李哲麗，葉尤松，張 庶，馮 蕾，王陳蕓，陳 倩，唐東紅*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，昆明 650101； 3.云南省中醫(yī)學(xué)院，昆明 650200)

獼猴(Macacamulatta)，又名恒河猴(rhesus monkey)，在形態(tài)學(xué)、生理生化代謝等方面與人類非常相似，是較為理想的實驗動物，常用于許多重要的科學(xué)研究。肝是脊椎動物最大的實質(zhì)性器官，有代謝、貯存糖原、分泌膽汁及吞噬防御等重要功能。在正常獼猴體內(nèi)肝位于右上腹，上界在右鎖骨中線第五肋骨上緣，下界與右季肋緣平齊，一般不超出右側(cè)肋弓。肝臟血液供應(yīng)豐富，呈紅褐色，可分為左、右、前、后四個緣和兩個面(膈面和臟面)。腎是脊椎動物的重要器官，屬于泌尿系統(tǒng)的一部分，負(fù)責(zé)過濾血液中的雜質(zhì)、維持體液和電解質(zhì)的平衡，最后產(chǎn)生尿液經(jīng)由后續(xù)管道排出體外；同時也具備內(nèi)分泌的功能以調(diào)節(jié)血壓等，在維持機體酸堿平衡、機體的代謝、廢物排泄等方面起著重要作用。在獼猴體內(nèi)，正常獼猴具備兩枚腎，位于腰部兩側(cè)后方，腎為暗紅色實質(zhì)性器官，表面光滑，可分為上、下兩端，前、后兩面，內(nèi)、外側(cè)兩緣。成年雄性獼猴腎重量約16～32 g，雌性獼猴腎重量約15～33 g，雌雄獼猴腎重量差異不大。左腎較右腎稍大，腎縱軸上端向內(nèi)、下端向外，因此兩腎上極相距較近，下極較遠(yuǎn)，腎縱軸與脊柱所成角度為30°左右。

肝和腎是獼猴的重要器官，隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，在人類疾病動物模型的建立及相關(guān)機理研究實驗中，常需要觀察其疾病狀態(tài)下基因在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平方面的變化，獲得相關(guān)實驗數(shù)據(jù)[1-2]。常規(guī)方法取材是直接處死動物來獲取相應(yīng)的組織，采用活體取材的方式獲得肝、腎組織以提取RNA及蛋白樣品[3]，可以實時獲得藥物代謝不同階段的組織樣品，進行相關(guān)分析，符合實驗動物福利制度，降低實驗成本[4-5]。

近年來，超聲技術(shù)被應(yīng)用于人類肝、腎活體穿刺術(shù)，具有定位準(zhǔn)確、成功率高、并發(fā)癥少等特點，彌補了傳統(tǒng)手術(shù)定位不準(zhǔn)、成功率低等不足[6]。B超引導(dǎo)的活體穿刺方法應(yīng)用于獼猴獲取新鮮組織樣品少有報道，現(xiàn)通過B超引導(dǎo)對獼猴肝、腎進行活體穿刺取材，建立一套簡單、快捷的獲取肝、腎組織取材方法，為獼猴肝、腎代謝研究奠定基礎(chǔ)動物實驗技術(shù)。在實施穿刺術(shù)時，需要使用B超探查獼猴的肝、腎并進行定位，再通過穿刺引導(dǎo)架引導(dǎo)穿刺針進行穿刺取材，定位的準(zhǔn)確與否是成功的關(guān)鍵[7]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級成年獼猴4只，體重8～12 kg，雄性，來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所[SCXK (滇) K2014-0001]，實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所完成[SYXK (滇) K2014-0007]。動物實驗由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動物實驗倫理審查委員會通過，批準(zhǔn)號為2017-004。同時按照實驗動物的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸氯胺酮麻醉劑，每支2 mL(0.3 g)，購于江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司；醫(yī)用碘伏，購于德州默霖消毒科技有限公司；TriPure，購于Roche公司；瓊脂糖，購于碩陽科技有限公司。彩色電腦聲像儀(MyLab 30CV，意大利百勝)；巴德活檢槍(MG15-22，上海庫豐實業(yè)有限公司)；活檢穿刺針(100 mm，河南省圣吉安醫(yī)療器械有限公司)；穿刺引導(dǎo)架(ABS421，上?；芰ι锟萍加邢薰?；B超介入手術(shù)包，購于昆明寶利康醫(yī)療衛(wèi)生用品有限公司；沙袋、布腹帶(自制)；剃毛器(寶潤P6大功率寵物電推剪)；高速冷凍離心機(Sigma公司)；ND-1000紫外分光光度計(美國NanoDrop公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物的準(zhǔn)備

