呂靜薇，宋廣青，董黎明，姜 寧，陳善廣，劉新民*

(1.中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國航天員科研訓練中心人因工程重點實驗室，北京 100094)

物體認知實驗方法是1988年由Ennaceur提出，它是基于嚙齒類動物天生具有的新奇偏愛性，用于檢測動物的學習記憶能力與傳統(tǒng)的檢測方法相比，不需給予正向(獎賞)或反向(懲罰)的刺激，也不需冗長的訓練，動物分別根據(jù)“新舊物體”特征、位置、出現(xiàn)的順序和所處的背景對“新舊物體”進行辨別，能夠檢測從簡單的物體識別記憶到復雜的空間、時序和情景記憶[1]，對動物學習記憶行為實現(xiàn)精細化區(qū)分，實驗簡單易操作。在學習記憶發(fā)生發(fā)展機制、認知障礙防護藥物和保健品研發(fā)等方面具有重要應用價值[2-3]。但目前國內(nèi)尚未見對其四種實驗模式及操作影響因素的系統(tǒng)研究。

本文選擇兩種常用品系小鼠，對新物體識別、物體位置識別、時序記憶和情景記憶四個模式的實驗方法操作步驟，以及測試期時間、熟悉期與測試期間隔時間等因素展開研究，為物體認知的應用提供穩(wěn)定可靠、客觀規(guī)范的操作方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級，ICR雄性小鼠108只和KM雄性小鼠48只，24～28 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2012-0001]。動物自購入后先進行一周的適應性飼養(yǎng)，實驗期間給予動物充足的食、水，實驗室保持安靜，溫度(23±2)℃，濕度(50±10)%，12 h照明/12 h黑暗環(huán)境(上午8:00開燈)[SYXK (京) 2013-0023]。實驗遵守國際實驗動物倫理學要求，實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。每天進行實驗的時間固定，實驗開始前將動物由動物房移入實驗室中適應約20 min，實驗裝置調(diào)節(jié)燈光強度在60 lx左右。

1.2 主要儀器

物體認知實驗設(shè)備：由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所、中國航天員科研訓練中心、北京康森益友有限公司聯(lián)合研制。設(shè)備包括四個測試箱和不同的物體，并于箱體頂部裝置攝像頭進行實時監(jiān)測。

1.3 實驗方法

1.3.1 新物體識別實驗

適應期實驗中將動物放入沒有任何物體的實驗箱中，每只每天10 min，每天1次，連續(xù)3 d。第4天進行熟悉期實驗，開始時箱中不放入任何物體，將動物放入再次適應2 min，動物取出后，放入兩個完全相同的物體，分別記錄每只動物5 min內(nèi)對左側(cè)物體的探索時間(exploration time for left object，Tl)和對右側(cè)物體的探索時間(exploration time for right object，Tr)。

熟悉期后將動物放回飼養(yǎng)籠中，10 min后開始測試期實驗。測試期時放入兩個不同的物體，其中一個物體與熟悉期的物體完全相同，另外一個是新奇物體(與熟悉期物體匹配)，動物放入后計時5 min，分別記錄動物在不同時間段對熟悉物體的探索時間(exploration time for familiar object，Tf)和對新奇物體的探索時間(exploration time for novel object，Tn)。

探索活動定義為：小鼠的鼻子近距離指向物體或者直接嗅、舔物體。當其他部位接觸物體而鼻子沒有指向物體或站在物體上時非對物體的探索活動[4]。

1.3.2 物體位置識別實驗

適應期與熟悉期實驗過程同新物體識別實驗，而測試期與新物體識別實驗不同，只是將熟悉期中兩個相同物體中的一個移到新的位置，動物放入后計時5 min，分別記錄動物在不同時間段對兩不同物體的探索時間。

1.3.3 時序記憶實驗

時序記憶實驗程序和上述兩種方法有所不同，實驗流程見圖1，包括2個熟悉期，即熟悉期1和熟悉期2，其他過程基本相同。適應期同新物體識別。

第4天進行熟悉期實驗，開始時箱中無任何物體，將動物放入再次適應2 min，動物取出后放入兩相同的物體，進行熟悉期1實驗，分別記錄5 min內(nèi)對兩個完全相同物體的探索時間；將動物取出后放入飼養(yǎng)籠中，10 min后進行熟悉期2實驗，在同一個實驗箱中放入另外兩個完全相同的物體(與熟悉期1中物體匹配)，分別記錄5 min內(nèi)對兩個完全相同物體的探索時間。熟悉期2后將動物放回飼養(yǎng)籠中，10 min后開始測試期實驗。測試期時放入兩個不同的物體，分別是熟悉期1和熟悉期2中各一個物體，動物放入后計時5 min，分別記錄在不同時間段對兩不同物體的探索時間。

注：以紅色圓圈標記物體為新奇物體。圖1 時序記憶實驗操作流程圖Note. Red circles indicate novel objects.Fig.1 Schematic diagram of the experimental process of temporal order memory task

