游紫夢(mèng) 冉昕 代亞玲 冉玉平

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚性病科，成都 610041；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，成都 610041)

1 臨床資料

病例1：患兒男，2歲。因“陰囊及肛周紅斑糜爛瘙癢7 d”就診。7 d前陰囊出現(xiàn)紅色米粒大小丘疹，逐漸擴(kuò)大至肛周，融合成紅斑。患兒因瘙癢而摩擦哭鬧。皮膚科情況：陰囊及肛周紅斑，潮濕浸漬，輕度糜爛，周?chē)梢?jiàn)綠豆大小紅色丘疹 (見(jiàn)圖1)。腹股溝淋巴結(jié)無(wú)腫大。皮膚鏡觀察見(jiàn)暗紅色背景上網(wǎng)格狀裂隙，附黃白色鱗屑 (見(jiàn)圖2)。

病例2：患兒女，2歲。因“肛周紅斑瘙癢7 d”就診。7 d前肛周出現(xiàn)米粒大小紅斑，逐漸擴(kuò)大融合，表面附著白色鱗屑?；純阂蝠W而搔抓。皮膚科情況：肛周紅斑，潮濕浸漬，附有白色鱗屑 (見(jiàn)圖3)。腹股溝淋巴結(jié)無(wú)腫大。皮膚鏡觀察見(jiàn)紅色基底上點(diǎn)狀血管及黃白色鱗屑 (見(jiàn)圖4)。

2 實(shí)驗(yàn)室研究

2.1 直接鏡檢

用透明膠帶粘取皮損邊緣，涂于玻片上，用真菌熒光染色液 (伊文思藍(lán)+鈣熒光白，江蘇萊芙特敏)處理，首先加入熒光染料A液1滴，1 min后再加入熒光染料B液1滴，蓋上蓋玻片，吸去多余染液。在普通顯微鏡光源下觀察可見(jiàn)大量分隔菌絲和卵圓形孢子，但顯示不夠清晰 (病例1見(jiàn)圖5a，病例2見(jiàn)圖5b)，切換用熒光顯微鏡觀察同一視野，可清楚顯示大量分隔菌絲和卵圓形孢子 (病例1見(jiàn)圖5c，病例2見(jiàn)圖5d)。

2.2 真菌培養(yǎng)及菌種鑒定

用無(wú)菌棉簽生理鹽水浸潤(rùn)后拭取皮損接種于沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (SDA)中，28℃培養(yǎng)4 d后斜面上長(zhǎng)出乳白色酵母樣菌落 (病例1見(jiàn)圖6a，病例2見(jiàn)圖6b)，轉(zhuǎn)種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)4 d后呈現(xiàn)藍(lán)綠色 (病例1見(jiàn)圖6c，病例2見(jiàn)圖6d)。挑取適量菌落于1 mL人血清中，36℃孵育3 h,鏡下見(jiàn)孢子出芽 (病例1見(jiàn)圖6e，病例2見(jiàn)圖6f)。提取真菌DNA，針對(duì)rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (Inter transcribed spacer,ITS)做PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物測(cè)序，登錄GenBank經(jīng)Blast比對(duì)與白念珠菌 (Candidaalbicans)的ITS序列同源性達(dá)99%。鑒定為白念珠菌 (GenBank登錄號(hào)：KY359387、KY359397)。

2.3 體外藥敏實(shí)驗(yàn)[1-5]

病例1 挑取適量培養(yǎng)菌落與無(wú)菌蒸餾水后充分混勻后涂布在SDA培養(yǎng)基平板 (150 mm)表面制作含菌平板 (2個(gè))，在每個(gè)平板上等距打4孔 (孔徑為7 mm)，一個(gè)含菌平板加入等量市售成品藥物3%氯碘羥喹乳膏 (珂艾林，天津金耀)，1%鹽酸特比萘芬乳膏 (蘭美抒，北京諾華)，2%酮康唑乳膏 (金達(dá)克寧，西安楊森)，1%聯(lián)苯芐唑乳膏 (美克，拜耳)，另一含菌平板注入等量市售成品藥物3%氯碘羥喹乳膏 (珂艾林，天津金耀)，曲安奈德益康唑乳膏 (派瑞松，西安楊森)，萘替芬酮康唑乳膏 (必亮，重慶華邦)，1%糠酸莫米松乳膏 (艾洛松，上海先靈葆雅)。每個(gè)平板3%氯碘羥喹乳膏均位于同一位置。置28℃培養(yǎng)7 d (見(jiàn)圖7)。觀察各藥膏孔周?chē)志Υ笮〔⒂涗浧渲睆?。重?fù)2次。計(jì)算每種藥物的抑菌圈直徑的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果顯示萘替芬酮康唑乳膏、2%酮康唑乳膏、曲安奈德益康唑乳膏、氯碘羥喹乳膏、鹽酸特比萘芬乳膏、1%聯(lián)苯芐唑乳膏、1%糠酸莫米松乳膏抑菌圈分別為 (36.00±2.00) mm、(32.33±1.76) mm、(32.00±1.33) mm、(19.75±0.27) mm、(7.00±0.00) mm、(7.00±0.00) mm、(7.00±0.00) mm。

