史 可，蘇婷婷，王戰(zhàn)勇

(遼寧石油化工大學化學化工與環(huán)境學部，遼寧 撫順 113001)

0 前言

以石油化工為基礎合成的高分子材料由于其穩(wěn)定性及不可降解性，在被廢棄后易在環(huán)境中堆積而引起白色污染等問題[1]，而開發(fā)可降解高分子材料是解決這一難題的重要途徑之一[2]。PBS作為石油原料合成的脂肪族聚合物，不僅具有良好的生物降解性，還具有生產(chǎn)成本低、力學性能好及熱穩(wěn)定性強的特點，這使得其具備優(yōu)于其他生物可降解塑料的可應用性[3-4]。有關PBS的降解研究近些年國內(nèi)外已有開展。白俊巖等[5]從油田原油污染土壤中篩選到具有降解PBS能力的菌株Pseudomonas Aeruginosa PBS1302，在37 ℃、pH=6.8的條件下培養(yǎng)6 d，其降解率達到36.9 %。Shah等[6]從Roseateles Depolymerans TB-87菌株中分離得到Est-H和Est-L 2種酶，二者具有降解以PBS為代表的脂肪族共聚酯的能力。本文直接采用源于南極擬酵母(Candida Antarctica)的商品級脂肪酶Lipozyme CALB對PBS薄膜進行降解，分析了Lipozyme CALB對PBS薄膜降解的適宜條件并研究了PBS的酶促降解行為，相關研究有助于了解PBS的微生物酶降解機理，為以PBS為代表的可生物降解材料的工業(yè)化處理提供理論基礎和實用技術。

1 實驗部分

1.1 主要原料

PBS，重均相對分子質(zhì)量為1.5×104～2.1×104，酸醇比為1.1∶1，安徽安慶和興化工有限責任公司；

南極擬酵母脂肪酶，Lipozyme CALB，酶活力為5000 LU/g，北京高瑞森科技有限公司；

磷酸二氫鉀(KH2PO4)、無水磷酸氫二鉀(K2HPO4)，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要設備及儀器

掃描電子顯微鏡(SEM)，SU8010，日本日立公司；

差示掃描量熱儀(DSC)，Q20，美國TA公司；

熱失重分析儀(TG)，Q600，美國TA公司；

串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(MS)，Quattro Premier XE，美國Waters公司；

真空干燥箱，DZF-6020，上海精宏實驗設備有限公司；

平板硫化機，TSE-18A，江蘇省江陰市文林化工機械廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-4，國華電器有限公司；

電子天平，ALC-210.4，德國賽多利斯股份公司。

1.3 樣品制備

PBS薄膜的制備：將PBS顆粒置于60 ℃的真空干燥箱中干燥10 h，然后在180 ℃的熱壓機上預熱2 min，保壓(50 kg/cm2)1 min后轉(zhuǎn)移到冷壓機上(室溫)冷卻10 min，獲得厚度約為0.5 mm的PBS薄膜，取光滑平整無氣泡部分裁剪為1 cm×3 cm的規(guī)格，干燥至恒重，稱重待用；

降解條件對PBS薄膜的酶促降解：將酶加入到不同起始pH值的緩沖液中，并使酶的終濃度為15 U/mL，將PBS薄膜置于10 mL含酶緩沖液中，45 ℃恒溫孵育12 h，考察反應起始pH值對PBS薄膜酶促降解的影響；將酶加入到起始pH=7.0的緩沖液中，并使酶的終濃度為15 U/mL，將PBS薄膜置于10 mL含酶緩沖液中，于不同溫度下孵育12 h，考察溫度對PBS薄膜酶促降解的影響；將不同濃度的酶加入到起始pH=7.0的緩沖液中，將PBS薄膜置于10 mL含酶緩沖液中，在50 ℃孵育12 h，考察酶濃度對PBS薄膜酶促降解的影響；將濃度為20 U/mL的酶加入到起始pH=7.0的緩沖液中，并將PBS薄膜置于10 mL含酶緩沖液中，在50 ℃下孵育不同時間，考察降解時間對PBS薄膜酶促降解的影響。

1.4 性能測試與結(jié)構(gòu)表征

降解率的計算：收集降解后的PBS薄膜，充分清洗后置于60 ℃真空中干燥至恒重，并按式(1)計算薄膜的降解率；

(1)

式中R——PBS薄膜的降解率， %

m0——PBS薄膜降解前的質(zhì)量，g

m1——PBS薄膜降解后的質(zhì)量，g

SEM分析：將降解前后的PBS薄膜樣品表面噴金后置于樣品臺進行觀察，加速電壓為20 kV；

DSC分析：將約5 mg樣品在氮氣氣流為60 mL/min的氛圍下，以10 ℃/min的速率從室溫升溫至150 ℃，恒溫3 min，再以10 ℃/min的速率降至室溫；然后再以10 ℃/min的速率升溫至150 ℃，記錄降溫曲線和二次升溫曲線；根據(jù)PBS的標準焓(ΔH0=110.5 J/g)[7]按式(2)計算PBS降解前后結(jié)晶度的變化：

