余秋鋒

隨著人類輔助生殖技術的發(fā)展，玻璃化凍融胚胎移植在提高患者累積妊娠率的同時還能預防重度卵巢過度刺激綜合征（OHSS）的發(fā)生，有效提升生殖助孕質(zhì)量[1，2]，然而凍融胚胎的移植結局與女方年齡、子宮內(nèi)膜容受性、解凍復蘇后胚胎質(zhì)量等息息相關[3，4]。根據(jù)凍融胚胎體外培養(yǎng)時間的長短不同，可觀察提前半天解凍后移植與當天解凍當天移植的優(yōu)劣，同時觀察提前半天解凍胚胎生長發(fā)育情況是否能有效預測妊娠結局。本研究回顧性分析我中心2015年1月～2017年7月562個卵裂期胚胎凍融移植周期，探討培養(yǎng)時間長短對胚胎復蘇后妊娠結局的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析我中心2015年1月～2017年7月562個卵裂期FET周期，女方平均年齡（33.86±5.19）歲，平均子宮內(nèi)膜厚度（9.68±1.95） mm，平均移植胚胎（2.13±0.33）枚。均符合以下標準：均為第一個凍融移植周期且移植胚胎數(shù)≥2；不孕因素包括女方盆腔輸卵管排卵障礙等，男方少、弱、畸精、無精癥等；排除新鮮胚胎和凍融胚胎一起移植或卵裂胚和囊胚分步移植的患者及女方子宮內(nèi)膜異位癥、宮腔積液、粘連等影響著床的因素。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎冷凍解凍 ①冷凍標準：參照以前本中心裂期評分標準[5]并結合目前實際作修改：其中7～9細胞，Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎，4細胞以上，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級胚胎為可用胚胎，結合患者意愿選擇性將D3天4～6細胞Ⅰ、Ⅱ級胚胎及6細胞以上Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級胚胎用于冷凍或部分冷凍后養(yǎng)囊胚。②冷凍過程：使用冷凍液（Vitrolife，瑞典），按使用說明書結合本中心實際冷凍卵裂胚，卵裂胚冷凍在37℃于1號液中放置5～10min，轉移至2號液放置2min后轉移至3號液并于30s內(nèi)裝入載桿并投入液氮中。③解凍過程：使用解凍液（Vitrolife，瑞典），按使用說明書結合本中心實際解凍卵裂胚或囊胚。卵裂胚解凍在37℃條件下迅速放入1號液，30s內(nèi)迅速轉移至2號液1min，然后轉移至3號液2min，再轉入4號液5min，最后轉移至預先平衡好的囊胚培養(yǎng)皿于倒置顯微鏡下觀察復蘇后胚胎的存活情況，有一半以上卵裂球存活者視為復蘇存活并可用于移植。

1.2.2 分組 按體外培養(yǎng)時間不同分為提前解凍組（A組，n=478）和當日解凍組（B組，n=84）。提前解凍組為移植前一天下午解凍，培養(yǎng)18～20h后移植；當日解凍組為當日解凍后培養(yǎng)2～4h后移植。根據(jù)解凍后卵裂球增殖與否將A組分為3組：A1組（n=321）均增殖，A2組（n=131）部分增殖，A3組（n=26）不增殖；再根據(jù)卵裂球增殖數(shù)目將有增殖胚胎周期分為Aa組（n=184）至少有一個融合胚胎，Ab組（n=268）無融合胚胎。

1.2.3 內(nèi)膜準備方案及移植 包括自然周期、人工周期和促排周期。自然周期適用于月經(jīng)規(guī)律、有排卵的患者，于月經(jīng)周期的第8～10天來生殖中心行B超監(jiān)測，主導卵泡直徑14mm時開始每日或隔日行B超檢查并監(jiān)測LH峰，排卵后2～4d或LH峰出現(xiàn)后4～5d進行卵裂期胚胎移植；月經(jīng)不規(guī)律或自然周期內(nèi)膜生長不理想者采用人工周期準備內(nèi)膜，即于月經(jīng)第2～5 天補佳樂 2～6mg/d，第 6～9 天 4～8mg/d，第10～13天6～10mg/d，B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜生長情況并據(jù)此適當調(diào)整補佳樂劑量。也可在前一周期黃體中期給予GnRH-a，補佳樂也可采用恒量方案。當內(nèi)膜≥7mm時，肌注黃體酮40～60mg/d或陰道用黃體酮轉化內(nèi)膜，于使用黃體酮第4～5天進行卵裂期胚胎移植；促排周期適用于月經(jīng)不規(guī)律或者前兩種方案無效者，應用FSH/HMG，主導卵泡直徑達14～15mm時開始每日或隔日行B超檢查并監(jiān)測LH峰，排卵后2～4d或LH峰（卵泡發(fā)育到18mm時，未測出LH峰，注射HCG 5 000～10 000IU）出現(xiàn)后4～5d進行卵裂期胚胎移植。

1.3 妊娠結局 移植后第14天回生殖中心抽血檢查HCG，驗血陽性者14d后再回中心行B超檢查確定是否臨床妊娠，并計算臨床妊娠率、胚胎種植率及多胎率。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料 共有562個移植周期，共解凍胚胎1 249枚，胚胎存活率95.32﹪。各組間患者內(nèi)膜準備方案無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表1；患者平均年齡、平均子宮內(nèi)膜厚度、平均移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表2～4。

2.2 解凍后不同培養(yǎng)時間對妊娠結局的影響 過夜培養(yǎng)后，A組478個周期，臨床妊娠率47.28﹪，種植率28.29﹪，多胎率26.99﹪；B組84個周期，臨床妊娠率51.19﹪，種植率30.68﹪，多胎率25.58﹪。兩組臨床妊娠率、種植率和多胎率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表2。