病例2 因鹽酸特比萘芬乳膏、1%聯(lián)苯芐唑乳膏和1%糠酸莫米松乳膏在前述實(shí)驗(yàn)中示無(wú)抗菌活性 (抑菌圈直徑為7.00 mm)，故不使用上述三種乳膏實(shí)驗(yàn)。余方法同病例1 (見(jiàn)圖8b)。結(jié)果顯示氯碘羥喹乳膏、曲安奈德益康唑乳膏、萘替芬酮康唑乳膏、2%酮康唑乳膏、抑菌圈分別為 (38.13±1.33) mm、(31.33±1.67) mm、(30.13±0.33) mm、(29.75±1.27) mm。

2.4 掃描電鏡

用無(wú)菌透明敷貼粘取病例2患兒邊緣皮損，經(jīng)2.5%戊二醛固定過(guò)夜，經(jīng)50%、70%、90%、100%乙醇溶液梯度脫水，每次5 min，干燥噴金后置于掃描電子顯微鏡 (FEI Inspect F)下觀察?？梢?jiàn)大量圓形孢子 (見(jiàn)圖8a)。

3 診斷與治療

3.1 病例1

根據(jù)患兒皮損特點(diǎn)及真菌直接鏡檢結(jié)果，臨床診斷為念珠菌性間擦疹，予3%氯碘羥喹乳膏 (珂艾林，天津金耀)1次/d。首次用藥前用無(wú)菌敷貼粘取肛周左側(cè)皮損，在肛周右側(cè)用無(wú)菌棉簽涂抹3%氯碘羥喹乳膏后同樣方法于肛周右側(cè)取材，將兩次取材置于同一個(gè)SDA平板內(nèi)培養(yǎng)。置28℃培養(yǎng)4 d (見(jiàn)圖9)。6 d后患者復(fù)診陰囊及肛周紅斑消退 (見(jiàn)圖10a、b)。皮膚鏡下皮膚染色變淡、完整性恢復(fù) (見(jiàn)圖10c)，行真菌直接鏡檢和培養(yǎng)均陰性。未見(jiàn)藥物不良反應(yīng)。

3.2 病例2

根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)及真菌直接鏡檢結(jié)果，臨床診斷為念珠菌性間擦疹，予3%氯碘羥喹乳膏 (珂艾林，天津金耀)1次/d。14 d后患者復(fù)診肛周紅斑明顯減輕，鱗屑消失 (見(jiàn)圖11a)。皮膚鏡下皮膚鱗屑消失，基底紅減輕 (見(jiàn)圖11b)，行真菌直接鏡檢和培養(yǎng)均陰性。未見(jiàn)藥物不良反應(yīng)。

4 討 論

在皮膚念珠菌病中念珠菌性間擦疹最常見(jiàn)，常發(fā)生在頸部、會(huì)陰等皮膚間擦部位，氣候炎熱，局部潮濕為常見(jiàn)誘因，嬰幼兒因“尿不濕”更換不及時(shí)等原因常使會(huì)陰部潮濕不透氣，故易患此病。其病原菌多為白念珠菌。皮損表現(xiàn)為邊界清楚的片狀不規(guī)則紅斑，上覆白色膜狀物或脫屑，周?chē)梢?jiàn)散在斑疹，丘疹等[6]。

