蔣麗 李輝 張桂英 穆儀冰 劉海濤

胃癌在我國發(fā)病率較高，隨著診治技術(shù)的提高預(yù)后大為改善，但晚期患者仍缺乏有效治療手段。自體細(xì)胞免疫治療作為腫瘤重要的輔助療法成為新的關(guān)注點(diǎn)[1～3]，包括樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokine induced killer cells，CIK）[4]，可打破機(jī)體免疫耐受、誘導(dǎo)凋亡、殺傷殘余腫瘤細(xì)胞，延長生存期。但當(dāng)前面臨的問題是腫瘤患者體內(nèi)DC功能不全，無法有效提呈抗原及誘導(dǎo)后續(xù)免疫反應(yīng)；且大部分腫瘤缺乏特異性及穩(wěn)定性好的抗原來刺激DC分化成熟，導(dǎo)致抗腫瘤治療收效甚微[5]。本實(shí)驗(yàn)擬通過聚乙二醇（PEG）法制備DC-自體胃癌細(xì)胞融合疫苗[6]，刺激DC分化及實(shí)現(xiàn)其對胃癌細(xì)胞抗原的全部提呈，采用分組對比，將融合疫苗、DC和胃癌細(xì)胞分別與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后觀察CIK細(xì)胞亞群表達(dá)率、混合培養(yǎng)細(xì)胞對胃癌細(xì)胞凋亡的影響及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討DC融合疫苗-CIK細(xì)胞的離體抗腫瘤效應(yīng)及可能機(jī)制，為臨床開展晚期胃癌自體細(xì)胞免疫治療提供新的思路和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 人外周血淋巴細(xì)胞分離液（LTS1077）：天津?yàn)笊镉邢薰?，聚乙二醇（YB120644-100）：上海鈺博生物科技有限公司，HAT篩選培養(yǎng)基（19-0090-500）：上海信裕生物科技有限公司，重組人纖粘連蛋白RetroNectin（T100B）、淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（GT-T551）：寶日醫(yī)（TAKARA）北京有限公司。CD86-FITC單抗（ab24862）、CD80-FITC 單抗（ab18279）、CD44-PE 單抗（ab46793）、CD3-FITC單抗（ab34275）、CD56-PE 單抗（ab210305）、CD8β-PE單抗（ab95769）：艾博抗（Abcam）上海貿(mào)易有限公司。臺盼藍(lán)染色液（PH0519）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（PH0539）：福州飛凈（PHYGENE）生物科技有限公司。兔抗人RKIP單抗（#13006）、NF-κB p65單抗（#8242）、Caspase-8單抗（#4790）、兔抗人β-actin單抗（#4970）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（#7074）：美國Cell Signaling Technology（CST）公司。Western blot試劑盒（WB0411）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 自體胃癌細(xì)胞的制備[7]收集2016年10月～2017年8月我院消化內(nèi)科和普外科住院及門診患者20例，其中男12例，女8例，年齡40～96歲，平均（62.15±3.15）歲，結(jié)合臨床資料、胃鏡+病檢確診為進(jìn)展期胃癌。檢查前未行放化療，標(biāo)本采集獲得患者知情同意，相應(yīng)細(xì)胞組分分別編號1～20。胃鏡下活檢鉗取腫瘤組織2～3塊，部分標(biāo)本送病檢，其余均勻涂布于25ml培養(yǎng)瓶底，加入含10﹪胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5﹪CO2溫箱中培養(yǎng)，定期換液，當(dāng)觀察到細(xì)胞鋪滿度為90﹪時，0.25﹪胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，待培養(yǎng)至對數(shù)期生長狀態(tài)，凍存。

1.2.2 DC的提取與鑒定 分離患者外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），具體操作步驟見前期研究[8]，將懸浮細(xì)胞選擇性去除巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞及細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），余下T細(xì)胞用來培養(yǎng)CIK。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)7d收獲未成熟DC。

1.2.3 胃癌細(xì)胞/DC融合疫苗的制備及鑒定 具體操作步驟見前期研究[8]，采用PEG法融合[9]，HAT培養(yǎng)基篩選融合疫苗。CD86-FITC單抗（綠色）標(biāo)記DC、CD44-PE單抗（紅色）標(biāo)記胃癌細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察雙染細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀（FCM）測定雙陽性細(xì)胞即成功融合細(xì)胞比率，并比較融合DC和未融合DC表面CD80、CD86的表達(dá)差異。

