劉譯陽 韓燕 李國衛(wèi) 崔鳳

摘要：泛素結合酶是一類在泛素化修飾過程中起重要生物化學功能的蛋白。對于被預測為泛素結合酶的蛋白進行體外泛素化活性檢測，是確定其泛素結合酶功能必不可少的試驗步驟，試驗結果可以為后續(xù)研究提供重要的線索。目前體外泛素化反應存在體外表達純化蛋白工作量大、反應復雜、假陰性率高等問題。本研究針對以上問題進行了改良，開發(fā)出一種新的植物泛素結合酶活性體外檢測方法，該方法無需裂解細胞提取、純化蛋白，也不需要做體外反應，簡便易行，結果更穩(wěn)定可靠。應用該方法對花生泛素結合酶AhUBC34和鹽芥泛素結合酶TsUBC33進行了檢測，結果證明這兩個蛋白都具有泛素結合酶活性。

關鍵詞：泛素結合酶；體外泛素化檢測；檢測方法；花生；鹽芥

中圖分類號：S18：Q55文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）03-0120-05

Abstract The ubiquitin-conjugating enzymes play key biochemical roles in the ubiquitination modification. The in vitro ubiquitination assay is essential to the study of the predicted ubiquitin-conjugating enzyme， which supplies important clues for the following study. So far， the in vitro ubiquitin-conjugating enzyme activity analysis needs huge amount of works such as protein expression and purification. The process is complex， and the ratio of false negative is high. In this study， we developed a new system to detect the plant ubiquitin-conjugating enzyme activity which omits the protein purification and in vitro reaction steps in the old method. This new system is more convenient and stable. We applied this system to detect Arachis hypogaea UBC34 and Eutrema salsugineum （Thellungiella salsuginea） UBC33， and proved the ubiquitin-conjugating enzyme activity of these two proteins.

Keywords Ubiquitin-conjugating enzyme； In vitro ubiquitination assay； Assay method； Peanut； Eutrema salsugineum

泛素（ubiquitin，Ub）介導的26S蛋白酶體系統(tǒng)通過參與降解生長發(fā)育中不正常的蛋白為生物提供足夠的氨基酸供應，并通過降解一些限速步驟的蛋白來精確調節(jié)生物的生理過程，為生物生長發(fā)育以及應對外界環(huán)境的變化提供便利，對生物維持正常的生理功能非常重要。泛素介導的26S蛋白酶體降解途徑中主要參與分子包括泛素、泛素活化酶（Ub-activating enzyme）E1、泛素結合酶 （Ub-conjugating enzyme）E2、泛素連接酶 （Ub-protein ligase）E3、26S蛋白酶復合體（26S proteasome）以及去泛素化酶（deubiquitylating enzymes，DUBs）。泛素化過程是以上幾種酶協(xié)同作用的結果。首先，泛素的C末端甘氨酸殘基在ATP存在的情況下被E1激活，激活的泛素通過硫酯鍵結合到E1的一個半胱氨酸上；然后激活的泛素再被轉移到E2蛋白的活性半胱氨酸殘基上；隨后在E3的作用下E2上的泛素共價結合到靶蛋白賴氨酸殘基上；這個過程不斷重復形成多泛素化蛋白。多泛素化的蛋白經過26S蛋白酶體進行降解，成為單個的氨基酸殘基，同時去泛素化酶把多泛素鏈拆解成單個的泛素，重新進行利用[1]。其中泛素結合酶是一類在26S蛋白酶體降解途徑中起重要生物化學功能的蛋白[2]。目前的研究表明，泛素結合酶是多泛素鏈組裝的關鍵因子，控制了泛素鏈的起始和延伸，決定了底物泛素化修飾的類型和最終結果[3]。

