孫偉 鄧娟 蘇建榮

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨檢中心，北京 100050)

毛孢子菌病 (Trichosporosis)是由毛孢子菌感染引起的一種局部或系統(tǒng)播散性真菌病[1]。近年來，毛孢子菌病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，已成為除念珠菌外致人類播散性感染的第2大酵母樣真菌感染[2]，這與各種原因造成的免疫功能低下患者增多有關(guān)，其中，阿薩希毛孢子菌 (Trichosporonasahii,T.asahii)是引起人類毛孢子菌病的最常見、最重要的致病菌[3]。

鐵參與眾多的生物代謝過程，是生命體必須的營(yíng)養(yǎng)元素，其存在著還原型Fe2+和氧化型Fe3+兩種可以可逆變化的化合態(tài)。鐵載體是微生物在低鐵的限制性條件的條件下誘導(dǎo)合成的低分子量化合物，對(duì)Fe3+有特異的高親和力。絕大多數(shù)微生物都可以合成鐵載體，其與微生物的毒力有關(guān)，因?yàn)閺乃拗黧w內(nèi)吸收鐵是病原菌生存與感染的必要步驟。

目前，鐵離子的利用、鐵載體的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，及其在與宿主相互作用中的相應(yīng)機(jī)制研究主要集中于細(xì)菌和部分真菌 (白念珠菌、釀酒酵母菌和煙曲霉等)[4-7]。國(guó)內(nèi)外尚未見關(guān)于阿薩希毛孢子菌的鐵離子利用情況的報(bào)道。本研究主要探討阿薩希毛孢子菌在鐵限制條件下如何利用鐵離子。

1 材料與方法

1.1 菌株

阿薩希毛孢子菌臨床分離株，分離自尿路感染患者，已經(jīng)過VITEK 2 COMPACT2和MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀鑒定至種，阿薩希毛孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479，所有菌株使用之前均于-80℃凍存。

1.2 主要試劑與儀器

絡(luò)天青 (CAS)、溴化十六碳烷基三甲銨 (HTDMA)、去鐵胺、BCS、FeCl3、無水哌嗪均購(gòu)自Sigma公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基 (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD)培養(yǎng)基 (1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)、沙氏培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板均購(gòu)自O(shè)xfoid公司；無菌培養(yǎng)皿及96孔板 (Costar)；酶標(biāo)儀 (TECAN，Infinite200)；VITEK2 COMPACT及MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀 (法國(guó)生物梅里埃公司)。

1.3 阿薩希毛孢子菌在低鐵限制性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的繪制

低鐵限制性培養(yǎng)基的配制 將200 μmol/L的去鐵胺加入預(yù)先配制的YPD培養(yǎng)基中，并加入500 μmol/L的BCS去除YPD培養(yǎng)基中的銅離子。

菌株的準(zhǔn)備 將-80℃凍存的阿薩希毛孢子菌轉(zhuǎn)種至新鮮配制的YPD培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)。

生長(zhǎng)曲線的繪制 參照預(yù)實(shí)驗(yàn)中阿薩希毛孢子菌CBS2479的實(shí)驗(yàn)條件，將復(fù)蘇后的阿薩希毛孢子菌菌體用含有 (或不含有)200 μmol/L去鐵胺的YPD培養(yǎng)基分別制備成600 nm處吸光度值為0.1的菌懸液，記為YPD+去鐵胺組 (實(shí)驗(yàn)組)和YPD組 (生長(zhǎng)對(duì)照組)，35℃，水平搖床 (100 r/min)振搖培養(yǎng)。每隔1 h分別從實(shí)驗(yàn)組和生長(zhǎng)對(duì)照組取1 mL菌液并測(cè)定二者600 nm處的吸光度值，記錄OD 600 nm數(shù)值。以時(shí)間 (h)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D 600 nm為縱坐標(biāo)，分別繪制實(shí)驗(yàn)組和生長(zhǎng)對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線。

1.4 CAS溶液法檢測(cè)鐵載體的產(chǎn)生情況

CAS檢測(cè)液的配制 取10 mmol/L HDTMA (十六烷基三甲基溴化銨，109.35 mg)溶液30 mL加入到500 mL洗凈干燥的容量瓶中，加入適量去離子水稀釋；將7.5 mL Fe3+溶液 (1 mmol/L FeCl3·6H2O，含10 mmol/L HCl)與37.5 mL 2 mmol/L CAS (鉻天青，45.40 mg)溶液混合均勻，一邊震蕩一邊緩慢加入容量瓶中；稱取21.54 g無水哌嗪溶于水，小心加入31.25 mL 12MHCl (pH=5.6)，隨后一起加入容量瓶中，加去離子水至500 mL，混合均勻即得CAS檢測(cè)液，裝入干凈的聚乙烯瓶中，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

