張 晗， 王文政， 袁旭峰， 李秋芝， 楊中旭

(1.中國農業(yè)大學生物質工程中心， 北京 100193; 2.聊城市農業(yè)科學研究院， 山東 聊城 252000)

我國是世界秸稈產量第一大國[1]。厭氧發(fā)酵技術是將農業(yè)廢棄物轉化為沼氣的有效手段之一[2]，是秸稈資源化的重要途徑[3]。然而，在生產沼氣的同時也會均衡地產生大量的副產品—沼液沼渣，同時秸稈中的纖維素、半纖維素和木質素的含量直接影響到秸稈厭氧發(fā)酵產氣的效果，不同種類秸稈厭氧發(fā)酵產沼氣的效果差別較大。沼液回流技術可以從源頭上減少沼液排放，預防農田消納時潛在的環(huán)境風險，對大中型沼氣工程沼液的減排和節(jié)約淡水資源具有重要的理論和現(xiàn)實意義。沼液回流可以減少氨氮損失，實現(xiàn)單秸稈發(fā)酵，同時減少功能微生物損失[4]，實現(xiàn)菌群水解和產甲烷過程的平衡。但過高的回流比會導致氨氮積累[5-6]，粘度增加[7]，導致發(fā)酵產氣量下降。有關沼液回流能夠提高發(fā)酵效率、反應器運行穩(wěn)定性和增加原料利用率的研究大多是建立在批次發(fā)酵的基礎上，或者將用于回流的沼液進行稀釋，而對于在低含固率發(fā)酵條件下，沼液過篩后全部回流對單秸稈特別是木質化程度較高的秸稈發(fā)酵效果的影響較少有相關報道[8]。實驗以棉花秸稈為原料，在固定進水負荷4 gTS·L-1d-1及HRT(15 d)下，通過沼液回流再利用，研究回流對產甲烷效率及微生物群的影響。

1 材料與方法

1.1 棉花秸稈及污泥特性

實驗啟動的活性污泥取自筆者實驗室在中溫條件50 L CSTR發(fā)酵罐長期培養(yǎng)的種泥，活性污泥的TS和VS分別為6%，4.1%，pH值為7.2，在有效體積為6 L的發(fā)酵罐內接種污泥3.2 L。棉花秸稈粉碎成秸稈粉，過40目篩備用，其理化性質見表1。

表1 原料的理化性質 (%)

A.自動控制裝置； B.攪拌器； C.進水口； D.溫度探頭； E.加熱桿； F.出水口； G.氣體收集裝置圖1 CSTR反應器模擬結構簡圖

1.2 實驗裝置與操作

厭氧發(fā)酵裝置為2個相同的CSTR反應器(見圖1)，總體積7.2 L有效體積為6 L。每天攪拌2次，每次10 min，攪拌速度為200 r·min-1。沼液經(jīng)350目尼龍紗網(wǎng)過濾后用于進料稀釋，回流到發(fā)酵罐中重新利用，而未回流組使用清水代替。

1.3 實驗監(jiān)測方法

總固體(TS)，揮發(fā)固體(VS)采用干重法[9]；進出料的pH值采用SANXIN牌SX-TSL610型筆式pH計測量；沼氣采用SY-TSL20L氧氣袋收集；甲烷體積分數(shù)采用便攜式沼氣分析儀 (Geotech Biogas 5000型，英國)；纖維素含量用ANKOM220纖維分析儀測量；SCOD采用標準重鉻酸鉀氧化法[10]；氨氮采用水楊酸-TSL次氯酸鹽光度法測定[10]；出料揮發(fā)性脂肪酸VFAs采用島津LC-TSL20A高效液相色譜儀測定，色譜柱為BIO-TSLRAD HPX-TSL87H Lon Exclusion Column; 微生物群結構分析采用16S rDNA基因克隆文庫法[11]。