圖1治療前患兒陰囊及肛周見(jiàn)紅斑，周?chē)梢?jiàn)綠豆大小紅色丘疹圖2皮膚鏡 (偏振光，×50)下可見(jiàn)暗紅色背景上網(wǎng)格狀裂隙，附黃白色鱗屑圖3治療前患兒肛周見(jiàn)紅斑，附著白色鱗屑圖4皮膚鏡 (偏振光，×50)下可見(jiàn)點(diǎn)狀血管與黃白色鱗屑圖5直接鏡檢 (真菌熒光染液,普通光源，×400)可見(jiàn)分隔菌絲和卵圓形孢子 (a.病例1,b.病例2)；直接鏡檢 (真菌熒光染液，紫外光源，×400)同一視野清晰可見(jiàn)分隔菌絲和卵圓形孢子 (c.病例1,d.病例2)圖6沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (28℃，4 d)培養(yǎng)可見(jiàn)乳白色奶酪樣菌落 (a.病例1,b.病例2)；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基 (28℃，4 d)培養(yǎng)可見(jiàn)藍(lán)綠色菌落 (c.病例1,d.病例2)；芽管實(shí)驗(yàn) (人血清，36℃，3 h)可見(jiàn)孢子出芽 (e.病例1,f.病例2)圖7藥敏實(shí)驗(yàn) (SDA，28℃，7 d)可見(jiàn)藥物周?chē)志?。抑菌圈?nèi)完全無(wú)菌落生長(zhǎng)表明在該區(qū)域內(nèi)藥物完全抑制真菌生長(zhǎng)，有部分菌落生長(zhǎng)表明在該區(qū)域內(nèi)藥物部分抑制真菌生長(zhǎng)圖8a.皮損掃描電子顯微鏡觀察可見(jiàn)大量圓形孢子,b.藥敏實(shí)驗(yàn) (SDA，28℃，7 d)可見(jiàn)藥物周?chē)志?。抑菌圈?nèi)完全無(wú)菌落生長(zhǎng)表明在該區(qū)域內(nèi)藥物完全抑制真菌生長(zhǎng)，有部分菌落生長(zhǎng)表明在該區(qū)域內(nèi)藥物部分抑制真菌生長(zhǎng)圖9a.無(wú)菌敷貼取材部位:用藥前取肛周左側(cè)皮損 (矩形)，肛周右側(cè)用藥一次后取皮損 (圓形);b.無(wú)菌敷貼取材后培養(yǎng) (SDA，28℃，4 d),左側(cè)為未用藥時(shí)取材可見(jiàn)乳白色奶酪樣菌落生長(zhǎng)，右側(cè)為外擦氯碘羥喹乳膏后立即取材未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)圖10a,b.治療6 d后患兒陰囊及肛周紅斑消退;c.治療6 d后皮膚鏡 (偏振光,×50)下基底紅明顯減輕，皮膚完整性恢復(fù)圖11a.治療14 d后患兒肛周紅斑明顯減輕;b.治療14 d后皮膚鏡 (偏振光,×50)下基底紅明顯減輕，鱗屑消失

Fig.1Erythema with bean size papules around on the scrotum and crissum before treatmentFig.2Red base with latticed fissures and yellow-white scales were observed under the dermoscopy (polarized light，×50)Fig.3Erythema with white scales on the crissum before treatmentFig.4Punctate vessels and yellow-white scales were observed under the dermoscopy (polarized light，×50)Fig.5Direct microscopic observation (×400) of the lesion indicated a large number of septated hyphae of fungal fluorescence dye preparation (a&b.white light,c&d.ultra-violet light) in the same vision (a&c.case 1,b&d.case 2)Fig.6White cheesy colonies were observed on Sabouraud dextrose agar (28℃,4 d) (a.case 1,b.case 2);Blue-green colonies were observed on chromogenicCandidaagar (28℃,4 d) (c.case 1,d.case 2);Budding of spores were showed in germ tube assay (human serum,36℃,3 h) (e.case 1,f.case 2)Fig.7Antifungal activity of common antifungal drugs was showed through modified agar diffusion method (SDA,28℃,7 d).No colonies existed indicated full antifungal activity of drug at this area and part of colonies existed indicated partly antifungal activity of drug at this areaFig.8a.Scanning electron microscope of lesion showed many round spores;b.Antifungal activity of common antifungal drugs was showed through modified agar diffusion method (SDA,28℃,7 d).No colonies existed indicated full antifungal activity of drug at this area and part of colonies existed indicated partly antifungal activity of drug at this areaFig.9a.The position of sampling：sample from left side of crissum before medication (rectangle),sample from right side of crissum after first medication (circle);b.The left side of flat appeared white cheesy colonies with the sample before medication and the right side of flat appeared no colonies with the sample after medication (SDA,32℃,4 d)Fig.10a,b.Erythema disappeared after 6-days treatment;c.The redness of base reduced,the skin integrity recovered under observation of dermoscopy (polarized light,×50)Fig.11a.Erythema lightened after 14-days treatment;b.The redness of base reduced,scales disappeared under observation of dermoscopy (polarized light,×50)