對于預測為泛素結合酶的蛋白來說，對其進行體外泛素化活性檢測，是確定其泛素結合酶功能必不可少的，試驗結果可以為其后續(xù)的研究提供重要的線索。目前的泛素結合酶體外泛素化反應體系存在如下缺點：泛素結合酶體外泛素化檢測所需的主要分子包括Ub、E1、E2蛋白都需要利用大腸桿菌進行體外表達，然后裂解細胞提取蛋白，有一些還需要進行純化，純化后的蛋白為了維持其活性需要保存在-80℃冰箱，過程復雜，工作量大。另外傳統(tǒng)的體外泛素化反應檢測需要配制反應緩沖液，將Ub、E1、E2等蛋白都加入反應緩沖液中，在一定溫度和條件下進行反應。反應緩沖液中必須包含ATP以提供能量，ATP化學性質不穩(wěn)定，反應緩沖液難以長時間保持活性；體系中加入各種蛋白的量以及反應時間和條件也不相同，都需要各自摸索條件，工作量巨大。如果檢測不到泛素結合酶活性，無法區(qū)分是由于蛋白表達、純化、保存、凍融和反應等步驟的問題，還是蛋白本身沒有泛素結合酶的功能，容易造成假陰性[4，5]。本研究針對以上泛素結合酶體外泛素化反應體系存在的缺點進行了改進，研究出一種用于體外檢測泛素結合酶活性的方法，并利用該方法對花生泛素結合酶AhUBC34和鹽芥泛素結合酶TsUBC33進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LB培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，去離子水配制，高壓蒸汽滅菌）；IPTG；以上試劑均為進口或國產分析純試劑。反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司。表達蛋白所用大腸桿菌菌種BL21（DE3）和蛋白表達載體pGEX-6P-1由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所謝旗研究員饋贈。載體pACYCDuet和pCDFDuet由華南師范大學陽成偉教授饋贈。Flag抗體（F725）購自Sigma-Aldrich公司。辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（D110058）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 體外泛素結合酶活性檢測體系的建立

選擇擬南芥AtUBA2作為E1[4]，構建蛋白表達載體pGEX-6P-1-AtUBA2；選擇擬南芥AtUb[4]作為ubiquitin供體，構建蛋白表達載體pACYCDuet-AtUb。 將pGEX-6P-1-AtUBA2轉入BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取1個單克隆，命名為C1，保存菌種，用IPTG誘導表達蛋白，將C1誘導前和誘導后樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，脫色后觀察蛋白誘導表達情況。將上述成功誘導E1蛋白表達的菌種制備感受態(tài)細胞備用。

將pACYCDuet-AtUb轉入C1感受態(tài)細胞，挑取1個單克隆，命名為C2，保存菌種，用IPTG誘導表達蛋白，將C2誘導前和誘導后樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，脫色后觀察蛋白誘導表達情況。將上述成功誘導E1蛋白和Ub蛋白表達的菌種制備感受態(tài)細胞備用。

C1和C2株系感受態(tài)細胞即是泛素結合酶活性檢測體系的主要組分。下一步只需將待檢測E2構建到與pGEX-6P-1和pACYCDuet復制起點不一樣的蛋白表達載體質粒上，分別轉化C1和C2感受態(tài)細胞，分別誘導蛋白表達，通過蛋白印跡方法檢測待測E2蛋白是否有符合E2+Ub分子量遷移的條帶即可。

1.3 基因擴增及原核表達載體構建

利用擬南芥AtUBC10上游引物5′CGGAATTCGATGGCGTCGAAGCGGATCTTG3′和下游引物5′ACGCGTCGACTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCCCATGGCATACTTCTGAG3′將AtUBC10蛋白C端加上Flag標簽并構建到pCDFDuet載體上。

花生AhUBC34 氨基酸序列為：MAEKSCIKR

LQKEYRALCKEPVSHVVARPSPNDILEWHYVLEG

SEGTPFAGGYYYGKIKFPPEYPYKPPGISMTTPNG

RFMTQKKICLSMSDFHPESWNPMWSVSSILTGLLS

FMMDNSPTTGSVNTTTAEKQRLAKSSLSFNCKNAT

FRKMFPEYVEKYNQEQQLSEQVPPEQASSEAAPN

DTSPKVLLEKNLDSTEEGTKRVEQLKVVKKNGKQ

PFPAWMMLLLFSIFGVVMALPLLQL。據預測AhUBC34是一個跨膜蛋白，為增加蛋白的可溶性，我們利用AhUBC34上游引物5′CGGAATTCGATGGCAGAAAAGTCATGTATCAAG3′和下游引物5′ACGCGTCGACTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTGCTTTCCGTTTTTCTTTACAACC3′擴增出去掉跨膜域并在C端加上Flag標簽的AhUBC34，之后用EcoRⅠ和SalⅠ將改造后的AhUBC34構建到pCDFDuet載體上。

