秦夢雪 孫新穎 萬曉媛 劉慶慧① 黃 倢

(1. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展迅猛，而養(yǎng)殖中出現(xiàn)的病害卻十分嚴(yán)峻(Nakanoet al, 1994; Wongteerasupayaet al,1995; Karunasagaret al, 1997)。其中，作為危害最為嚴(yán)重之一的白斑病，自20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)后，給全球各地的水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)造成了難以估量的損失。白斑病由對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)引起。WSSV基因組約為300 kb，為環(huán)狀、雙鏈DNA病毒，能夠感染數(shù)10種甲殼綱動物和水生浮游動物(Mayo, 2002; Hossainet al, 2001)，可使被感染動物在3～10 d內(nèi)死亡(Lightner, 1996)。

有大約 99%的核苷酸會在不同毒株的基因組序列之間表現(xiàn)出一致性，而導(dǎo)致差異存在的主要原因一般為大序列的缺失或者插入、易于發(fā)生基因重組的可變區(qū)、開放型閱讀框(Open reading frames, ORFs)內(nèi)重復(fù)單元差異(Variable number tandem repeat, VNTR)、單核苷酸突變等(童桂香等, 2004; Markset al, 2004)。有4種毒株已經(jīng)在GenBank上公布了基因組的全序列，分別是中國臺灣株(TW, AF440570) (307287 bp)、泰國株(TH, AF369029)(292967 bp)、中國株(CN,AF332093)(305107 bp)和韓國株(KR, JX515788)。具有最大基因組的 WSSV毒株 TH-96-Ⅱ(AY864666,312 kb)被視為祖先株(Balakrishnanet al, 2008)。

同已知毒株基因組序列的比較，可以研究某些基因片段(ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94和ORF125)的缺失情況以及 VNTR數(shù)目和單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)，這些方面均已被應(yīng)用到分子流行病學(xué)研究(Gudkovset al,2014; Dieuet al, 2004; Musthaqet al, 2006)。在 ORF75上有2種重復(fù)單元(Repeat units, RUs)，分別為45 bp和 102 bp；ORF94上有 1種 RU，大小為 54 bp；而存在于ORF125的1種RU有69 bp。根據(jù)之前報道的大多數(shù)流行病學(xué)研究，從這些 RUs的數(shù)量上的差異(Dieuet al, 2004、2010; Pradeepet al, 2008; Tanet al,2011; Shekaret al, 2012)，可以更好地解釋分子流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果。

本研究應(yīng)用2015年4～10月期間在山東、江蘇、天津、浙江、海南、廣東6省市采集到的57份WSSV陽性的樣本，通過特異性擴(kuò)增目的片段，比較不同地區(qū)、不同分離株之間在ORF14/15、ORF23/24上的缺失變異情況，以及 ORF75、ORF94和ORF125上的RU數(shù)目差異，以此了解我國WSSV在2015年的分子流行變異情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗樣本主要涉及中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)和日本對蝦(Penaeus japonicus)(表1)，所有樣本采集后置于–80℃冰箱保存。

表1 WSSV樣本采集信息及ORF75、ORF94和ORF125RU數(shù)目Tab.1 WSSV samples and repeat units (RUs) of ORF75, ORF94 and ORF125

1.2 實驗方法

1.2.1 WSSV核酸提取 從樣本中取鰓組織約30 mg，提取DNA[海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)]，保存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR檢測 按照GB/T 28630.2-2012白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第 2部分套式 PCR檢測法進(jìn)行DNA樣本檢測，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。1.2.3 PCR擴(kuò)增 將檢測呈陽性的DNA樣本通過特定的引物進(jìn)行擴(kuò)增，體系配置見表2，實驗過程中引物及反應(yīng)條件見表3(于洪濤, 2008; Dieuet al,2004、2010; Markset al, 2005; Tanget al, 2013;Wongteerasupayaet al, 2003)。

續(xù)表1

1.2.4 基因克隆及片段分析 PCR產(chǎn)物膠回收后用NanoDrop 2000檢測DNA濃度，通過pMD?18-T連接轉(zhuǎn)化，將連接成功菌液測序。ORF14/15和ORF23/24片段分別與TH-96-Ⅱ株和中國臺灣株(TW)比對(Dieuet al, 2004; Zwartet al, 2010)，分析序列缺失情況。ORF75、ORF94和ORF125測序結(jié)果分別與其相應(yīng)的 RU序列比對(Gudkovset al, 2014)。

