked eye (A) and SEM (B) (Bar=50 μm)

2.7.2HE染色觀察軟骨組織學形態(tài)空白組軟骨表面褶皺粗糙，結(jié)構(gòu)不規(guī)則，潮線破壞，邊緣骨贅形成，軟骨損傷修復(fù)效果較差；支架組軟骨表面不平，潮線尚完整，局部可見軟骨細胞增生；支架+BMSCs-ExoWT組軟骨表面部分區(qū)域平滑，軟骨細胞增生明顯，缺損修復(fù)較好；支架+BMSCs-ExoMU組缺損處表面光滑，與周圍軟骨結(jié)合較好，細胞排列整齊，缺損處修復(fù)效果明顯。見圖8(插頁一)。

2.7.3蕃紅O-固綠染色觀察軟骨組織學空白組軟骨缺損處有薄層纖維組織填充，軟骨細胞極少，有較多成纖維細胞，缺損修復(fù)較差；支架組未見潮線形成，有少量軟骨細胞生長，可見少量軟骨基質(zhì)，缺損修復(fù)較差；支架+BMSCs-ExoWT組軟骨基質(zhì)較多，軟骨細胞數(shù)量較多，部分細胞體積較小，缺損修復(fù)較好；支架+BMSCs-ExoMU組軟骨細胞基質(zhì)豐富，材料與周圍組織結(jié)合較好，細胞分化良好，形態(tài)類似正常軟骨細胞，缺損修復(fù)明顯。見圖9(插頁一)。

3　討　論

關(guān)節(jié)軟骨損傷和損傷后導(dǎo)致的蛻變是骨科常見的疾病。由于軟骨本身再生能力有限，面積較大的軟骨損傷或缺損很難自行修復(fù)。因此，研究促進關(guān)節(jié)軟骨缺損再生的方法很有現(xiàn)實意義。

研究[7-8]顯示：外泌體在炎癥抑制過程中有顯著作用，并且可以促進OA患者關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)。研究[9-10]顯示：HIF-1α在軟骨細胞生長和分化過程中起著至關(guān)重要的作用,當軟骨缺乏HIF-1α蛋白時會出現(xiàn)大量軟骨細胞死亡現(xiàn)象。但生理狀態(tài)下表達的HIF-1α在常氧狀態(tài)下容易降解，在此基礎(chǔ)上本實驗通過使基因三點突變而產(chǎn)生一種在常氧下不易降解的HIF-1α。研究[11]顯示：生理條件下，膝關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖與凋亡處于動態(tài)平衡，但在OA等病理條件下，軟骨細胞凋亡異常。軟骨細胞凋亡受不同信號通路調(diào)控，PI3K/AKT和p38 MAPK信號通路在OA軟骨細胞凋亡的過程中起著重要作用。PI3K是一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，其代謝產(chǎn)物1，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)與4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)可激活A(yù)KT蛋白上的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化位點，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等[12]；p38 MAPK信號通路存在于哺乳動物的細胞內(nèi)，是MAPKs的亞類之一，炎癥因子IL-1β能有效激活p38信號通路，且激活后的p38又可激活相關(guān)蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控軟骨細胞凋亡[13-14]；MAPK/ERK信號通路是一類細胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞及其核內(nèi)，引起相關(guān)細胞生物學反應(yīng)(如細胞增殖、分化和凋亡等)[15-16]。先期研究[17-20]顯示：炎癥因子IL-1β在體外誘導(dǎo)兔軟骨細胞凋亡同時伴隨著AKT磷酸化水平升高與ERK1/2、p38磷酸化水平降低。本研究結(jié)果顯示：在IL-1β介導(dǎo)的炎癥環(huán)境中，經(jīng)BMSCs-ExoWT和BMSCs-ExoMU處理后，細胞內(nèi)凋亡小體明顯減少，ERK1/2和p38磷酸化水平明顯降低，AKT磷酸化水平明顯升高，且經(jīng)BMSCs-ExoMU處理后的效果更為明顯。

近年來再生醫(yī)學技術(shù)在治療關(guān)節(jié)軟骨損傷過程中已經(jīng)初步顯示出良好效果[3]，但是，材料與外泌體的聯(lián)合應(yīng)用在軟骨缺損修復(fù)方面的研究還鮮有報道。在此基礎(chǔ)上，本課題組合作團隊設(shè)計、開發(fā)了一種免疫原性低、力學強度高、具有良好的微觀孔隙結(jié)構(gòu)和適宜的孔隙率及孔徑大小、有利于細胞的遷入與營養(yǎng)成分的滲入、適宜種子細胞向軟骨方向分化的無細胞的軟骨再生支架，可以促進軟骨缺損修復(fù)。在本研究中，當聯(lián)合應(yīng)用BMSCs-ExoWT、BMSCs-ExoMU與軟骨再生支架作用于軟骨缺損處時，缺損處修復(fù)較為明顯，且BMSCs-ExoMU與軟骨再生支架共同作用于軟骨缺損處時，其修復(fù)效果更加顯著。

綜上所述，本實驗證實了在炎癥環(huán)境中BMSCs-ExoMU可抑制軟骨細胞凋亡，其通過調(diào)控PI3K/AKT、p38 MAPK和MAPK/ERK信號通路明顯下調(diào)ERK1/2和p38磷酸化水平，上調(diào)AKT磷酸化水平，這可能是其控制炎癥反應(yīng)的可能機制之一；本實驗結(jié)果也證實了當BMSCs-ExoMU與軟骨再生支架共同作用于軟骨缺損處時，能更有效促進軟骨缺損修復(fù)。本研究結(jié)果為臨床關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療提供了新的思路。

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