根據(jù)動物體重進行肌肉注射鹽酸氯胺酮對動物進行麻醉，麻醉劑量為5～10 mg/kg，注射后約5～10 min，待其麻醉后，用剃毛器剃去其右上腹肋間至側(cè)腰部肋緣下區(qū)域的被毛，以便于B超探頭的探查。將手術(shù)墊巾鋪在動物手術(shù)臺上，將已剃好被毛的獼猴置左側(cè)臥位擺放在手術(shù)臺上，用碘伏進行消毒，并加蓋無菌手術(shù)洞巾待手術(shù)。

1.3.2 B超的準(zhǔn)備及穿刺針的安裝

從B超介入手術(shù)包取出一次性塑料探頭套子將3.5 Hz彩色電腦聲像儀(MyLab 30CV)探頭套上，以避免探頭被交叉污染。將ABS421 B超穿刺引導(dǎo)架安裝在B超探頭上，見圖1，將穿刺針安裝在活檢槍上待用。

注：A：穿刺引導(dǎo)架。圖1 安裝完成穿刺引導(dǎo)架的3.5 Hz的B超探頭Note. A: Puncture guiding frame.Fig.1 A 3.5 Hz transducer fixed with a guiding frame

1.3.3 肝穿刺取材

將3.5 Hz的B超探頭于獼猴右上腹肋間區(qū)域進行探查，取腋前線的第八肋間以及腋中線的第九肋間作為穿刺點[8]的參考位置，穿刺點的主要依據(jù)是在B操引導(dǎo)下，通過B超的定位尤其在穿刺引導(dǎo)架的引導(dǎo)下進行，穿刺者立于獼猴左側(cè)，配合影像操作人員操作[9]，當(dāng)B超探查到穿刺目標(biāo)并鎖定時，根據(jù)B超實時圖像，注意避讓膽囊，將活檢槍的射程調(diào)為15 mm，將穿刺針在穿刺引導(dǎo)架的引導(dǎo)下垂直經(jīng)皮膚插入腹部約1 cm，經(jīng)腹穿刺進針點見圖4中的“1”(箭頭所示)，觀察動物的呼吸，輕微移動B超探頭，觀察B超實時影像，使穿刺目標(biāo)與穿刺針位置在引導(dǎo)線內(nèi)，即穿刺目標(biāo)與穿刺針為垂直部位，并避開膽囊，按動穿刺針扳機按鈕進行穿刺，如圖2A中“4”顯示的白色回聲影像為肝臟穿刺針?biāo)查g到達回聲，圖2B中“3”為猴體內(nèi)的膽囊，“2”代表整個肝臟回聲區(qū)域。穿刺后迅速拔出穿刺針。

注：A：進入肝臟的穿刺針超聲回聲圖；B：肝臟超聲回聲圖；C：B超引導(dǎo)下肝臟穿刺示意圖。1：穿刺引導(dǎo)線；2：整個肝臟回聲區(qū)域；3：膽囊；4：穿刺針。圖2 肝臟穿刺B超影像及示意圖Note. A: Ultrasonic image of the puncture needle into the liver. B: Ultrasonic image of the liver. C: Schematic sketch. 1: Puncture guide line; 2: Whole liver echo area; 3: Gallbladder; 4: Puncture needle.Fig.2 Images and schematic diagram of B-mode ultrasonography of liver puncture

1.3.4 腎穿刺取材

將3.5 Hz的B超探頭于獼猴側(cè)腰部肋緣下腹部區(qū)域進行探查，當(dāng)B超探頭探到穿刺目標(biāo)腎時，進一步調(diào)整探頭的方向以便于確認(rèn)所要穿刺的腎器官，穿刺目標(biāo)為右腎下脊實質(zhì)，穿刺的時候根據(jù)B超實時圖像，注意避讓腎下腔靜脈及門靜脈，將活檢槍的射程調(diào)為15 mm，將穿刺針在穿刺引導(dǎo)架的引導(dǎo)下垂直經(jīng)皮膚插入腹部約1 cm，經(jīng)腹穿刺進針點見圖4中的“2”(箭頭所示)，觀察動物的呼吸，輕微移動B超探頭，觀察B超實時影像，使穿刺目標(biāo)與穿刺針位置在引導(dǎo)線內(nèi)，即穿刺目標(biāo)與穿刺針為垂直部位，并避開腎血管，按動穿刺針扳機按鈕進行穿刺，如圖3A中“5”顯示的白色回聲影像為腎穿刺針?biāo)查g到達回聲，圖3B中“3”、“4”分別為猴體內(nèi)靠近腎臟的兩大血管，腎腔靜脈和門靜脈，“2”代表整個腎臟回聲區(qū)域。穿刺時間為1/1000 s，腎穿刺深度在12～15 mm之間[2]，穿刺后迅速拔出穿刺針。