表2 反應(yīng)體系及用量Tab.2 Reaction system and amount

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測結(jié)果

樣本核酸提取后，通過套式PCR檢測，除10份樣本在第二輪中呈現(xiàn)陽性目的條帶，47份樣本均在第一輪中出現(xiàn)陽性目的條帶。

2.2 擴(kuò)增結(jié)果

通過特定引物擴(kuò)增，在ORF14/15中，除1#、2#、3#、5#、6#、7#、8#、12#、21#、23#、25#、26#、27#、28#、29#、30#、31#、40#、52#、53#、54#和55#外，其余35份樣本均有目的條帶出現(xiàn)，檢出率為61.40%。13#、14#、15#、16#、17#、35#、36#和 37#樣本的條帶較之其他條帶略大，其中，山東利津3個樣本均未檢出條帶(圖1)。在ORF23/24擴(kuò)增中，共有14份樣本(9#、24#、32#、33#、34#、39#、40#、45#、46#、47#、48#、51#、56#和 57#)出現(xiàn)目的條帶(圖2)，檢出率為 24.56%。目的條帶之間的大小基本沒有差別。山東利津、昌邑、威海、江蘇贛榆、天津漢沽、寶坻和廣東廣州沒有目的條帶出現(xiàn)。而在ORF75中，共有 10 份樣本(4#、9#、32#、33#、34#、45#、46#、47#、48#和57#)檢出(圖3)，檢出率為17.54%，山東利津、昌邑威海、濰坊、天津漢沽、寶坻、海南海口和廣東廣州無樣本檢出。其中，57#山東濰坊的樣本在所有目的條帶中，片段最大。在 ORF94中，共有40份樣本檢出，檢出率為70.18%，其中，1#和3#的目的片段最小(圖4)。江蘇贛榆、天津?qū)氎婧蛷V東廣州無目的條帶出現(xiàn)。在ORF125，共有44份樣本檢出，檢出率為 77.19%，在所有地區(qū)的樣本中均有發(fā)現(xiàn)。僅有 1#、2#、19#、20#、21#、23#、24#、25#、27#、28#、29#、30#和31#樣本無相應(yīng)目的條帶出現(xiàn)(圖5)。

表3 PCR擴(kuò)增引物以及反應(yīng)條件Tab.3 PCR primers and reaction conditions

2.3 序列比對

在ORF14/15擴(kuò)增中，共擴(kuò)增3種不同的片段，分別為1270 bp(山東即墨)、1892 bp(山東即墨、濰坊、壽光、浙江舟山、江蘇贛榆、天津漢沽、北辰、寶坻、海南?？诤蛷V東廣州)、2075 bp(山東威海、昌邑)，通過與TH-96-Ⅱ比對，發(fā)現(xiàn)分別缺失6530、5908、5725 bp(圖6)。而在 ORF23/24中，所有樣本片段大小均為1140 bp，與臺灣株相比對，缺失12070 bp (圖7)。

在ORF75擴(kuò)增中，有3種片段大小出現(xiàn)，分別為1246 bp(江蘇贛榆、天津北辰)、985 bp(山東即墨、壽光、天津北辰和浙江舟山)和1738 bp(山東濰坊)，通過與重復(fù)片段比對，45 bp的重復(fù)片段數(shù)目分別為2、1、3，而 102 bp 的重復(fù)片段均為 1(表1)。在 ORF94擴(kuò)增中，共有 5種大小不一的片段出現(xiàn)，分別為523 bp(山東利津)、742 bp(山東即墨、威海)、769 bp(海南?？?、1024 bp(山東即墨、天津北辰)和1135 bp(山東濰坊、即墨、壽光、天津漢沽、浙江舟山)，經(jīng)比對，重復(fù)片段數(shù)目分別為4、5、5、10、12(表1)。在ORF125擴(kuò)增中，出現(xiàn) 5種不同的片段，分別為491 bp(山東利津、昌邑、浙江舟山)、518 bp(山東即墨)、703 bp(山東威海、海南?？凇⑻旖驖h沽、北辰)、722 bp(山東即墨、浙江舟山)、746 bp(山東昌邑、壽光、濰坊、天津北辰、寶坻、廣東廣州)，經(jīng)過比對，其重復(fù)片段的數(shù)目分別為3、3、5、5、6(表1)。

圖1 引物ORF14/15的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of primer ORF14/15

圖2 引物ORF23/24的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of primer ORF23/24