(2)

式中X——相對結(jié)晶度， %

ΔH——降解后PBS的熔融焓，J/g

TG分析：氮氣氣氛，氮氣流速為30 mL/min，升溫速率為10 ℃/min，測試溫度范圍為100～600 ℃；

MS測試：使用截留分子質(zhì)量為3000道爾頓的超濾離心管處理PBS薄膜酶解后的緩沖液，取膜下液進行MS分析，其中測試離子源為ESI，正負電離模式同時掃描；毛細管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為20 kV，RF透鏡電壓為0.5 V，源溫為120 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解條件對PBS薄膜酶促降解的影響

降解條件：(a)反應起始pH值 (b)溫度 (c)酶濃度 (d)降解時間圖1 降解條件對PBS薄膜酶促反應的影響Fig.1 Effects of degradation conditions on enzymatic reaction of PBS films

當酶濃度為15 U/mL，溫度為45 ℃，降解時間為12 h時，反應起始pH值對PBS薄膜的酶促影響結(jié)果如圖1(a)所示。由圖可見，PBS薄膜的降解率隨著反應起始pH值的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當反應起始pH=7.0時PBS薄膜的降解率最大。當酶濃度為15 U/mL，起始pH=7.0，降解時間為12 h時，溫度對PBS薄膜的酶促影響結(jié)果如圖1(b)所示，PBS薄膜的降解率隨著溫度的升高也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在反應溫度為50 ℃時PBS薄膜的降解率最大。同時，實驗測定了酶解作用發(fā)生后反應體系的pH值，發(fā)現(xiàn)反應體系的pH值隨著溫度的升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。pH值的下降是由于PBS催化降解生成了酸性降解產(chǎn)物，而pH值的上升則是由于過高的溫度導致酶活力的喪失，進而抑制了酸性降解單體的生成。當起始pH=7.0，溫度為50 ℃，降解時間為12 h時，酶濃度對PBS薄膜的酶促影響結(jié)果如圖1(c)所示，隨著酶濃度的不斷增大，PBS薄膜的降解率不斷提高。酶濃度在20 U/mL之前PBS薄膜的降解率顯著上升，而酶濃度達到20 U/mL后，繼續(xù)增大酶濃度，PBS薄膜的降解率放緩。另外，酶濃度的不斷增大有效地促進了酶的降解作用，導致催化產(chǎn)生的酸性降解產(chǎn)物大量積累，進而造成溶液的pH值不斷降低。當酶濃度為20 U/mL，溫度為50 ℃，起始pH=7.0時，降解時間對PBS薄膜的酶促影響結(jié)果如圖1(d)所示，隨著降解時間的延長PBS薄膜的降解率呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，且大致可分為2個階段：緩慢降解階段和快速降解階段。0～2 h為緩慢降解階段，在這個階段PBS的降解率呈增長趨勢但增幅相對緩慢；2～24 h為快速降解階段，此階段薄膜的降解率迅速上升，且24 h后PBS薄膜的降解率達到90 %以上。

2.2 降解時間對PBS薄膜的影響

在酶濃度為20 U/mL，溫度為50 ℃，起始pH=7.0的降解條件下，對不同降解時間的PBS薄膜進行了一系列的表征，其分析結(jié)果如下。

2.2.1 形貌分析

由圖2可知，隨著降解時間的延長，PBS薄膜不斷地被Lipozyme CALB酶解。在0～8 h的范圍內(nèi)PBS薄膜的厚度變薄，薄膜表面變得更加粗糙；12 h以后PBS薄膜開始出現(xiàn)薄膜破碎、斷裂并消失的情況；當降解時間延長至24 h時，PBS薄膜的表面積約為降解前的1/3。

降解時間/h：(a)0 (b)2 (c)4 (d)8 (e)12 (f)16 (g)20 (h)24圖2 不同降解時間下PBS薄膜的照片F(xiàn)ig.2 Pictures of PBS films degraded for different time

降解時間/h：(a)0 (b)2 (c)4 (d)8 (e)12 (f)16 (g)20 (h)24圖3 不同降解時間下PBS薄膜的SEM照片F(xiàn)ig.3 SEM of PBS films degraded for different time