注：以紅色圓圈標記物體為新奇物體。為保持配對平衡，A、B兩種放置方式均需考慮。圖2 情景記憶實驗操作流程圖Note. Red circles indicate novel objects. Objects should be placed as A and B for counterbalance.Fig.2 Schematic diagram of the experimental process of object context recognition task

1.3.4 情景記憶實驗

情景記憶實驗程序與時序記憶實驗類似，也包括2個熟悉期，但在不同背景的實驗箱中進行，實驗流程見圖2。

適應期實驗將動物放入具有第一種背景的實驗箱中，適應完成10 min后，再放入第二種背景的實驗箱中，每種實驗箱適應過程與新物體識別中適應期實驗相同。第4天開始熟悉期實驗，在具有第一種背景的實驗箱中放入兩相同的物體，進行熟悉期1實驗，分別記錄5 min內(nèi)對兩個完全相同物體的探索時間；將動物放回飼養(yǎng)籠中，10 min后進行熟悉期2實驗，在具有第二種背景的實驗箱中放入另外兩個完全相同的物體(與熟悉期1中的物體匹配)，分別記錄5 min內(nèi)對兩相同物體的探索時間。熟悉期2后將動物取出放入飼養(yǎng)籠中，10 min后進行測試期實驗，計時5 min，分別記錄在不同時間段對兩不同物體的探索時間。

1.3.5 不同時間間隔時的物體辨別記憶能力考察

將動物隨機分為5組，熟悉期與測試期間隔分別設(shè)置為10 min，30 min，60 min，90 min，120 min。實驗步驟與新物體識別實驗相同，僅每組動物檢測時熟悉期與測試期間隔不同。記錄每組動物在5 min測試期中不同時間段對兩不同物體的探索時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 新物體識別實驗結(jié)果分析

由圖3可知，KM和ICR小鼠熟悉期對兩完全相同物體的探索時間差異無顯著性，動物對物體放置的位置未表現(xiàn)出偏愛性。由圖4A和4B可知，測試期實驗時，KM小鼠在1～5 min和ICR小鼠在2～5 min時Tn顯著多于Tf，DI與0相比有顯著性(P< 0.01)，兩品系小鼠可識別新舊物體。

2.2 物體位置識別實驗結(jié)果分析

相較于原位置的物體，動物對移動到新位置的物體更感興趣。Tn表示測試期移動到新位置物體的探索時間，Tf表示測試期對原位置物體的探索時間。由圖5A可知，KM和ICR兩種小鼠在物體位置識別實驗中，測試期實驗時間為3～5 min時，Tn都顯著多于Tf(P< 0.05，P< 0.01)；圖5B表示在測試期實驗時間為2～5 min時，KM和ICR兩種小鼠DI都顯著大于0(P< 0.05，P< 0.01)，兩品系小鼠可辨別出物體位置的變化。

2.3 時序記憶實驗結(jié)果分析

由于出現(xiàn)的時序不同，相對于熟悉期2，動物對先出現(xiàn)的熟悉期1物體更感興趣。熟悉期1中的物體作為新物體，其探索時間以Tn表示，熟悉期2中的物體探索時間以Tf表示。由圖6A可知，測試期實驗KM小鼠3 min時和ICR小鼠1 min、4 min或5 min時Tn顯著多于Tf(P< 0.05)，由圖6B可知，KM小鼠3 min或5 min時DI顯著大于0(P< 0.05)，ICR小鼠3～5 min時DI都大于0(P< 0.05，P< 0.01)。兩種品系的小鼠對先后遇到的物體是有記憶的，都能夠根據(jù)出現(xiàn)的前后對其進行辨別。

圖3 熟悉期KM和ICR小鼠對兩物體放置位置偏愛性的比較Fig.3 Comparison of time consumption of the KM and ICR mice for exploring both familiar objects during familiar phase in the novel object recognition task

注：A：測試期探索時間；B：相對辨別指數(shù)。與Tf比較，**P< 0.01；與0比較，## P< 0.01。圖4 測試期KM和ICR小鼠的物體辨別記憶能力比較Note. A: Exploring time during test phase. B: Relative discrimination index. Compared with Tf,**P< 0.01. Compared with 0,##P< 0.01.Fig.4 Comparison of the object recognition ability between the KM and ICR mice during test phase

2.4 情景記憶實驗結(jié)果分析

測試背景與物體之前所處實驗背景不匹配或不一致的物體更能引起嚙齒類動物的興趣，與測試期實驗箱背景不匹配物體可看作新物體，測試期探索時間即Tn，而與測試期實驗箱背景匹配物體探索時間即Tf。由圖7A可知，測試期KM小鼠3～5 min時和ICR小鼠4 min及5 min時Tn均顯著多于Tf(P< 0.05，P< 0.01)；由圖7B可知，KM小鼠在2～5 min時DI顯著大于0(P< 0.05，P< 0.01)，ICR小鼠在4 min或5 min時DI都大于0(P< 0.01)。兩種品系的小鼠在該種實驗條件下，對物體熟悉期所處的實驗箱背景是有記憶的，都能夠根據(jù)物體與實驗箱背景是否匹配對其進行辨別。