圖3 引物ORF75的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of primer ORF75

圖4 引物ORF94的擴(kuò)增Fig.4 Amplification of primer ORF94

3 討論

圖5 ORF125擴(kuò)增Fig.5 Amplification of primer ORF125

圖6 WSSV不同毒株ORF14/15區(qū)域的序列比對Fig.6 Scheme of deletion region of ORF14/15 in different WSSV strains

圖7 WSSV不同毒株ORF23/24區(qū)域的序列比對Fig.7 Scheme of deletion region of ORF23/24 in different WSSV strains

本研究所用樣本來自于山東利津、即墨、昌邑、壽光、威海、濰坊、江蘇贛榆、天津漢沽、北辰、寶坻、浙江舟山、海南?？诤蛷V東廣州，采集時間分布于2015年4～10月WSSV病害暴發(fā)期間。ORF14/15和ORF23/24的檢出率分別為61.40%和24.56%，大部分?jǐn)U增 ORF23/24成功的樣本在 ORF14/15中均有目的條帶出現(xiàn)，但除去 40#樣本(海南?？?，其僅在 ORF23/24擴(kuò)增中出現(xiàn)。ORF75、ORF94和ORF125的檢出率分別為17.54%、70.18%和77.19%，其中，2#(山東利津)、21#(山東即墨)、24#(山東即墨)和 25#(山東即墨)樣本在 3種擴(kuò)增中均無條帶出現(xiàn)，而 9#(山東即墨)、32#(浙江舟山)、33#(浙江舟山)、34#(山東壽光)、46#(天津北辰)、47#(天津北辰)、48#(天津北辰)和57#(山東濰坊)樣本卻在3種擴(kuò)增中均有條帶出現(xiàn)。在5次PCR擴(kuò)增中，9#(山東即墨)、32#(浙江舟山)、33#(浙江舟山)、34#(山東壽光)、46#(天津北辰)、47#(天津北辰)、48#(天津北辰)和57#(山東濰坊)樣本都出現(xiàn)目的條帶，而 2#(山東利津)、21#(山東即墨)和25#(山東即墨)樣本則在5次擴(kuò)增中均無擴(kuò)增出目的片段。

對于ORF14/15，TH-96-Ⅱ最為完整，為7800 bp。與TH-96-Ⅱ相比較，韓國株有5721 bp的缺失，泰國株缺失5316 bp，臺灣株缺失5138 bp，而中國株缺失5132 bp。本研究中出現(xiàn)3種缺失程度不一樣的片段，且相互之間差別較大，即其中2075 bp的片段與韓國株KR的缺失程度相近。6530 bp和5908 bp的2種缺失情況也出現(xiàn)在之前的研究中，而與 6530 bp相近的6533 bp和6540 bp的缺失情況分別在2013年和2014年的研究中出現(xiàn)(孫新穎等, 2016a、2016b)。在Tang等(2013)研究中也有相近程度的情況，即缺失 5950 bp，而印度的1株和墨西哥地區(qū)的3株WSSV毒株有更接近的缺失程度，4株分離株均缺失5892 bp。從現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，WSSV在ORF14/15上的缺失均在5000 bp以上，相較于完整的7800 bp，缺失程度較大，可能越短的DNA片段在復(fù)制中占據(jù)更多優(yōu)勢。

報道中的中國株ORF23/24片段缺失最小，僅為1169 bp；泰國株的缺失程度最大，為 13120 bp；而韓國株的缺失程度為中等，為5654 bp。Lan等(2002)發(fā)現(xiàn)，在中國廈門發(fā)現(xiàn)3種不同宿主感染的WSSV，相對中國株的 ORF23/24序列分別缺失 5717、5926和9319 bp。而Dieu等(2004)發(fā)現(xiàn)，在越南中部和南部采集的 3種不同的 WSSV分離株，相較于臺灣株分別缺少8539、11450和12166 bp。相較于其他地區(qū)或大或小的缺失情況，本研究中所有樣本在ORF23/24上缺失程度一致，均缺失12070 bp，屬于是大片段的缺失，這與2013年樣本研究中的缺失情況一致，而2014年樣本有2種缺失，即12064 bp和12070 bp，二者僅是在中間位置相差6個堿基(孫新穎等, 2016a、2016b)。ORF23/24的這種大片段缺失在普遍范圍上比較穩(wěn)定，結(jié)合ORF14/15較大的缺失情況，推測 WSSV的進(jìn)化可能通過逐漸穩(wěn)定的缺失和更小的基因組來完成，使得基因組更適合復(fù)制，以適應(yīng)環(huán)境且WSSV自身具有更強的毒性。