CAS溶液法檢測(cè)鐵載體的原理 CAS藍(lán)色檢測(cè)液是絡(luò)天青、HTDMA和鐵離子組成的一種復(fù)合物，呈藍(lán)色。當(dāng)鐵離子從CAS溶液中解離出來時(shí)，CAS溶液由藍(lán)色變?yōu)榻埸S色，根據(jù)加入適量鐵載體前后CAS溶液在630 nm處的吸光度值來確定鐵載體的濃度。CAS檢測(cè)法是一種高靈敏度的化學(xué)方法，它不依賴于鐵載體的結(jié)構(gòu)，而是基于鐵載體對(duì)Fe3+的親和力。

檢測(cè)方法 本研究中通過向YPD培養(yǎng)基中加入200 μmol/L的去鐵胺制備低鐵限制培養(yǎng)基，與阿薩希毛孢子菌共培養(yǎng)，如果該菌可以分泌產(chǎn)生鐵載體，則可以解離后續(xù)加入的CAS溶液中的鐵離子，使CAS溶液由藍(lán)色變?yōu)辄S色，分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組630 nm的吸光度值來分析阿薩希毛孢子菌產(chǎn)生鐵載體的情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 阿薩希毛孢子菌在低鐵限制性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)不受影響

生長(zhǎng)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組阿薩希毛孢子菌24 h內(nèi)的生長(zhǎng)曲線如圖1所示，加入去鐵胺后5 h，阿薩希毛孢子菌的生長(zhǎng)曲線雖略低于生長(zhǎng)對(duì)照組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，即低鐵限制性條件并不影響阿薩希毛孢子菌的生長(zhǎng)。

2.2 阿薩希毛孢子菌在低鐵限制性條件下可以產(chǎn)生鐵載體

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組阿薩希毛孢子菌分別培養(yǎng)16 h后，取各組上清100 μL進(jìn)行CAS溶液法檢測(cè)。與空白對(duì)照組 (CAS溶液+YPD培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照組 (CAS溶液+YPD培養(yǎng)基+T.asahii)相比，實(shí)驗(yàn)組 (CAS溶液+YPD培養(yǎng)基+T.asahii+去鐵胺)阿薩希毛孢子菌產(chǎn)生的鐵載體高于其他兩組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，試驗(yàn)重復(fù)3次，見圖2。

3 討 論

阿薩希毛孢子菌是引起人類毛孢子菌病最主要的致病菌。由于毛孢子菌對(duì)很多常規(guī)抗真菌藥物耐藥，目前該病治療困難，免疫受損患者感染后死亡率較高。有研究表明阿薩希毛孢子菌對(duì)兩性霉素B存在耐藥性，并且有研究使用棘白菌素類藥物導(dǎo)致播散性毛孢子菌病的病例[8-9]。我們前期的研究顯示，三唑類藥物 (尤其是伏立康唑)對(duì)阿薩希毛孢子菌有較好的療效，但在治療過程中逐漸呈現(xiàn)對(duì)唑類耐藥的趨勢(shì)[6-7，10-11]。因此亟需新的療法來治療反復(fù)發(fā)作的和播散性的毛孢子菌病。

圖1 低鐵限制性環(huán)境對(duì)阿薩希毛孢子菌的生長(zhǎng)曲線無顯著影響 圖2 CAS法檢測(cè)T.asahii在鐵離子限制條件下可以產(chǎn)生鐵載體

Fig.1There was no significant influence of iron-restricted condition on the growth curve ofT.asahiiFig.2T.asahiicould secrete siderophore under iron-restricted condition

鐵在宿主和微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)中發(fā)揮著重要的作用，其參與許多代謝過程，并且與微生物的侵襲和毒力密切相關(guān)。另外，鐵在維持機(jī)體自穩(wěn)和免疫功能的發(fā)揮中起到交叉調(diào)節(jié)的作用[4-5]。鐵是參與眾多生物代謝過程的必須元素，其存在還原型和氧化型兩種可逆變化的化合態(tài)，在自然條件下主要以三價(jià)的氧化物或氫氧化物形式存在，溶解性和生物可利用度極低。微生物在低鐵的限制性環(huán)境中可以合成和利用鐵載體從環(huán)境吸收鐵，這是它們適應(yīng)生長(zhǎng)代謝的需要而發(fā)展出來的一種主要的鐵吸收機(jī)制[6]。絕大多數(shù)微生物都可以合成鐵載體，目前，關(guān)于鐵載體的研究主要集中于細(xì)菌和部分真菌 (白念珠菌、釀酒酵母菌、曲霉菌屬真菌)[7,12-14]。本研究選取臨床分離的阿薩希毛孢子菌在低鐵條件下培養(yǎng)，檢測(cè)其是否產(chǎn)生鐵載體，為后續(xù)相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。研究結(jié)果顯示，阿薩希毛孢子菌在低鐵限制條件下可以分泌鐵載體，從而保證其在低鐵環(huán)境中的生長(zhǎng)不受影響。