常規(guī)真菌直接鏡檢中，常采用10% KOH處理后進(jìn)行觀察，但觀察時(shí)易受細(xì)胞碎屑、纖維、水珠、油滴等標(biāo)本雜質(zhì)干擾，要求觀察者有一定的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)。真菌熒光染色液其原理為經(jīng)過(guò)特殊熒光素標(biāo)聯(lián)的重組幾丁質(zhì)酶可以高親和力與真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)結(jié)合，在紫外光激活下菌絲及孢子均有熒光，而背景雜質(zhì)則無(wú)熒光，在熒光顯微鏡下觀察時(shí)不收干擾，熒光染料處理后的標(biāo)本在普通光源下也可觀察。本例即采用普通光源和紫外光源在熒光顯微鏡下分別觀察同一視野。較常規(guī)觀察方法有明顯優(yōu)勢(shì)，對(duì)檢查者技術(shù)水平要求低。

外用抗真菌藥物可分為丙烯胺類(lèi) (鹽酸特比萘芬乳膏為代表)和唑類(lèi) (酮康唑乳膏為代表)。復(fù)方制劑如萘替芬酮康唑乳膏和曲安奈德益康唑乳膏常用以增強(qiáng)療效和 (或)減輕不良反應(yīng)。而隨著糖尿病患者、免疫抑制人群的增加，抗菌藥物的濫用，耐藥菌株不斷增加。開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物成為研究者一個(gè)重要的課題。

氯碘羥喹乳膏為含3%氯碘羥喹乳膏 (商品名“珂艾林”)，氯碘羥喹為殺菌劑的一種，其抗菌作用譜較廣。已報(bào)道可與伊曲康唑聯(lián)合治療念珠菌性龜頭炎[7]，與液氮冷凍，糠酸莫米松聯(lián)合治療脂溢性皮炎[8]，聯(lián)合窄波紫外線治療糠秕孢子菌性毛囊炎[9]，聯(lián)合維A酸治療痤瘡[10]。同時(shí)對(duì)于化膿性皮膚病，濕疹皮炎及真菌性皮膚病均有一定療效。體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)白念珠菌有抑制作用[11]。但尚未有其單獨(dú)應(yīng)用于念珠菌性間擦疹治療的報(bào)告。

本文中兩例患兒外用氯碘羥喹乳膏療效良好，未見(jiàn)藥物不良反應(yīng)。同時(shí)在一例患兒外涂氯碘羥喹乳膏前后對(duì)稱部位取材培養(yǎng)，涂藥后標(biāo)本培養(yǎng)未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，可見(jiàn)其有明顯的抑制作用。同時(shí)我們利用成品藥物做體外藥敏實(shí)驗(yàn)，均可見(jiàn)氯碘羥喹乳膏對(duì)白念珠菌有中強(qiáng)度的抑制作用。

兩例患兒就診時(shí)獲取鱗屑進(jìn)行真菌熒光染料染色后直接鏡檢即刻確認(rèn)真菌感染。直接鏡檢陽(yáng)性后立即給予3%氯碘羥喹乳膏治療。生化及分子生物學(xué)鑒定證實(shí)為白念珠菌。改良瓊脂擴(kuò)散法及用藥前后對(duì)稱部位鱗屑培養(yǎng)證實(shí)藥物敏感性。本病例對(duì)真菌直接鏡檢標(biāo)本處理方法革新 (使用真菌熒光染色液對(duì)鱗屑進(jìn)行處理提高陽(yáng)性率)，對(duì)于患者診斷和指導(dǎo)臨床用藥有所幫助。同時(shí)首次單獨(dú)使用3%氯碘羥喹乳膏治療念珠菌性間擦疹。3%氯碘羥喹乳膏在臨床治療感染性皮膚病應(yīng)用尚少，耐藥菌株較少。隨著臨床耐藥菌株的增加，3%氯碘羥喹乳膏可作為臨床外用抗真菌藥物的選擇。

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