除了ORF75之外，ORF94和ORF125的檢出率都比較高。在是否檢出方面，不同地區(qū)樣本之間的RU數(shù)目差異比較大，即使是出自于同一地區(qū)的樣本之間也依然有差異，如山東即墨的樣本。ORF75中的45 bp的RUs數(shù)目為3以及102 bp的RUs數(shù)目為1的情況在之前2014年樣本研究中有出現(xiàn)，新出現(xiàn)了45 bp RU為1和2兩種類型；ORF94中RUs為4的情況在2013年和2014年樣本中均存在，而RUs為12只出現(xiàn)在2013年樣本中，且樣本中的RUs或為小數(shù)目重復(fù)，或為大數(shù)目重復(fù)，RUs為5和10兩種屬于新類型；ORF125的RUs數(shù)目與2014年樣本檢測中的數(shù)據(jù)部分一致(孫新穎等, 2016a、c)。Tang等(2013)研究中僅有1種ORF75的VNTR情況：共3個RU，2個45 bp RU和1個102 bp RU；Durán-Avelar等(2015)發(fā)現(xiàn)，ORF75總 RU有 5～20之間共 12種情況，而ORF94包含有13種數(shù)目不同的RU，ORF125則只有1種總RU數(shù)目為8的情況；此外，Sindhupriya等(2014)的實驗中，ORF94上有4、6、7、8和11五種不同的VNTR，而ORF125上有3種(4、5和6)不同的VNTR，部分 VNTR情況在不同研究中存在交叉情況。相較于 ORF14/15和 ORF23/24，ORF75、ORF94和ORF125VNTR的研究更多應(yīng)用于WSSV類型的歸劃(Durán-Avelaret al, 2015; Tanget al, 2013)，從而確定WSSV的地理歸屬，揭示W(wǎng)SSV分子流行情況。

2015年樣本在重復(fù)片段數(shù)目上的差異依然很大，ORF14/15上的缺失出現(xiàn)了新的片段，與韓國株極其相近，在ORF23/24上，雖然出現(xiàn)大片段缺失，卻表現(xiàn)出了缺失的穩(wěn)定性。而各個樣本在ORF75、ORF94和 ORF125上的 RU數(shù)目則出現(xiàn)差異性和部分穩(wěn)定性。因此，推測不同地區(qū) WSSV毒株為了更好復(fù)制遺傳以適應(yīng)環(huán)境，出現(xiàn)了適應(yīng)性的變異，同時本實驗也為系統(tǒng)的分子流行病的研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

Balakrishnan P, Malathi S, Iddya K,et al. Characterization of variable genomic regions of Indian white spot syndrome virus. Virology, 2008, 376(1): 24?30

Dieu BTM, Marks H, Siebenga JJ,et al. Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam. Journal of General Virology, 2004, 85(12): 3607?3618

Dieu BTM, Marks H, Zwart MP,et al. Evaluation of white spot syndrome virus variable DNA loci as molecular markers of virus spread at intermediate spatiotemporal scales. Journal of General Virology, 2010, 91(5): 1164?1172

Durán-Avelar MDJ, Pérez-Enríquez R, Zambrano-Zaragoza JF,et al. Genotyping WSSV isolates from northwestern Mexican shrimp farms affected by white spot disease outbreaks in 2010–2012. Diseases of Aquatic Organisms,2015, 114(1): 11?20

Gudkovs N, Murwantoko, Walker PJ. Stability of the WSSV ORF94 VNTR genotype maker during passage in marine shrimp, freshwater crayfish and freshwater prawns. Diseases of Aquatic Organisms, 2014, 111(3): 249?257

Hossain MS, Chakraborty A, Joseph B,et al. Detection of new hosts for white spot syndrome virus of shrimp using nested polymerase chain reaction. Aquaculture, 2001, 198(1?2):1–11

Karunasagar I, Otta SK, Karunasagar I. Histopathological and bacteriological study of white spot syndrome ofPenaeus monodonalong the west coast of India. Aquaculture, 1997,153(1?2): 9?13

Lan Y, Lu W, Xu X. Genomic instability of prawn white spot bacilliform virus (WSBV) and its association to virus virulence. Virus Research, 2002, 90(1?2): 269–274

Lightner DV. A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. Special publication of the World Aquaculture Society. LA, Baton Rouge, 1996, 305

Marks H, Goldbach RW, Vlak JM,et al. Genetic variation among isolates of white spot syndrome virus. Archives of Virology,2004, 149(4): 674?697

