史曉麗 孟憲紅① 孔 杰 欒 生 羅 坤曹寶祥 曹家旺 陳寶龍

(1. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)是我國重要的土著海水養(yǎng)殖種類之一，近十幾年來，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)飽受病害困擾。在諸多病原中，白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是對對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)毒害最大的病毒之一(Lightner, 1996)，它所導致的疾病傳播快、破壞性強且防治困難，已經(jīng)給我國乃至全球的對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了極大危害，嚴重制約了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。國內(nèi)外學者展開了大量的研究工作，如消除傳染源、切斷傳播途徑、控制水質(zhì)量、提高對蝦抵抗力等，以降低其危害，但效果不顯著(Yanget al, 2001; Heet al, 2012; Yangetal, 2012; 曹家旺等,2017)。研究對蝦對病原感染的免疫應答機制，可以為有效地進行對蝦的病害防治提供重要的理論指導。

果糖 1,6-二磷酸醛縮酶(Fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA)(EC 4.1.2.13)是糖酵解和糖異生過程中的一種關(guān)鍵酶，它普遍存在于動植物及微生物體內(nèi)。到目前為止，醛縮酶已在多個物種，尤其是細菌和脊椎動物中得到了廣泛研究，研究重點在其結(jié)構(gòu)、動力學參數(shù)、酶活特性和治療中的潛在功能(Giegéet al,2003; Lorentzenet al, 2004; Rodakietal, 2006; Dawsonet al, 2013)。哺乳動物醛縮酶通過與控制肌動蛋白聚合的WASP/Arp2/3復合物相互作用，從而在細胞內(nèi)吞中起作用，最終影響了細胞增殖(Lewet al, 2012、2013)。尤其引人注意的是，醛縮酶基因的干擾可以抑制細胞增殖，單核酸突變也可以降低酶活并抑制脊椎動物的生長(Van den Berghe, 1994; Haakeet al,1999)。最新研究表明，醛縮酶還在控制 RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄中起作用(Cie?laet al, 2014)。而在水產(chǎn)動物中，該基因相關(guān)的研究報道則較少，僅在電鰻(Electrophorus electricus)、文蛤(Meretrixmeretrix)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、紅耳龜(Trachemys scripta)等少數(shù)物種中，有部分酶活分析和 SNP研究(De-Simoneet al, 2006; Wanget al, 2012; 曹婷婷等, 2012;李璽洋等, 2012; Dawsonet al, 2013)。

在中國明對蝦感染 WSSV后的表達譜芯片研究中，我們發(fā)現(xiàn)醛縮酶基因出現(xiàn)了顯著差異表達。此外，該基因內(nèi)部出現(xiàn)了與抗病性狀呈顯著關(guān)聯(lián)的 SNP位點。因此，本研究采用RACE技術(shù)克隆中國明對蝦的醛縮酶基因(以下稱FcFBA基因)，研究其在感染W(wǎng)SSV后的時空表達特點，并進一步利用基因干擾技術(shù)初步分析其在對蝦染病后的表達特點，以期為中國明對蝦抗WSSV育種提供理論依據(jù)和實踐材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中國明對蝦實驗群體取自中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所遺傳育種中心，對蝦大小均勻，體重為(1.01±0.21) g。實驗前，暫養(yǎng)1周。實驗用水為砂濾后海水，養(yǎng)殖期間的水溫為 24.8℃～25.4℃，鹽度為28，持續(xù)充氧，每天換水，并投喂配合飼料。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

使用 Trizol法提取中國明對蝦肝胰腺組織的總RNA，具體操作方法參照說明書(Invitrogen, 美國)。采用紫外分光光度計與瓊脂糖凝膠電泳，檢測所提取 RNA的質(zhì)量及完整性。利用 SMARTTMRACE Amplification Kit(Clontech, 美國)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。