2.3 胚胎過夜培養(yǎng)后增殖與否對妊娠結局的影響過夜培養(yǎng)后，A1組321個周期全部有增殖，臨床妊娠率 50.47﹪，種植率 30.92﹪，多胎率 28.40﹪；A2組131個周期部分增殖，臨床妊娠率38.93﹪，種植率 20.90﹪，多胎率 17.65﹪；A3組 26個周期均不增殖，臨床妊娠率50.0﹪，種植率34.55﹪，多胎率46.15﹪。A1組臨床妊娠率、種植率均高于A2組，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），A1、A2組多胎率無明顯差異（P＞0.05）；A3組種植率、多胎率高于A2組，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；A1組與A3組各指標無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表3。

2.4 過夜培養(yǎng)后是否存在融合胚胎對妊娠結局的影響 Aa組184個周期均有1個以上融合胚胎形成，Ab組則無融合胚胎形成。Aa組臨床妊娠率（59.78﹪）、種植率（37.95﹪）極顯著高于Ab組臨床妊娠率（38.43﹪）、種植率（21.12﹪），P=0.00，同時Aa組多胎率亦高于 Ab組（P＜0.05），見表4。

表1 患者內(nèi)膜準備方案

表2 不同解凍時間妊娠結局比較

表3 過夜培養(yǎng)胚胎增殖與否對妊娠結局的影響比較

表4 有無融合胚胎對妊娠結局的影響

3 討論

隨著胚胎冷凍保存技術尤其是玻璃化冷凍技術的日益完善，解凍胚胎移植周期的臨床妊娠率逐漸提高，甚至超過新鮮周期移植的臨床妊娠率[6，7]，加上部分促排卵方案的應用，如黃體期促排等及高齡患者累積胚胎的需要使得冷凍胚胎復蘇后移植在各中心所占比例有增高趨勢。

本研究比較了移植前一天下午解凍及移植當天解凍胚胎的妊娠結局，結果兩者臨床妊娠率（47.28﹪ vs 51.19﹪），胚胎種植率（28.29﹪ vs 30.68﹪），多胎率（26.99﹪ vs 25.58﹪）均無明顯差異（P＞0.05）。這與相關研究[8～10]結果基本一致；而柴三明等[11]通過研究發(fā)現(xiàn)當天培養(yǎng)組臨床妊娠率和種植率均低于過夜培養(yǎng)組；Rato等[12]則得出相反結論；本研究中雖然當天解凍組臨床妊娠率和種植率略有增高，但并無統(tǒng)計學差異。分析主要原因可能為當天解凍胚胎大部分為7～9細胞，Ⅰ～Ⅱ級優(yōu)質(zhì)胚胎，而提前解凍胚胎則優(yōu)胚和可用胚胎參差不齊，或者入選標準、冷凍方法及對移植時期選擇不同所致。

對于解凍后過夜培養(yǎng)妊娠結局，本研究顯示解凍后全部胚胎有增殖組其臨床妊娠率及種植率均明顯高于部分增殖組，而不增殖組臨床妊娠率、種植率及多胎率亦明顯高于部分增殖組且與全部增殖組各指標無明顯差異，這與相關研究[9,13]不盡一致。全部胚胎增殖組能進一步預測胚胎發(fā)育潛能及妊娠結局方面一致，主要不同體現(xiàn)在無增殖組，Laverge等[14]通過對復蘇后無生長的胚胎進行熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)這類胚胎僅有20﹪左右表現(xiàn)為正常的二倍體，其余表現(xiàn)為染色體異常，據(jù)此認為復蘇后未進一步生長的胚胎基本無利用價值，而本研究中復蘇后未增殖的胚胎在臨床妊娠率及種植率方面與此理論完全不符，其甚至高于部分增殖組，分析可能原因為入組數(shù)據(jù)太少造成誤差，或者胚胎生長情況被觀察員忽略而誤判為未生長，當然本研究若進一步追蹤這部分患者的持續(xù)妊娠情況及活產(chǎn)分娩情況或許更能說明具體情況。但也從一個側面提示對過夜不增殖胚胎是否移植應該持慎重態(tài)度，至少可以考慮進一步培養(yǎng)囊胚以避免不必要的損失。

對于過夜后增殖中含有融合胚胎與否的妊娠結局研究提示含有融合胚胎組妊娠率、種植率及多胎率均顯著高于無融合胚胎組，與惠董娜等[15]的研究結果基本一致。可能這類胚胎已經(jīng)打破了發(fā)育阻滯障礙，促進了基因調(diào)控由母型調(diào)節(jié)向胚胎型調(diào)節(jié)的轉化，對囊胚腔的形成、內(nèi)細胞團及胚層分化發(fā)揮著積極作用，預示著更好的臨床結局[16，17]。但多胎率的增高是臨床工作者需高度重視的問題，對這部分患者或者應該建議其行單胚胎移植。

綜上所述，胚胎解凍時間對妊娠結局影響不明顯，各中心可根據(jù)實際情況安排工作。解凍后過夜培養(yǎng)觀察胚胎進一步發(fā)育情況，有全部增殖尤其含融合胚胎的周期預示著更好的妊娠結局，但同時應警惕過高的多胎率，必要時可根據(jù)實際情況行單胚胎移植。同時對于均無增殖的周期也應持謹慎態(tài)度，可行直接移植或者繼續(xù)培養(yǎng)以避免不必要的損失。當然，這一結論需要更多數(shù)據(jù)及更進一步的實驗設計支持。

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