Marks H, van Duijse JJA, Zuidema D,et al. Fitness and virulence of an ancestral white spot syndrome virus isolate from shrimp. Virus Research, 2005, 110(1–2): 9?20

Mayo MA. A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV. Archives of Virology, 2002, 147(8): 1655–1663

Musthaq SS, Sudhakaran R, Ahmed VPI,et al. Variability in the tandem repetitive DNA sequences of white spot syndrome virus (WSSV) genome and suitability of VP28 gene to detect different isolates of WSSV from India. Aquaculture,2006, 256(1–4): 34–41

Nakano H, Koube H, Umezaea S,et al. Mass mortalities of cultured Kuruma shrimp,Penaeus japonicus, in Japan in 1993: Epizootiological survey and infection trials. Fish Pathology, 1994, 29(2): 135?139

Pradeep B, Shekar M, Gudkovs N,et al. Genotyping of white spot syndrome virus prevalent in shrimp farms of India.Diseases of Aquatic Organisms, 2008, 78(3): 189?198

Shekar M, Pradeep B, Karunasagar I. White spot syndrome virus:Genotype, epidemiology and evolutionary studies. Indian Journal of Virology, 2012, 23(2): 175?183

Sindhupriya M, Saravanan P, Otta SK,et al. White spot syndrome virus (WSSV) genome stability maintained over six passages through three different penaeid shrimp species.Diseases of Aquatic Organisms, 2014, 111(1): 23?29

Sun XY, Wan XY, Liu QH,et al. Deletion and variation sequence comparison of prawns WSSV from different parts of China in 2013. Journal of Fishery Sciences of China, 2016a, 23(3):693–703 [孫新穎, 萬曉媛, 劉慶慧, 等. 2013年中國典型對蝦養(yǎng)殖區(qū)白斑綜合征病毒流行株高變異區(qū)序列的分析比較. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2016a, 23(3): 693–703]

Sun XY, Liu QH, Wan XY,et al. Comparison of the missing sequences of ORF14/15 and ORF23/24 of WSSV from different regions of China in 2014. Progress in Fishery Sciences, 2016b, 37(4): 140–146 [孫新穎, 劉慶慧, 萬曉媛,等. 2014年中國不同地區(qū)對蝦白斑綜合征病毒ORF14/15和 ORF23/24缺失區(qū)序列比較. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2016b,37(4): 140–146]

Sun XY, Wan XY, Liu QH,et al. Sequence comparison of WSSV variable regions from different parts of China in 2014.Progress in Fishery Sciences, 2016c, 37(2): 127–133 [孫新穎, 萬曉媛, 劉慶慧, 等. 白斑綜合征病毒2014年中國毒株變異區(qū)的序列比較. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2016c, 37(2):127–133]

Tan YW, Shi ZL. Genotyping of white spot syndrome virus in Chinese cultured shrimp during 1998?1999. Virologica Sinica, 2011, 26(2): 123?130

Tang KFJ, Groumellec ML, Lightner DV. Novel, closely related,white spot syndrome virus (WSSV) genotypes from Madagascar, Mozambique and the Kingdom of Saudi Arabia.Diseases of Aquatic Organisms, 2013, 106(1): 1?6

Tong GX, Li XZ, Wei XX,et al. Comparative analysis of deletion region of white spot syndrome virus genome among isolates in Guangxi. Journal of Shanghai Ocean University,2004, 23(1): 8?13 [童桂香, 黎小正, 韋信賢, 等. 白斑綜合征病毒廣西株缺失區(qū)基因的比較分析. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2004, 23(1): 8?13]

Wongteerasupaya C, Pungchai P, Withyachumnarnkul B,et al.High variation in repetitive DNA fragment length for white spot syndrome virus (WSSV) isolates in Thailand. Diseases of Aquatic Organisms, 2003, 54(3): 253?257

Wongteerasupaya C, Vickers JE, Sriurairatana S,et al. A non-occluded, systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawnPenaeus monodon.Diseases of Aquatic Organisms, 1995, 21(1): 69?77

Yu HT. Analysis of sequence variability among white spot syndrome virus (WSSV) isolates within China. Master′s Thesis of Ocean University of China, 2008, 32?63 [于洪濤.中國境內(nèi)白斑綜合征病毒(WSSV)分離株的序列差異分析. 中國海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2008, 32?63]

Zwart MP, Dieu BTM, Hemerik L,et al. Evolutionary trajectory of white spot syndrome virus (WSSV) genome shrinkage during spread in Asia. PLoS One, 2010, 5(10): e13400