1.3 FcFBA基因全長cDNA的克隆及測序

根據(jù)本實驗室的中國明對蝦 454轉(zhuǎn)錄組測序獲得的醛縮酶基因的部分 EST序列，使用 Primer Premier 5.0軟件設計 5′ RACE和 3′ RACE 引物(表1)，利用AD酶，分別進行RACE擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用膠回收試劑盒回收目的片段，連接到pMD18-T simple載體上，轉(zhuǎn)化入Top 10感受態(tài)細胞。使用 M13引物(表1)對克隆進行菌落PCR鑒定，陽性克隆經(jīng)確定后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 基因生物信息學分析

通過 NCBI網(wǎng)站上的 BLASTX對測序結(jié)果進行序列同源性比對分析，利用DNASTAR軟件進行全長序列拼接，在線生物學軟件ExPASy對全長序列編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析，使用MEGA 5.0軟件的鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 引物序列及信息Tab.1 Primer sequences in RACE, qRT-PCR and RNAi

1.5 人工WSSV感染實驗

實驗前隨機挑選暫養(yǎng)的健康中國明對蝦180尾，平均分為2組(WSSV感染組和對照組)，每組3個平行。WSSV感染組，從第 5腹節(jié)處注射病毒含量為103copies/μl的病毒懸液 10 μl，各組分別在實驗開始后的0、6、12、24、48 h，取鰓、肝胰腺和肌肉組織，每個時間點各取3尾存于液氮中，用于后續(xù)RNA的提取及熒光定量驗證。

1.6 FcFBA dsRNA的合成

以中國明對蝦肝胰腺cDNA為模板，用正向引物RNAi F和反向引物RNAi R，PCR擴增FcFBA基因的cDNA片段。采用rTaq酶進行擴增，PCR擴增體系為 20 μl，包括模板 2 μl，正反向引物(10 μmol/L 各1 μl，PCR Buffer 2 μl，dNTP (2.5 mmol/L each)1.6 μl。PCR程序為95℃預變性5 min，1個循環(huán)；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，1個循環(huán)。PCR結(jié)束后，采用膠回收試劑盒進行純化。由此，獲得FcFBAdsRNA的體外轉(zhuǎn)錄模板。采用in vitroTranscription T7 Kit進行體外轉(zhuǎn)錄，實驗方法參見(for siRNA Synthesis)說明書(TaKaRa, 日本)。

1.7 dsRNA干擾

設置dsRNA實驗組和PBS對照組，每組30尾對蝦，2個平行。注射前，取3尾蝦作為空白對照。對照組每尾對蝦從第5腹節(jié)處注射10 μl的PBS，實驗組每尾對蝦從第5腹節(jié)處注射10 μl的dsRNA (100 ng/μl)，注射后的6、12、24、48和72 h分別取肝胰腺組織用于RNA提取，以進行后續(xù)的基因表達分析。在干擾后的24 h，2組分別再注射10 μl 103copies/μl的WSSV病毒懸液，統(tǒng)計2組的死亡率。

1.8 基因的時空表達分析

以18S rRNA作為real-time PCR反應的內(nèi)參基因，采用TaKaRa的熒光定量PCR試劑盒對基因進行熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測。所用儀器為ABI 7500型熒光定量PCR儀，各個基因引物序列見表1。20 μl反應體系包含：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，正向和反向引物各1 μl (2 μmol/L)，稀釋后的cDNA模板1 μl (1∶10稀釋)，循環(huán)參數(shù)參照說明書。實驗重復3次，以平均值進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。根據(jù)2???Ct方法計算出每個基因的相對表達量，所得數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，比較均值的差異顯著性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FcFBA基因cDNA全長序列的克隆