1.2.4 CIK細(xì)胞制備 用PBS液將前述分離的T細(xì)胞混懸，2 000r/min離心10min，洗滌，將細(xì)胞調(diào)至2×106/ml，加入 24孔培養(yǎng)板（終體積 1ml/孔），加入rhIFN-γ（1 000U/ml），24h后依次加入rhIL-1 （500U/ml）、rhIL-2 （500U/ml）、CD3單抗（100ng/ml），在37℃、5﹪CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔3d換液，只補(bǔ)充同等劑量的rhIL-2。培養(yǎng)7～10d，使CIK細(xì)胞總數(shù)達(dá)2×109/ml，臺盼藍(lán)染色，拒染細(xì)胞比例＞95﹪。收集細(xì)胞，采用1﹪白蛋白生理鹽水洗滌兩遍后懸浮其中[10]。

1.2.5 各組細(xì)胞與CIK細(xì)胞混合培養(yǎng) 將CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，加50ml GT-T551無血清培養(yǎng)基及rhIFN-γ（1 000U/ml），24h 后將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入已包被RetroNectin的培養(yǎng)瓶中，加入 rhIL-2（1 000U/ml）、rhIL-1α（100U/ml）和GT-T551培養(yǎng)基（加入2﹪自體血清），5d后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)袋中，每3～5d添加培養(yǎng)基和rhIL-2。實(shí)驗(yàn)分為3組，DC-胃癌細(xì)胞融合疫苗組（融合組）、DC組、胃癌細(xì)胞組（胃癌組），每組均為20例入選患者的相應(yīng)細(xì)胞組分。將各組細(xì)胞按1∶40的比例混入同編號CIK細(xì)胞培養(yǎng)袋中。第14天收集混合培養(yǎng)細(xì)胞，行CIK細(xì)胞免疫表型測定：PBS洗滌培養(yǎng)細(xì)胞兩次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，各取100μl加入離心管，再加入各標(biāo)記單抗20μl，置暗處4℃反應(yīng)30min后，PBS洗滌兩次，F(xiàn)CM測定CD3-FITC/CD8-PE、CD3-FITC/CD56-PE雙陽性細(xì)胞比率[4]。

1.2.6 各組混合培養(yǎng)細(xì)胞對人自體胃癌細(xì)胞凋亡影響的檢測 以1×106/ml接種對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞于6孔板，于37℃、5﹪CO2溫箱培養(yǎng)生長，隨后將相同密度的3組混合細(xì)胞放入6孔板與同編號胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)5～15d，按照試劑盒說明，在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，PBS洗滌，胰酶消化解離細(xì)胞，1 500r/min離心5min，棄上清，PBS重懸、計數(shù)。取1×106細(xì)胞懸浮液，1 500r/min，離心5min后棄上清，加入500μl 1×Binding Buffer，加入5μl Annexin V-FITC，再 加入10μl PI，輕輕混勻。室溫使用鋁箔避光孵育5～15min。在1h內(nèi)行FCM檢測早期凋亡細(xì)胞百分率（使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞作對照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)）。另取一滴細(xì)胞懸浮液于載玻片上，蓋玻片觀察。采用雙色濾光片，Annexin V-FITC熒光呈綠色，PI熒光呈紅色[11～13]。

1.2.7 RKIP、NF-κB、Caspase-8蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法，將作用后的胃癌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，3 000r/min離心3min，收集沉淀，按照6孔板每孔加入100μl RIPA裂解液，反復(fù)吹打混勻，冰上靜置30min，12 000r/min離心3min，取上清。提取少量樣品行BCA定量，其余蛋白樣品煮沸變性，存于-20℃冰箱中備用。灌制分離膠和積層膠，加樣（20μl每孔）、電泳、切膠、轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)好的膜置于5﹪脫脂奶粉中封閉2h，加入一抗（RKIP、NF-κB p65、Caspase-8，稀釋比例均為 1∶1000），4℃過夜孵育，沖洗3次，加HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1∶3000），室溫孵育 1h，徹底沖洗 3次，ECL 顯色、定影、沖洗晾干、照相。β-Actin作內(nèi)參。取目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值為相對表達(dá)量[14～16]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計量資料以±s表示。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 融合率檢測及融合前后DC表面分子表達(dá)比較 熒光顯微鏡下觀察，誘導(dǎo)融合之后的DC體積增大、毛刺多而密，呈現(xiàn)典型的成熟DC形態(tài)。胃癌細(xì)胞與DC的融合率為26.2﹪；融合DC較未融合DC高表達(dá)CD80[（84.50±2.07）%vs （24.70±1.49）﹪，t=74.11，P=0.000]和CD86[（76.50±1.58）﹪ vs（18.90±1.19）﹪，t=91.84，P=0.000]，見圖1。