鹽芥TsUBC33的氨基酸序列為：MAEKACIKRLQKEYRSLCKEPVSHVVARPSPNDILEWHYVLEGSDGTPFAGGFYYGKIKFPAEYPYKPPGITMTTPNGRFATQKKLCLSMSDFHPESWNPMWSVSSILTGLLSFMMDNSPTTGSVNTTVAEKQLLAKSSLAFNC

KNATFRKLFPEYLEKYSQQQVAEKEEEATATQQR

TPEDSPEKDNARDESEKSVGLRKEDTKEVGLNKR

RRNKKEALPGWIIVLLVSIVGVVMALPLLQL。對鹽芥TsUBC33用同樣的方法擴增出去掉跨膜域并在C端加上Flag標簽的TsUBC33， 用EcoRⅠ和SacⅠ將改造后的TsUBC33構建到pCDFDuet載體上，所用引物分別為5′-CGCGGATCCGATGGCAGAGAAAGCTTGTATAAAGC-3′和5′-CGAGCTCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTCTTT

CTTGTTCCTTCTCCTC-3′。

1.4 IPTG誘導表達蛋白檢測

將相應質粒轉化BL21（DE3），挑取平板上的陽性菌落1～2個，接種于加入了合適抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)好的菌液接種于50 mL加入了合適抗生素的液體培養(yǎng)基中（用150 mL錐形瓶），調OD600至0.1左右（一般需加1 mL左右菌液），37℃培養(yǎng)約80 min至OD600為0.4～0.6之間時，吸取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min，棄上清，液氮速凍，保存于-80℃超低溫冰箱，作為誘導前蛋白樣品，其余菌液中加入0.1 mol/L的IPTG至終濃度為50 mmol/L，25℃培養(yǎng)12～16 h；吸取適量菌液，以保證樣品中的細菌數(shù)目大致相近，12 000 r/min離心1 min，棄上清，液氮速凍，保存于-80℃超低溫冰箱，為誘導后蛋白樣品；取誘導前和誘導后的樣品，分別加70 μL 1×PBS，混勻，沸水浴4 min，上樣20 μL，SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后考馬斯亮藍染色，脫色觀察結果；考馬斯亮藍染色確定E1、Ub和目的片段等均有表達后，將誘導后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，每個點樣孔上樣15 μL，準備進行蛋白印跡雜交（Western Blot）。

1.5 SDS-PAGE 電泳條件

配置 12%的分離膠和5%濃縮膠，蛋白樣品與上樣緩沖液混合后沸水浴 3～5 min，冷卻后即可進行電泳；電泳條件：穩(wěn)壓100 V；15～30 mA/板，1～2 h；電泳結束后將膠小心取下，放入考馬斯亮藍 R250 搖動染色2 h左右，然后考馬斯亮藍脫色液脫色，當膠的背景脫色干凈后見清晰蛋白條帶時拍照。

1.6 蛋白質印跡（Western Blot）步驟

SDS-PAGE電泳結束后從玻璃板中取出凝膠，去掉濃縮膠，保留分離膠，將其浸泡在轉膜緩沖液中，剪取與凝膠同樣大小的硝酸纖維素膜，并浸泡于膜轉移緩沖液中。在凝膠轉印夾的黑色孔板上放上纖維襯墊和濾紙，用玻璃棒趕走氣泡，之后放上膠，然后將硝酸纖維素膜蓋在膠上，輕輕滾動玻璃棒趕走氣泡，然后依次放上濾紙及纖維襯墊。穩(wěn)壓轉膜100 V，70 min，保持低溫。膜封閉：室溫下封閉緩沖液中30 min，倒掉封閉緩沖液，加入雜交膜清洗液（TBST buffer），室溫下5 min，重復TBST Buffer一次；倒掉TBST Buffer，加入anti-Flag一抗，室溫下孵育1 h；加入TBST Buffer，室溫下5 min，重復一次，加入二抗，室溫下孵育1 h；洗膜：TBST buffer室溫洗膜2次，每次5 min；從ECL顯色發(fā)光試劑盒中各取1 mL Stock A和Stock B混合，均勻浸潤膜；用保鮮膜封好后于Bio-Rad照膠儀器顯影。