根據(jù)實驗室前期獲得的醛縮酶基因部分 EST序列設計RACE引物，獲得5′RACE片段和3′RACE片段，長度分別為594 bp和1366 bp，拼接后得到全長cDNA序列。FcFBAcDNA序列全長為2496 bp，其中，ORF為1098 bp，編碼365個氨基酸(GenBank No.KJ686589)，含有5個保守的氨基酸位點，包括Lys231。該蛋白預測的理論等電點為6.6，分子量為39.8 kDa。序列中的 5′ UTR長79 bp，3′ UTR長1319 bp，終止密碼子為TAA(圖1)。

2.2 FcFBA蛋白系統(tǒng)進化分析

氨基酸序列比對表明，F(xiàn)cFBA的蛋白序列與節(jié)肢動物的相似度最高，如與鹵蟲(Artemia franciscana)、家蠶(Bombyx mori)、沙漠蝗(Schistocerca gregaria)的相似度分別是86%、79%和78%，而與小鼠(Mus musculus)醛縮酶的A型、C型、B型的相似度分別是68%、66%和62%。系統(tǒng)進化分析表明，包括中國明對蝦在內(nèi)的節(jié)肢動物的醛縮酶自成一類，然后再和高等動物的聚為一類(圖2)。

2.3 FcFBA基因的組織表達分析

FcFBA基因在中國明對蝦各組織中的相對表達量分析結(jié)果顯示，該基因在鰓、肝胰腺、肌肉中均有表達。其中，肌肉中的表達量最高，鰓中次之，肝胰腺中的表達量最少(圖3A)。

FcFBA基因在感染W(wǎng)SSV的對蝦不同組織中的相對表達量變化結(jié)果顯示(圖3)，與對照組相比，F(xiàn)cFBA基因在肝胰腺中，表現(xiàn)為先上調(diào)后下降再上調(diào)的趨勢，在6 h和48 h顯著上調(diào)，分別是對照組的20.7和14.7倍(P＜0.05)；鰓中，表現(xiàn)為先下調(diào)后上升的趨勢，在6 h達到最低，為對照組的0.31倍，在12 h達到最高，為對照組的2.15倍，但差異均不顯著；肌肉中，表現(xiàn)為先上調(diào)后再下降的趨勢，6 h達到最高，為對照組的 2.88倍(P＜0.05)，12 h和 24 h均高于對照組，但無顯著性差異(P＞0.05)。

2.4 FcFBA基因在RNAi后的表達變化

對蝦肝胰腺FcFBA基因在干擾后的相對表達量結(jié)果顯示，與對照組相比，干擾組FcFBA基因的表達量表現(xiàn)出先上調(diào)再下調(diào)的趨勢，感染后6 h干擾組FcFBA表達為對照組1.8倍(P＞0.05)，24 h干擾組的表達量達到最低，為對照組的 0.28倍(P＜0.05)(圖4A)。

圖1 FcFBA cDNA全長序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of the FcFBA gene

2.5 干擾后對蝦感染W(wǎng)SSV的死亡率

dsRNA干擾組和PBS對照組在干擾以后24 h再進行WSSV病毒感染實驗，共持續(xù)9 d。感染后的死亡結(jié)果顯示，各組累計死亡率均為100% (圖4B)。對照組中，在感染后48 h開始出現(xiàn)死亡個體。干擾組中，感染后24 h出現(xiàn)1尾死亡對蝦，但沒有表現(xiàn)出白斑癥狀，推測原因是注射后由于對蝦自身的抵抗力弱而導致的死亡。從感染后42 h開始，2組出現(xiàn)的死亡個體都具有明顯的白斑癥狀。

3 討論

本研究是醛縮酶在對蝦中的首次系統(tǒng)研究，克隆的FcFBA基因ORF全長為1098 bp，編碼365個氨基酸。序列分析表明，其含有醛縮酶的保守功能位點，包含Ⅰ型醛縮酶的功能位點Lys231。氨基酸的進化分析表明，該醛縮酶基因與其他節(jié)肢動物的醛縮酶基因明顯聚為一類。ORF序列分析、蛋白保守位點分析及蛋白的系統(tǒng)進化分析均表明，F(xiàn)cFBA基因與其他物種的醛縮酶具有較高的相似性，因此，確定本研究克隆的FcFBA基因為中國明對蝦的醛縮酶基因。