2 結果與討論

2.1 回流對甲烷產率的影響

甲烷產率是衡量厭氧消化系統(tǒng)運行效率的重要指標。在固定進水負荷4 gTS·L-1d-1條件下，從第31天開始回流，從圖2可知，回流初始階段不會對產氣有影響，但隨著回流時間延長，甲烷產率會下降，當運行到153天時，兩組甲烷產率開始出現(xiàn)差異，沼液回流開始對厭氧發(fā)酵產生抑制作用，回流組的甲烷產率由332.4 mL·L-1d-1降低到255.7 mL·L-1d-1，下降了23.1%。有文獻表明[12]，回流使沼液中未降解掉的有機物及攜帶的產甲烷菌群重新進入發(fā)酵罐中，能夠在一定程度上提高沼氣含量。筆者研究顯示前152天回流并未增加產氣，可能因為在相對較低的有機負荷4 gTS·L-1d-1下，初期體系粘度及揮發(fā)性脂肪酸含量相對較低，對產甲烷體系無明顯抑制作用，厭氧過程完全且有機物利用較為充分，使得回流液中可降解物質較少，對體系產氣增加不明顯。徐霄[13]通過滲濾液回流技術對麥秸干式厭氧消化反應進行研究，利用合適的回流比，提高纖維素和半纖維素的降解率，從而提高了厭氧發(fā)酵產氣量。王星[14]研究了消化液回流比對餐廚垃圾厭氧消化的影響,發(fā)現(xiàn)在低負荷條件下,提高回流比可以使系統(tǒng)的產氣量明顯提高，但在高負荷條件下,較高的消化液回流比會造成揮發(fā)性有機酸積累,從而對厭氧消化反應有抑制作用?；亓鞅燃柏摵筛叩褪怯绊懟亓餍Ч膬蓚€重要因素，而本實驗在固定回流比及有機負荷的條件下，以棉花秸稈為原料進行單發(fā)酵，沼液未經(jīng)調節(jié)直接回流，結果顯示到第9個HRT時，回流開始會對沼氣發(fā)酵產生抑制作用，與長期沼液回流造成的粘度增加以及難降解物質積累有關，因此回流時間長短是一項重要的工藝參數(shù)。整個實驗過程中，每天進料量為24 gTS，回流組單位TS產甲烷量為77.3 mL·L-1d-1，未回流組單位TS產甲烷量為82.9 mL·L-1d-1，回流使產甲烷量降低了6.8%。實驗中觀測到回流并未影響甲烷含量，回流組和未回流組均維持在52%～55%。

圖2 甲烷產率的變化

2.2 回流對pH值和氨氮濃度的影響

圖3 反應器pH值和氨氮質量濃度的變化

2.3 回流對粘度的影響

回流開始后，回流組沼液粘度由54 mPa·s增至139 mPa·s，而未回流組粘度處于57～79 mPa·s之間(見圖4)。粘度反映了液體流動時的內摩擦程度，是發(fā)酵液流變性的重要指標，能夠影響厭氧反應器的整體混合行為、物質傳質和熱傳遞過程，即微生物與有機物之間的傳質過程，從而影響厭氧發(fā)酵的水解和產甲烷效率。實驗以棉花秸稈為原料，其具有較難降解的纖維素、木質素、半纖維素等成分，隨著沼液的回流，難以充分降解的大分子物質不斷積累，沼液中懸浮顆粒及膠體物質增長明顯，因而使粘度增加，在一定程度上抑制了產氣。

圖4 反應器粘度的變化

2.4 回流對揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

VFAs的質量濃度反映出體系中酸化和產甲烷之間的平衡，回流會導致VFAs的積累[12]。乙酸質量濃度超過1.5 g·L-1就會抑制纖維素酶的活性，從而抑制水解反應[15]。當乙酸質量濃度降到0.3 g·L-1時，嗜乙酸型甲烷菌有更高的親和性，乙酸發(fā)酵產甲烷成為主要途徑[18]。由圖5～圖7可知，回流組乙酸由0.1 g·L-1增長到1.6 g·L-1,而未回流組維持在0.1～0.3 g·L-1之間，說明未回流組以乙酸發(fā)酵產甲烷為主，而回流組乙酸積累到一定程度已經(jīng)開始抑制纖維素的水解。丙酸氧化生成乙酸、氫和二氧化碳是吸能反應，熱力學上不能自發(fā)進行[19]，丙酸的積累是厭氧消化甲烷產出率低的主要原因[20]，當丙酸濃度達到15 g·L-1時，會抑制50%的產甲烷活性[21]。在實驗中，丙酸在回流的初始階段濃度為0.2 g·L-1，回流一段時間后增至0.5 g·L-1，而未回流組在0.2 g·L-1左右波動，回流組雖有丙酸積累但并未到抑制產甲烷的程度，可能與較合理的進水負荷有關。乳酸在短時間乙酸化過程中，會釋放較高濃度的二氧化碳和氫氣，這會降低嗜氫產甲烷菌的代謝效率，降低甲烷產率[22]。實驗未回流組乳酸的濃度一直維持在0.3 g·L-1左右，而回流組有明顯的上升，濃度大約在1.3 g·L-1，是回流組甲烷產率較低的原因之一。