2 結果與分析

2.1 體外泛素結合酶活性檢測體系的建立

C1誘導前和誘導后蛋白表達情況見圖1，可以在預期位置看到明顯的AtUBA2誘導表達條帶。

C2誘導前和誘導后蛋白表達情況見圖2，可以在預期位置分別看到明顯的AtUBA2和AtUb的誘導表達條帶。

擬南芥泛素結合酶AtUBC10是體外泛素化檢測常用的泛素結合酶，我們以AtUBC10為例，通過上述系統(tǒng)對AtUBC10的泛素結合酶活性進行檢測，如圖3所示，觀察誘導前后蛋白條帶變化，在預期分子量的位置，AtUBA2、AtUb和AtUBC10蛋白均被誘導表達。泛素結合酶活性結

果如圖4所示，除檢測到AtUBC10蛋白條帶外，還能夠成功檢測到另一條遷移帶，分子量符合AtUBC10加上一個Ub分子的大小，說明該檢測體系構建成功。

2.2 花生AhUBC34泛素結合酶活性檢測

利用以上系統(tǒng)，我們檢測了花生AhUBC34的泛素結合酶活性?；ㄉ鶤hUBC34基因序列來源于栽培品種魯花14的轉錄組測序結果。構建pCDFDuet-AhUBC34蛋白表達載體，將其轉入BL21（DE3）細胞，挑選單克隆進行培養(yǎng)，誘導蛋白表達，并將誘導前后的樣品進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，證明AhUBC34蛋白能夠成功被誘導表達。隨后將pCDFDuet-AhUBC34分別轉入C1和C2感受態(tài)細胞，挑選單克隆進行培養(yǎng)，誘導蛋白表達，并將誘導前后的樣品進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，證明AtUBA2、AtUb和AhUBC34蛋白均能夠被成功誘導表達，結果見圖5。將上述誘導前后的樣品進行SDS-PAGE電泳，隨后進行蛋白印跡，除檢測到AhUBC34蛋白條帶外，還能夠成功檢測到另一條遷移帶，分子量符合AhUBC34加上一個Ub分子的大小，結果見圖6，證明AhUBC34具備泛素結合酶活性。

2.3 鹽芥TsUBC33泛素結合酶活性檢測

為了進一步驗證以上泛素結合酶活性檢測方法是否可行，我們檢測了鹽芥泛素結合酶TsUBC33的活性。鹽芥TsUBC33來源于山東型鹽芥（NCBI reference sequence： XM_006402032.1）。構建pCDFDuet-TsUBC33蛋白表達載體，將其轉入BL21（DE3）細胞，挑選單克隆進行培養(yǎng)，誘導蛋白表達，并將誘導前后的樣品進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，證明TsUBC33蛋白能夠成功被誘導表達。將pCDFDuet-TsUBC33分別轉入C1和C2感受態(tài)細胞，挑選單克隆進行培養(yǎng)，誘導蛋白表達，并將誘導前后的樣品進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，證明AtUBA2、AtUb和TsUBC33蛋白均能夠被成功誘導表達，結果見圖7。將上述誘導前后的樣品進行SDS-PAGE電泳，隨后進行蛋白印跡，除檢測到TsUBC33蛋白條帶外，還能夠成功檢測到另一條遷移帶，分子量符合TsUBC33加上一個Ub分子的大小，結果見圖8，證明TsUBC33具備泛素結合酶活性。

3 結論

相比現(xiàn)有的檢測方法，應用本系統(tǒng)進行泛素結合酶活性檢測，可以省去裂解細胞、提取蛋白的繁瑣步驟，減少在提取和保存蛋白以及蛋白凍融時造成的活性損失，減少假陰性；可以省去繁復的活性檢測步驟，無需建立體外反應體系，無需摸索反應條件；本系統(tǒng)提供的蛋白表達株系可以穩(wěn)定遺傳和表達，用此方法建立C1和C2后，可針對不同的E2進行多次反應，無需多次表達蛋白；本系統(tǒng)適用于多種植物泛素結合酶活性的檢測，對于其它物種的泛素結合酶活性檢測同樣適用，只需根據物種調整E1的種類即可。本系統(tǒng)的應用將有力地推進泛素結合酶功能的研究。

參 考 文 獻：

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