自然界中存在2種不同機制的醛縮酶：Ⅰ型和Ⅱ型，前者存在于高等真核生物尤其是動物和高等植物中，它們能在底物的羰基和自身活性部位的賴氨酸之間形成一個西弗堿中間物(Schnarrenberger, 1990)；后者則存在于真核綠藻、真菌以及原核細菌中，催化裂合反應的時候需要一個二價的過渡態(tài)金屬離子如Zn2+(Rutter, 1964)。脊椎動物中，Ⅰ型醛縮酶分為3種組織特異性的同工酶：A型、B型和C型。A型在肌肉中表達，B型在肝臟、腎臟、胃及腸道中表達，而C型則在腦、心臟及卵巢中表達(余南等, 2005)。這些同工酶有不同的催化功能：3種同工酶都參與糖酵解，B型相對于A型和C型來說，又參與糖異生。在本研究中，F(xiàn)cFBA基因在肌肉中的表達量最高，暗示中國明對蝦的醛縮酶是A型醛縮酶。

圖2 FcFBA的氨基酸序列比對(A)及系統(tǒng)進化分析(B)Fig.2 The analysis of amino acid sequence (A) and phylogenetic tree analysis (B) of FcFBA from various species

圖3 FcFBA mRNA的組織表達Fig.3 The expression profiles of FcFBA mRNA in hepatopancreas, gill and muscle

圖4 dsRNA注射后的死亡率及干擾后FcFBA基因的表達Fig.4 The mortality of shrimp after dsRNA injection and the FcFBA expression after RNAi

本研究還分析了對蝦在感染 WSSV后該基因的表達趨勢。結(jié)果顯示，肝胰腺和肌肉中該基因出現(xiàn)了明顯的上調(diào)表達，其中，肝胰腺對 WSSV感染最敏感，說明 WSSV對該基因是一個明顯的刺激，這和已有的研究報道結(jié)果一致。有學者在中國明對蝦感染W(wǎng)SSV后獲得的差異表達基因中，發(fā)現(xiàn)了醛縮酶基因的表達量在感染后的6 h提高了100多倍(Wanget al,2006)，凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)在感染W(wǎng)SSV后，醛縮酶基因的表達在6 h和36 h顯著上調(diào)，在感染后12 h則下調(diào)(Wanget al, 2007)。以上結(jié)果表明，該基因與對蝦抗 WSSV有關(guān)，在對蝦抗病中起作用，為對蝦抗病相關(guān)基因。