圖5 乙酸質量濃度變化

圖6 丙酸質量濃度變化

2.5 回流對產甲烷體系細菌的影響

細菌16S rDNA基因克隆文庫分析取樣點為190天，即回流組產氣受抑制階段。通過限制酶切技術對16S rDNA基因克隆文庫歸類后測序。如圖8所示，Ruminofilibacterxylanolyticum能夠利用木聚糖，曾在以玉米、小麥秸稈為原料的沼氣發(fā)酵罐中檢測出來[23]；Acetivibriocellulolyticus為厭氧的纖維素分解菌，主要發(fā)酵產物是乙酸、氫氣和二氧化碳[24]；Thermoanaerobacter能夠利用包括木糖、纖維二糖、淀粉、葡萄糖和麥芽糖在內的多種碳水化合物，并且能夠還原硫代硫酸鹽產生硫化氫[25]；Prevotellaruminicola在利用多糖、多肽及蛋白質代謝中中起著重要的作用[26]，均在未回流組中發(fā)現(xiàn)，反映了其纖維素降解菌群的種類多樣性，有利于其水解產酸，繼而獲得較高的產甲烷率。回流使反應器有毒物質積累，可能影響了纖維素降解菌群落多樣性。

圖7 乳酸質量濃度變化

注：D.第190天未回流組污泥;E.第190天回流組污泥圖8 反應器16S rDNA 細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

注：A.原始污泥； B.第70天未回流組的污泥； C.第70天回流組的污泥； D.第190天未回流組的污泥； E.第190天回流組的污泥圖9 反應器16S rDNA 古菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 回流對產甲烷體系古菌的影響

對原始污泥及反應器內顆粒污泥進行取樣，基于16S rDNA基因序列構建的系統(tǒng)樹如圖9中所示。其中B和C為回流尚未影響產氣時的取樣點，D和E為回流明顯抑制產氣時的取樣點。如表2所示，原始污泥中古菌種類豐富，經(jīng)過以單一棉花秸稈為原料的馴化階段后，嗜乙酸產甲烷菌Methanosaeta占有絕對的優(yōu)勢，而嗜氫產甲烷菌Methanomicrobiales和Methanobacterium豐度比較低。5個樣品克隆子序列分析結果見表2。

表2 古細菌16S rDNA克隆子序列分析結果

Methanosaeta獨有的絲狀纖維形成特定網(wǎng)格結構將其他細菌聯(lián)結到一起，在顆粒污泥形成過程中起到骨架、細胞聯(lián)合和支配作用[27]，研究表明在活性較好的顆粒污泥中Methanosaeta是主導的產甲烷菌[28]。實驗以單一棉花秸稈為原料，回流組中Methanosaeta的比例不斷增加，有利于污泥的顆?；^程及難降解物質積累下系統(tǒng)的穩(wěn)定。在回流尚未抑制產氣階段，通過分析兩組在第70天的顆粒污泥中古菌比例，發(fā)現(xiàn)主要產甲烷菌Methanosaeta的比例相近，此時兩組產甲烷率差異不大；未回流組中仍檢測出Unculturedeuryarchaeote，而回流組未能檢出，可能因為回流沼液中積累的有毒物質抑制了該種微生物的生長，其分類地位和代謝功能還需進一步研究。回流組中嗜氫產甲烷菌為Methanobacterium，可利用H2/CO2及甲酸生成甲烷；到了回流抑制產氣階段，回流組中Methanosaeta比例增加，與回流組乙酸濃度較高有關，在穩(wěn)定厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中起到重要作用。

3 結論

(1)在進水有機負荷為4 gTS·L-1d-1的條件下，沼液回流并沒有增加產氣，回流到第9個HRT時，回流組產氣受到抑制。以棉花秸稈為原料，回流組單位TS產甲烷量為77.3 mL·L-1d-1，未回流組單位TS產甲烷量為82.9 mL·L-1d-1，回流使產甲烷量降低了6.8%。

(2)回流對pH值影響顯著，回流組的pH值要高于未回流組，這主要由于回流組的氨態(tài)氮濃度高于未回流組，氨態(tài)氮作為致堿物質增強了回流組的緩沖能力；沼液粘度的增加，降低了厭氧發(fā)酵效率；回流組的VFAs要高于未回流組，其中乙酸和乳酸的積累是回流組甲烷產率較低的原因之一。

(3)未回流組纖維素分解菌種類更加豐富，是其能夠有效水解纖維素，進而產甲烷率高的原因；經(jīng)過長期單秸稈發(fā)酵，污泥中Methanosaeta的比例不斷增加，隨著回流組乙酸濃度的增加，Methanosaeta比例也在增長，對穩(wěn)定沼液回流條件下的厭氧發(fā)酵體系起到重要作用。

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