注：A：測試期探索時間；B：相對辨別指數(shù)。與Tf比較，* P< 0.05，**P< 0.01；與0比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖5 測試期KM和ICR小鼠的物體位置辨別記憶能力比較Note. A: Exploring time during test phase. B: Relative discrimination index. Compared with Tf,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with 0,#P< 0.05,##P< 0.01.Fig.5 Comparison of the object location recognition ability between the KM and ICR mice during test phase

注：A：測試期探索時間；B：相對辨別指數(shù)。與Tf比較，* P< 0.05，**P< 0.01；與0比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖6 測試期KM和ICR小鼠的時序記憶能力比較Note. A: Exploring time during test phase. B: Relative discrimination index. Compared with Tf,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with 0,#P< 0.05,##P< 0.01.Fig.6 Comparison of the object temporal order memory ability between the KM and ICR mice during test phase

注：A：測試期探索時間；B：相對辨別指數(shù)。與Tf比較，* P< 0.05，** P< 0.01；與0比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖7 測試期KM和ICR小鼠的情景記憶能力比較Note. A: Exploring time during test phase. B: Relative discrimination index. Compared with Tf,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with 0,#P< 0.05,##P< 0.01.Fig.7 Comparison of the object context recognition ability between the KM and ICR mice during test phase

2.5 不同時間間隔時的物體辨別記憶能力

由圖8可知，新物體識別實驗熟悉期與測試期的間隔(delay)10 min，ICR小鼠在測試期2～5 min時，DI顯著大于0(P< 0.01)；當delay=30 min，ICR小鼠在測試期3～5 min時，DI顯著大于0(P< 0.05，P< 0.01)；當delay=1 h，ICR小鼠在測試期4 min或5 min時，DI顯著大于0(P< 0.05)。以上結(jié)果表明，ICR小鼠時間間隔≤ 1 h時，能夠辨別出新奇物體和熟悉物體，當時間間隔延長到90 min或2 h時則難以辨別。

注：與0比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖8 ICR小鼠不同時間間隔下的物體辨別記憶能力Note. Compared with 0,#P< 0.05,##P< 0.01.Fig.8 Object recognition and memory ability of the ICR mice at different time intervals

3 討論

在物體認知實驗中，需充分考慮動物對物體的識別能力和物體配對的平衡。物體材料要相同，同時避免氣味觸覺影響[5]，另考慮對物體尺寸與動物的體長的關(guān)系[6-8]。除對物體本身的要求外，另需注意實驗過程中物體的取拿及擦洗，如保持同種材料手套的佩戴，每只動物實驗完成后，采用10%的酒精進行擦拭，每階段實驗完成后用75%酒精擦洗，后用清水沖洗干凈，晾干備用等[9]。

研究表明“新奇偏愛性”存在時間有一定限度[10]，動物對物體的探索主要集中在實驗開始的幾分鐘內(nèi)[11-12]。本實驗中兩種小鼠在測試期總時間為5 min，各時間段內(nèi)的DI有所不同，但在3～5 min時間段時最為敏感，能夠反應出動物的識別記憶能力。

由于存在自然遺忘現(xiàn)象，隨著熟悉期和測試期時間間隔延長，動物對不同物體的識別難度增加。ICR小鼠在新物體識別實驗中，自然遺忘開始在1 h～90 min之間。Bertaina-Anglade等發(fā)現(xiàn)大鼠在10 min～3 h內(nèi)，小鼠在1 h時表現(xiàn)正常辨別記憶能力[13]。確定自然遺忘開始時間是進行物體認知實驗的前提，一般選較長間隔用于篩選改善作用潛在藥物，而選較短間隔檢測記憶損傷作用[14]。

物體認知實驗方法經(jīng)調(diào)整后，可用于不同程度以及不同類型的學習記憶評價[15-16]，并具有簡單易操作、周期較短[17-18]、不需要額外的動機(獎勵或懲罰)等優(yōu)點。其中，物體位置識別實驗考察動物的空間記憶能力，另三種為非空間記憶能力檢測方法。除此之外，時序及情景記憶能力能夠充分模擬人類日常生活的識別記憶。目前，物體認知實驗中探索時間多采用人工計時，主觀性和判斷標準難統(tǒng)一。Matsumoto等采用3D跟蹤系統(tǒng)進行分析[19]，但其準確性有待考證?？傊?，利用計算機圖像技術(shù)實現(xiàn)探索時間自動化分析，優(yōu)化探索標準和評價指標，是物體認知實驗未來發(fā)展方向，此種精細敏感的行為學實驗方法也將獲得更廣泛的應用。

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