已有研究顯示，利用dsRNA干擾對任何一個基因產(chǎn)生的敲降作用為正常基因表達水平的 10%～40%(Collinset al, 2005)。據(jù)報道，目的基因dsRNA的注射量在一定范圍內(nèi)與干擾效率呈正相關(guān)，一旦超出這一范圍，干擾效果將不再增加，可能原因是目標基因mRNA結(jié)合的siRNA已達到飽和。Robalino等(2004)將體外轉(zhuǎn)錄獲得的WSSV的外殼蛋白VP19的編碼基因的dsRNA導入凡納濱對蝦體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)不同劑量的dsRNA抑制病毒的效率有很大的差別。注射10 μg特異dsRNA時，對蝦的保護率是81%；注射1 μg時，保護率是72%，而注射0.1 μg保護率僅為29%。此外，不同物種dsRNA的有效注射量是不同的，如蜜蜂中dsRNA的注射量為每克軟體重50 μg，對蝦的注射量為 15 μg (Robalinoet al, 2004)；太平洋牡礪(Crassostrea gigas)以每克軟體重注射 20 μg dsRNA時，產(chǎn)生的干擾效率為80%，而當每克軟體重注射量為 4～5 μg 時，干擾效率為 14%(Fabiouxet al, 2009)。在對蝦基因干擾的研究中，很多學者采用1 μg/g的劑量進行注射，取得了較好的結(jié)果。本研究通過前期對不同干擾計量的摸索發(fā)現(xiàn)，注射 dsRNA的濃度為100 ng/μl時(按照體重估算是 1 μg/g)，干擾效果最好(未發(fā)表數(shù)據(jù))。研究人員發(fā)現(xiàn)，長dsRNA引起靶基因的沉默效率要高于短 dsRNA，一般情況下，體外合成 dsRNA的長度不小于 300 bp (Robalinoet al,2004)，無脊椎動物對長 dsRNA的吸收率高于短dsRNA，因此，本研究設計的dsRNA為600 bp左右，符合基因干擾實驗對長度的要求。與 PBS對照組相比，醛縮酶基因在干擾以后表達量隨時間下降，尤其是在干擾后 24 h，dsRNA注射組的基因表達量顯著低于對照組，說明干擾成功。同時，通過干擾后對蝦的死亡率比較，發(fā)現(xiàn)干擾對蝦在 WSSV感染后，明顯提高了死亡速度。

本研究首次在中國明對蝦中獲得了醛縮酶基因的全長cDNA序列，分析了WSSV感染后，該基因在不同組織中的表達特征，并進一步通過基因干擾結(jié)果分析，推斷該基因可能在對蝦抗病中起作用，但其在病毒感染后的作用機制仍需要進一步研究。

Cao JW, Kong J, Luo K,et al. Immune priming response induced by heat-inactivated WSSV onFenneropenaeus chinensisat different temperature. Progerss in Fishery Sciences,2017, 38(2): 128–136 [曹家旺, 孔杰, 羅坤, 等. 熱滅活WSSV誘導的中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)在不同溫度下的免疫致敏反應. 漁業(yè)科學進展, 2017, 38(2):128–136]

Cao TT, Bai JJ, Yu LY,et al. Polymorohisms of SNPs in ALDO B gene and association analysis with growth traits in grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Journal of Fisheries of China, 2012, 36(4): 481–488 [曹婷婷, 白俊杰, 于凌云,等. 草魚醛縮酶B基因部分序列的SNP多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析. 水產(chǎn)學報, 2012, 36(4): 481–488]

Cie?la M, Mierzejewska J, Adamczyk M,et al. Fructose bisphosphate aldolase is involved in the control of RNA polymerase Ⅲ-directed transcription. Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1843(6): 1103–1110

Collins RE, Cheng XD. Structural domains in RNAi. FEBS Letters, 2005, 579(26): 5841–5849

Dawson NJ, Biggar KK, Storey KB. Characterization of fructose-1,6-bisphosphate aldolase during anoxia in the tolerant turtle,Trachemys scriptaelegans: An assessment of enzyme activity,expression and structure. PLoS One, 2013, 8(7): e68830

De-Simone SG, de Salles CM, Batista e Silva CM,et al.Purification and amino acid sequence of fructose-1,6-bisphosphate aldolase from the electric organ ofElectrophorus electricus(L.). Zeitschrift fur Naturforschung C, 2006, 61(11–12): 884–888

Fabioux C, Corporeau C, Quillien V,et al.In vivoRNA interference in oyster-vasasilencing inhibits germ cell development. FEBS Journal, 2009, 276(9): 2566–2573

Giegé P, Heazlewood JL, Roessner-Tunali U,et al. Enzymes of glycolysis are functionally associated with the mitochondrion in Arabidopsis cells. Plant Cell, 2003, 15(9): 2140–2151

Haake V, Geiger M, Walch-Liu P,et al. Changes in aldolase activity in wild-type potato plants are important for acclimation to growth irradiance and carbon dioxide concentration,because plastid aldolase exerts control over the ambient rate of photosynthesis across a range of growth conditions. Plant Journal, 1999, 17(5): 479–489