2.2 CIK細(xì)胞亞群免疫表型檢測 3組細(xì)胞與CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)后，CD3+CD8+、CD3+CD56+細(xì)胞百分比比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；融合組與另外兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），DC組與胃癌組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表1。

圖1 融合率檢測及融合前后DC表面分子表達(dá)

2.3 各組混合培養(yǎng)細(xì)胞對自體胃癌細(xì)胞凋亡的影響 胃癌組、DC組、融合組自體胃癌細(xì)胞凋亡率依次上升（見圖3）；RKIP、Caspase-8蛋白相對含量表達(dá)依次上調(diào)；NF-κB蛋白相對含量表達(dá)依次下調(diào)（見圖4），3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；融合組與DC組及胃癌組上述各指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；DC組與胃癌組上述各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖2 CIK細(xì)胞亞群免疫表型檢測

圖3 胃癌細(xì)胞與各組混合培養(yǎng)細(xì)胞作用后凋亡情況

圖4 Western-blot法檢測RKIP、NF-κB、Caspase-8蛋白表達(dá)

表1 3組混合培養(yǎng)細(xì)胞對自體胃癌細(xì)胞的影響（±s）

表1 3組混合培養(yǎng)細(xì)胞對自體胃癌細(xì)胞的影響（±s）

組別 CD3+CD8+（﹪） CD3+CD56+（﹪） 凋亡率（﹪） RKIP/β-Actin NF-κB/β-Actin Caspase-8/β-Actin融合組 62.60±4.27 30.55±3.25 18.40±4.17 1.96± 0.49 0.88±0.19 0.85±0.20 DC 組 50.20±4.85 23.75±3.47 9.25±3.64 1.26±0.26 1.56±0.12 0.53±0.12胃癌組 47.10±5.01 21.00±5.28 7.15±3.18 1.19±0.44 1.68±0.24 0.43±0.20 3組比較 *F 60.29 28.68 52.63 21.05 101.58 29.89 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000融合組與DC組比較t 8.58 6.39 7.39 5.54 -13.32 6.08 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000融合組與胃癌組比較t 10.52 6.89 9.59 5.18 -11.63 6.56 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 DC組與胃癌組比較t 1.99 1.95 1.94 0.63 -2.01 1.92 P 0.054 0.059 0.060 0.533 0.052 0.063

3 討論

對于晚期胃癌患者，手術(shù)切除率低、術(shù)后轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)率高；放化療效果欠佳、毒性反應(yīng)大[17]。而免疫治療尤其是自體細(xì)胞免疫治療因針對腫瘤患者因人施治，完全符合腫瘤個體化治療標(biāo)準(zhǔn)，其中以DCCIK細(xì)胞免疫治療為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]。DC因其專職抗原呈遞、激活初始T細(xì)胞，在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。CIK系多種細(xì)胞因子共刺激、培養(yǎng)T細(xì)胞后獲得的異質(zhì)細(xì)胞群，可不需要其他輔助細(xì)胞和因子即可發(fā)揮強(qiáng)大的殺傷腫瘤細(xì)胞作用。主要由CD3+CD56+和CD3+CD8+亞群組成。DC-CIK療法是將活性DC與CIK混合培養(yǎng)后回輸至患者體內(nèi)，通過免疫調(diào)節(jié)進(jìn)行抗腫瘤治療[18，19]。但研究表明[5]，腫瘤患者體內(nèi)DC數(shù)量少、功能嚴(yán)重缺陷，無法誘導(dǎo)后續(xù)免疫反應(yīng)。如何有效刺激誘導(dǎo)DC增殖成熟、提呈抗原以及如何高效殺滅體內(nèi)殘存癌細(xì)胞是目前面臨的兩大關(guān)鍵問題。