由于鐵載體對(duì)鐵的螯合作用是病原微生物在鐵限制條件下攝取鐵離子的重要途徑，因此通過阻斷鐵載體的產(chǎn)生或阻斷鐵載體與鐵離子的結(jié)合 (比如使用鐵載體配體)可以抑制病原微生物對(duì)鐵的利用，從而達(dá)到抑制其生長(zhǎng)和代謝的目的。這提示鐵載體途徑可能會(huì)是治療阿薩希毛孢子菌感染的新途徑，與傳統(tǒng)抗真菌藥物聯(lián)合使用可望起到事半功倍的效果[7]。因此，后續(xù)研究我們將進(jìn)一步探索阿薩希毛孢子菌通過鐵載體攝取鐵離子的具體機(jī)制，為治療播散性毛孢子菌病提供新策略。

[1] de Almeida Júnior JN,Hennequin C.InvasiveTrichosporoninfection:a systematic review on a re-emerging fungal pathogen[J].Front Microbiol,2016，7:1629.

[2] Girmenia C,Pagano L,Martino B，et al.Invasive infections caused byTrichosporonspecies andGeotrichumcapitatumin patients with hematological malignancies:a retrospective multicenter study from Italy and review of the literature[J].J Clin Microbiol,2005，43(4):1818-1828.

[3] Fernández-Ruiz M,Guinea J,Puig-Asensio M，et al.Fungemia due to rare opportunistic yeasts:data from a population-based surveillance in Spain[J].Med Mycol,2017，55(2):125-136.

[4] Nevitt T.War-Fe-re:iron at the core of fungal virulence and host immunity[J].Biometals,2011，24(3):547-558.

[5] Johnson L.Iron and siderophores in fungal-host interactions[J].Mycol Res,2008，112(Pt 2):170-183.

[6] Nevitt T，Thiele DJ.Host iron withholding demands siderophore utilization forCandidaglabratato survive macrophage killing[J].PLoS Pathog,2011，7(3):e1001322.

[7] Liu Z,Petersen R,Devireddy L.Impaired neutrophil function in 24p3 null mice contributes to enhanced susceptibility to bacterial infections[J].J Immunol,2013，190(9):4692-4706.

[8] Iturrieta-González IA,Padovan AC,Bizerra FC,et al.Multiple species ofTrichosporonproduce biofilms highly resistant to triazoles and amphotericin B[J].PLoS One,2014，9(10):e109553.

[9] Matsue K,Uryu H,Koseki M,et al.Breakthrough trichosporonosis in patients with hematologic malignancies receiving micafungin[J].Clin Infect Dis,2006，42(6):753-757.

[10] Hazirolan G,Canton E,Sahin S,et al.Head-to-head comparison of inhibitory and fungicidal activities of fluconazole,itraconazole,voriconazole,posaconazole,and isavuconazole against clinical isolates ofTrichosporonasahii[J].Antimicrob Agents Chemother,2013，57(10):4841-4817.

[11] Sun W,Su J,Xu S,et al.Trichosporonasahiicausing nosocomial urinary tract infections in intensive care unit patients:genotypes,virulence factors and antifungal susceptibility testing[J].J Med Microbiol,2012，61(Pt 12):1750-1757.

[12] Froissard M,Belgareh-Touzé N,Dias M,et al.Trafficking of siderophore transporters inSaccharomycescerevisiaeand intracellular fate of ferrioxamine B conjugates[J].Traffic,2007，8(11):1601-1616.

[13] Noble SM.Candidaalbicansspecializations for iron homeostasis:from commensalism to virulence[J].Curr Opin Microbiol,2013，16(6):708-715.

[14] Amich J,Schafferer L,Haas H,et al.Regulation of sulphur assimilation is essential for virulence and affects iron homeostasis of the human-pathogenic mouldAspergillusfumigatus[J].PLoS Pathog,2013，9(8):e1003573.