He YD, Zhang XB. Comprehensive characterization of viral miRNAs involved in white spot syndrome virus (WSSV)infection. RNA Biology, 2012, 9(7): 1019–1029

Lew CR, Tolan DR. Aldolase sequesters WASP and affects WASP/Arp2/3-stimulated actin dynamics. Journal of Cellular Biochemistry, 2013, 114(8): 1928–1939

Lew CR, Tolan DR. Targeting of several glycolytic enzymes using RNA interference reveals aldolase affects cancer cell proliferation through a non-glycolytic mechanism. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(51): 42554–42563

Li XY, Bai JJ, Yu LY,et al. Association analysis between mutation of aldolase A 3′-UTR and growth traits inCtenopharyngodon idella. Freshwater Fisheries, 20012, 42(5): 13–16 [李璽洋,白俊杰, 于凌云, 等. 草魚醛縮酶A3′-UTR突變與生長性狀相關(guān)研究. 淡水漁業(yè), 20012, 42(5): 13–16]

Lightner DV. Epizootiology, distribution and the impact on international trade of two penaeid shrimp viruses in the Americas. Revue Scientifique et Technique, 1996, 15(2):579–601

Lorentzen E, Siebers B, Hensel R,et al. Structure, function and evolution of the Archaeal class I fructose-1,6-bisphosphate aldolase. Biochemical Society Transactions, 2004, 32(2):259–263

Robalino J, Browdy CL, Prior S,et al. Induction of antiviral immunity by double-stranded RNA in a marine invertebrate.Journal of Virology, 2004, 78(19): 10442–10448

Rodaki A, Young T, Brown AJP. Effects of depleting the essential central metabolic enzyme fructose-1,6-bisphosphate aldolase on the growth and viability ofCandida albicans:Implications for antifungal drug target discovery. Eukaryotic Cell, 2006, 5(8): 1371–1377

Rutter WJ. Evolution of aldolase. Federation Proceedings, 1964,23: 1248–1257

Schnarrenberger C. Characterization and compartmentation, in green leaves, of hexokinases with different specificities for glucose, fructose, and mannose and for nucleoside triphosphates.Planta, 1990, 181(2): 249–255

Van den Berghe G. Inborn errors of fructose metabolism. Annual Review of Nutrition, 1994, 14: 41–58

Wang B, Li FH, Dong B,et al. Discovery of the genes in response to white spot syndrome virus (WSSV) infection inFenneropenaeus chinensisthrough cDNA microarray.Marine Biotechnology, 2006, 8(5): 491–500

Wang C, Wang HX, Li Y,et al. Identification of a fructose-1,6-bisphosphate aldolase gene and association of the single nucleotide polymorphisms with growth traits in the clamMeretrixmeretrix. Molecular Biology Reports, 2012, 39(4):5017–5024

Wang HC, Wang HC, Leu JH,et al. Protein expression profiling of the shrimp cellular response to white spot syndrome virus infection. Developmental & Comparative Immunology,2007, 31(7): 672–686

Yang F, He J, Lin XH,et al. Complete genome sequence of the shrimp white spot bacilliform virus. Journal of Virology,2001, 75(23): 11811–11820

Yang JY, Chang CI, Liu KF,et al. Viral resistance and immune responses of the shrimpLitopenaeus vannameivaccinated by two WSSV structural proteins. Immunology Letters, 2012,148(1): 41–48

Yu N, He A, Li ZY,et al. Characterization and analysis ofToxoplasma gondiialdolase gene and intron. Chinese Journal of Zoonoses, 2005, 21(7): 580–583 [余南, 何藹, 李卓雅,等. 剛地弓形蟲醛縮酶基因及其內(nèi)含子的分析. 中國人獸共患病雜志, 2005, 21(7): 580–583]