由于大多數(shù)腫瘤并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性及特異性較好的抗原，只能采取全細(xì)胞抗原來刺激DC增殖分化成熟。DC與腫瘤細(xì)胞融合技術(shù)能確保DC獲得腫瘤細(xì)胞全部信息、呈遞多種腫瘤抗原，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前常用融合技術(shù)有電融合法[20]和PEG化學(xué)方法[9]。由于電脈沖會造成膜的可逆擊穿、細(xì)胞內(nèi)容物外泄這一缺陷，部分限制了此類技術(shù)的應(yīng)用，目前廣泛采用的仍是操作較簡單經(jīng)濟(jì)的PEG法。龐業(yè)濱等[9]采用PEG法制備肝癌HepG2細(xì)胞與DC融合疫苗，發(fā)現(xiàn)融合率為54.5%，融合疫苗表面高表達(dá)DC成熟分子，與單純DC、HepG2和DC混合細(xì)胞組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。我們應(yīng)用PEG法制備胃癌細(xì)胞-DC融合疫苗，F(xiàn)CM檢測該融合細(xì)胞呈CD86+CD44+雙陽性，證明融合成功，融合率為26.2﹪，與上述報道中融合率不同，考慮為腫瘤細(xì)胞類別差異所致。且融合DC較未融合DC高表達(dá)CD80、CD86成熟分子，與上述報道結(jié)果一致，證明了融合疫苗促進(jìn)DC本身的成熟。分組采用混合細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，融合組CIK細(xì)胞CD3+CD56+和CD3+CD8+細(xì)胞比例較DC組和胃癌組明顯升高，而DC組和胃癌組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，既驗(yàn)證了腫瘤患者體內(nèi)DC功能缺陷，誘導(dǎo)免疫效應(yīng)能力不足，又進(jìn)一步揭示了融合疫苗可促進(jìn)CIK細(xì)胞的成熟。

林興等[13]用PEG法制備DC肺癌細(xì)胞融合疫苗，發(fā)現(xiàn)其有誘導(dǎo)小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI染色法較特異地區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)融合組較其他兩組胃癌細(xì)胞的凋亡率增高，而DC組和胃癌組凋亡率相比無統(tǒng)計學(xué)差異，從細(xì)胞水平也驗(yàn)證了DC融合疫苗聯(lián)合CIK可有效對抗晚期腫瘤，與已有結(jié)論相似。

研究報道[14，15]，RKIP同腫瘤細(xì)胞的凋亡存在密切關(guān)系，張曉梅等[21]采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將RKIP真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）/RKIP導(dǎo)入胃癌細(xì)胞系SGC7901，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞系誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，RKIP基因重表達(dá)有助于該細(xì)胞系惡性表型逆轉(zhuǎn)。RKIP誘導(dǎo)凋亡是通過多條信號通路調(diào)控的，如對NF-κB信號通路的調(diào)控。NF-κB是公認(rèn)的拮抗凋亡轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，既可在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）凋亡信號傳導(dǎo)過程中通過上調(diào)誘騙受體起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，也可激活抗凋亡基因cFLP，因cFLP碳末端含有兩個類似Caspase蛋白的死亡效應(yīng)域，可競爭性招募某些死亡域，造成Caspase失活、凋亡受阻[16，22，23]。Su 等[24]發(fā)現(xiàn) RKIP 影響 NF-κB 的上游，抑制諸如NIK、TAK1、IKKα/β等多種激酶，從而抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄。沉默RKIP表達(dá)促進(jìn)NF-κB轉(zhuǎn)錄及減少細(xì)胞凋亡。另外，Baritaki等[25]發(fā)現(xiàn)RKIP在腫瘤中表達(dá)很少，促進(jìn)其過表達(dá)可以通過上調(diào)TRAIL受體DR5（death recepter 5）來促進(jìn)凋亡。當(dāng)TRAIL與其受體DR5結(jié)合后三聚化，通過其胞內(nèi)段的死亡結(jié)構(gòu)與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（FADD）及pro-Caspase-8形成死亡信號誘導(dǎo)復(fù)合物，導(dǎo)致Caspase-8活化，而Caspase-8位于細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)的頂點(diǎn)，繼而激活下游效應(yīng)Caspase，如 Caspase-3、6、7。本研究結(jié)果顯示，融合組較其他兩組 RKIP、Caspase-8 蛋白表達(dá)上調(diào)，NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)，與凋亡率變化相一致，提示可能通過上調(diào)RKIP、抑制NF-κB從而上調(diào)Caspase-8，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，起到抗腫瘤效應(yīng)。本研究證明了DC融合疫苗-CIK細(xì)胞作用的可行性，為臨床進(jìn)行個體化抗腫瘤免疫治療提供了依據(jù)。

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