注：A：進入腎臟的穿刺針超聲回聲圖；B：腎臟超聲回聲圖；C：B超引導(dǎo)下腎臟穿刺示意圖。1：穿刺引導(dǎo)線；2：整個腎臟回聲區(qū)域；3：腎腔靜脈；4：門靜脈；5：穿刺針。圖3 腎穿刺B超影像及示意圖Note. A: Ultrasonic image of the puncture needle into the kidney. B: Ultrasonic image of the kidney. C: Schematic sketch. 1: Puncture guide line; 2: Whole kidney echo area; 3: Vena cava of kidney; 4: Portal vein; 5: Puncture needle.Fig.3 Images and schematic diagram of B-mode ultrasonography of kidney puncture

注：1：肝穿刺點；2：腎穿刺點。圖4 肝、腎穿刺傷口Note. 1: Puncture site of the liver; 2: Puncture site of the kidney.Fig.4 Puncture sites of the liver and kidney

1.3.5 樣品的處理

穿刺后將穿刺針迅速拔出后，肝、腎組織樣品已采集到針頭的凹槽中，凹槽內(nèi)腔每槍可獲得組織樣品約10～14 mg。經(jīng)測量計算，穿刺針的凹槽內(nèi)腔體積為13.35 mm3，經(jīng)肝、腎的質(zhì)量及體積初步計算得獼猴肝的密度ρ肝=1.0029 mg/mm3，腎的密度ρ腎=0.9923 mg/mm3，故若取樣剛好填滿穿刺針凹槽內(nèi)腔，則穿刺取到的樣品質(zhì)量分別為m肝=13.39 mg，m腎=13.25 mg，因取樣誤差，所取到的樣品質(zhì)量約為10 mg(所取到的樣品未填滿穿刺針凹槽內(nèi)腔)～ 14 mg(穿刺非常成功，樣品塞滿甚至溢出穿刺針凹槽內(nèi)腔)。將所獲得的肝、腎組織置入分裝好1 mL TriPure試劑的離心管中，加蓋顛倒使組織浸泡在TriPure液體中，標(biāo)記好樣品編號待用。

1.3.6 穿刺術(shù)后動物的護理

在穿刺完成后，須再用B超探頭掃查腹腔，觀察有無腹腔積液，排除大出血情況。為動物的穿刺部位蓋上無菌紗布并將小沙袋壓在紗布之上，并用布腹帶把穿刺部位扎好即可，見圖5。為防止動物蘇醒后動物大幅度動作引起穿刺部位出血，在動物即將蘇醒時根據(jù)其狀態(tài)再次注射相應(yīng)劑量麻醉劑，可適當(dāng)延長動物安靜休息時間。術(shù)后禁食3 h，穿刺術(shù)后護理應(yīng)連續(xù)觀察動物6 h以上，以防出現(xiàn)需緊急處理的異常情況，次日清晨后可進食[10]。

圖5 自制裹腹帶包扎穿刺部位Fig.5 The self-made abdominal belt

1.3.7 獼猴肝、腎組織總RNA的提取

將裝有新鮮腎組織(10～14 mg)的離心管，放入組織研磨儀(50 Hz，45 s)，充分研磨，靜置5 min，直至管內(nèi)為澄清液體，將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管內(nèi)，再靜置5 min，加入200 μL氯仿，并漩渦振蕩，充分靜置15 min，再以11 441 r/min于4℃離心25 min，吸取上清液450 μL于另一離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，靜置10 min，以11 441 r/min于4℃離心10 min，棄上清液，待管內(nèi)壁稍干，加入1 mL -20℃預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，9045 r/min于4℃離心5 min，棄上清液，待內(nèi)壁充分干燥，加入30 μL DEPC水(無RNA酶水)溶解沉淀。

1.3.8 RNA濃度測定及完整性檢測

(1)所提取的RNA濃度測定：取RNA提取液2 μL于ND-1000紫外分光光度計測定RNA濃度。

(2)所提取的RNA完整性檢測：取RNA提取液2 μL于1.5%瓊脂糖凝膠以90 V、400 mA的條件進行電泳20 min，并于凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察28s、18s和5s RNA條帶，分析RNA的完整性。

2 結(jié)果

2.1 穿刺術(shù)后觀察及動物恢復(fù)狀況、成活率

在穿刺完成后，用B超探頭掃查腹腔，未見腹腔積液，排除大出血情況，經(jīng)后續(xù)觀察，動物的呼吸正常、恢復(fù)情況良好，動物無一例死亡，成活率100%。