由圖3(a)可見，降解前的PBS薄膜表面光滑平整，有規(guī)則紋路，無斷裂破損現(xiàn)象；降解2 h后，由于Lipozyme CALB的酶解作用，PBS薄膜表面開始變得粗糙并出現(xiàn)明顯的侵蝕痕跡，薄膜表面開始出現(xiàn)片層，但片層未脫落[圖3(b)]；此后隨著降解時間的延長，薄膜表面的侵蝕痕跡逐步擴大，且粗糙的薄膜表面進一步增加了比表面積，使得酶分子可以更好地與降解底物接觸，從而使降解過程加快；當降解時間達到12 h后，由于Lipozyme CALB的催化降解作用PBS薄膜的表層開始出現(xiàn)孔洞，部分片層開始出現(xiàn)缺失[圖3(d)]；此后隨著降解時間的進一步延長，孔洞逐漸增大，最后穿透整個PBS薄膜，并進一步形成更大的孔洞。

2.2.2 DSC分析

在圖4(a)中，隨著降解時間的延長，PBS薄膜的結(jié)晶溫度逐漸升高，由降解前的58.8 ℃升高至降解24 h后的65.0 ℃，且結(jié)晶峰的峰形對稱性增強。因此，經(jīng)Lipozyme CALB的降解有利于PBS薄膜晶體的生長，且其晶體結(jié)構(gòu)逐漸趨于完善。由圖4(b)可知，隨著降解時間的延長，PBS薄膜的熔融峰變化不大，熔點略有上升，由降解前的103.7 ℃升高至降解24 h后的105.0 ℃。通過PBS的熔融焓計算樣品的結(jié)晶度，其計算結(jié)果如圖5所示，PBS的結(jié)晶度隨降解時間的延長而逐漸增大，由降解前的50.66 %增至降解24 h后的61.97 %，與未降解的PBS薄膜相比，降解后PBS薄膜的結(jié)晶度增加明顯。其主要原因是高分子材料在降解過程中一般先降解密度低、松散的非結(jié)晶部分，后降解結(jié)構(gòu)更為規(guī)整的結(jié)晶區(qū)域[8]，而非晶區(qū)的優(yōu)先降解直接導致了聚合物結(jié)晶度的增加，所以當降解時間不斷延長，材料的結(jié)晶度會有上升的趨勢。

降解時間/h：1—0 2—2 3—4 4—8 5—12 6—16 7—20 8—24(a)降溫曲線 (b)二次升溫曲線圖4 不同降解時間下PBS薄膜的DSC曲線Fig.4 DSC curves of PBS films degraded for different time

圖5 降解不同時間后PBS薄膜結(jié)晶度的變化Fig.5 Crystallinity of PBS films degraded for different time

2.2.3 TG分析

降解時間/h：1—0 2—2 3—4 4—8 5—12 6—16 7—20 8—24圖6 降解后PBS薄膜的TG分析Fig.6 TG analysis of PBS films degraded for different time

由圖6和表1可知，經(jīng)降解后，PBS薄膜的熱穩(wěn)定性發(fā)生了改變。在降解0～16 h的范圍內(nèi)，PBS薄膜的熱穩(wěn)定性隨降解時間的延長呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，而在降解時間超16 h后，質(zhì)量損失率為5 %時的溫度(T-5 %)、質(zhì)量損失率為50 %時的溫度(T-50 %)和最大失重速率時的溫度(Tmax)均有所下降。

表1 不同降解時間下PBS薄膜的熱穩(wěn)定性Tab.1 Thermal stability of PBS films degradedfor different time

2.3 PBS薄膜降解產(chǎn)物的MS分析

對比降解前緩沖液的MS譜圖[圖7(a)]，在降解20 h后的降解產(chǎn)物中， 116.9、189.2位置處出現(xiàn)了新的吸收峰[圖7(b)]，其中116.9處對應的是1,4 - 丁二酸，189.2處對應的是丁二酸 - 丁二醇二聚體。與未降解的PBS薄膜的緩沖液相比，降解后PBS薄膜的緩沖液中出現(xiàn)了新的物質(zhì)，則進一步說明PBS發(fā)生了降解。值得注意的是反應體系中未檢測出1,4 - 丁二醇以及其他寡聚體。

降解時間/h：(a)0 (b)20圖7 PBS降解產(chǎn)物的MS分析結(jié)果Fig.7 MS of degradation products of PBS

3 結(jié)論

(1)Lipozyme CALB降解PBS薄膜的最佳條件為：起始pH=7.0，溫度為50 ℃，酶濃度為20 U/mL，經(jīng)24 h降解，PBS薄膜的降解率達到90 %以上；

(2)隨降解時間的延長，PBS薄膜的表面逐漸變得粗糙，降解時間超過12 h后薄膜表面出現(xiàn)明顯孔洞；PBS薄膜的結(jié)晶度隨降解時間的延長而逐漸增大；降解后PBS薄膜的熱穩(wěn)定性緩慢提高；

(3)PBS薄膜經(jīng)Lipozyme CALB降解后的降解產(chǎn)物為1,4 - 丁二酸單體和丁二酸 - 丁二醇二聚體，未發(fā)現(xiàn)1,4 - 丁二醇以及其他寡聚體。

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