2.2 RNA濃度測定

對所提取的總RNA經(jīng)ND-1000紫外分光光度計測定RNA濃度，數(shù)據(jù)如下：其中A260 nm/A280 nm介于1.8～2.0之間，說明所獲得的RNA純度高。見表1。

2.3 RNA檢測結(jié)果

圖6可見5s、18s、28s RNA條帶明亮，證明提取得到RNA無降解，可用于后續(xù)實驗。

表1 所獲得的RNA濃度及A260 nm/A280 nm、A260 nm/A230 nm比值Tab.1 Concentration and A260 nm/A280 nm, A260 nm/A230 nm ratios of the extracted total RNA by ultraviolet spectrophotometry

注：1～4:4只動物腎組織；5～8:4只動物肝臟組織。圖6 RNA電泳凝膠成像圖Note. 1-4: Kidney tissues of 4 animals. 5-8: Liver tissues of 4 animals.Fig.6 Image of RNA gel electrophoresis

3 討論

近年來，超聲技術(shù)作為一種非侵入性手段，已應(yīng)用于人類肝、腎活體穿刺術(shù)，定位準(zhǔn)確、成功率高、并發(fā)癥少，彌補了傳統(tǒng)手術(shù)定位不準(zhǔn)、成功率低等不足。目前尚未見利用B超引導(dǎo)，尤其在穿刺引導(dǎo)架定位下，對獼猴進行肝、腎活體穿刺獲得組織樣品的報道。由于肝內(nèi)有門靜脈之類的大血管，膽囊也離肝比較近，左腎的內(nèi)側(cè)有腹主動脈，右腎的內(nèi)側(cè)有下腔靜脈，兩腎的內(nèi)后方分別有左、右腰交感干，腎活體穿刺難度大，傳統(tǒng)的活體穿刺取材方式只能憑借理論上的解剖位置操作。穿刺針穿刺的深度不能過深，肝穿刺時穿刺過深容易穿透肝或刺破肝大血管甚至刺破膽囊，腎穿刺時穿刺過深容易穿刺到髓質(zhì)部分，若穿刺到髓質(zhì)部位將可能導(dǎo)致腎間質(zhì)的血管損傷而出血，然解剖位置只是在標(biāo)準(zhǔn)體位下的一個參考位置，會因不同的體位和呼吸的急促性而發(fā)生改變。用傳統(tǒng)的活體穿刺取材方法憑借理論解剖位置和經(jīng)驗在不可視的情況下進行取材，定位可能不準(zhǔn)確，容易扎破獼猴的臟器和體內(nèi)大血管、膽囊等，引起獼猴死亡，存活率沒有保障，而且該方法對操作者的要求非常高，必須有豐富的操作經(jīng)驗。相對于傳統(tǒng)的穿刺方法，利用B超引導(dǎo)，尤其在穿刺引導(dǎo)架定位下，可對獼猴肝、腎進行較為準(zhǔn)確的活體穿刺，以獲得組織樣品，可有效的避開膽囊、大血管，如下腔靜脈及門靜脈等重要的致命的大血管，防止動物大出血，避免因為扎破膽囊、大出血等造成的動物死亡，該方法為可視性操作，安全、定位準(zhǔn)確、方便、快捷[11]，對操作者的要求也沒有傳統(tǒng)穿刺方法那么高。

與傳統(tǒng)的取材方式相比，活體穿刺取材的核心是“精準(zhǔn)、快捷”[12]，活檢槍穿刺后，由于創(chuàng)傷小，取材速度快，只要未刺到大血管，只需為穿刺部位蓋上無菌紗布并用布腹帶把穿刺部位扎好即可。人體活檢需在穿刺結(jié)束后予穿刺處無菌紗布覆蓋按壓5～10 min，再用多頭腹帶加壓包扎[13]，而本方法在穿刺位置上用自制沙袋加壓，可避免發(fā)生皮下滲血，同時使用布腹帶包扎，能夠降低由于呼吸造成的臟器活動，避免出現(xiàn)肝、腎出血[14]。在術(shù)后護理過程中大大節(jié)約了人力和操作時間。

通過B超定位，尤其在穿刺引導(dǎo)架的引導(dǎo)下對獼猴進行肝、腎活體穿刺取材，定位準(zhǔn)，可有效地避開大血管，無一例死亡，存活率達到100%，此外動物損傷小、出血少，實時、可見，所獲得的新鮮組織可直接用于提取RNA，為實驗研究的取材方式提供方便、快捷、有效手段。本方法能降低研究成本，并提高實驗室非人靈長類動物的生活質(zhì)量和動物福利，同時保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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