金琦 張敏 丁洪流 劉欣

[摘 要]建立了檢測(cè)魚(yú)肉組織中7種羥基多溴聯(lián)苯醚（hydroxylated polybrominated diphenyl ethers， PBDEs）（OH-PBDEs）的方法。魚(yú)樣品經(jīng)過(guò)正己烷/丙酮（1：1， v：v）混合液超聲波輔助提取，固相萃取凈化后，采用液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法在負(fù)離子模式下檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，7種OH-PBDEs的回收率為71.11%～99.30%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.35%～18.41%，方法檢測(cè)限是0.1～0.25 ng/g（干重）. 利用該方法對(duì)8種魚(yú)進(jìn)行OH-PBDEs檢測(cè)，結(jié)果顯示：花鰱、鳊魚(yú)、鯽魚(yú)和草魚(yú)體內(nèi)的黑膜有較多的OH-PBDEs檢出。

[關(guān)鍵詞]食品安全檢測(cè)；羥基多溴聯(lián)苯醚；液相色譜-質(zhì)譜；魚(yú)肉組織

中圖分類(lèi)號(hào)：S554 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2018）10-0257-03

0 引言

PBDEs是一類(lèi)添加型阻燃劑，廣泛用于家用電器、電子產(chǎn)品、塑料泡沫、家居裝飾材料等行業(yè)，存在于多種生物介質(zhì)中[1～4]。OH-PBDEs是PBDEs的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，也有研究表明OH-PBDEs是PBDEs的代謝產(chǎn)物，因此在很多生物介質(zhì)中都可檢測(cè)到OH-PBDEs，如魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)、藻類(lèi)，地表水、人體血液、動(dòng)物體內(nèi)、母乳中等。OH-PBDEs可與甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，使甲狀腺功能紊亂，研究發(fā)現(xiàn)5-OH-BDE-47可以像甲狀腺素一樣在相同的結(jié)合點(diǎn)與甲狀腺素蛋白（TTR）和甲狀腺素結(jié)合球蛋白（TBG）兩種蛋白質(zhì)結(jié)合，與甲狀腺素形成競(jìng)爭(zhēng)，影響甲狀腺素在生物體內(nèi)的作用；6-OH-BDE-47能增加細(xì)胞凋亡率，阻滯細(xì)胞周期，損害DNA。也有研究表明OH-PBDEs可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)，吃魚(yú)較多的人血液中OH-PBDEs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)要高一些，而魚(yú)肉的蛋白質(zhì)含量較高，大部分人都喜歡食用，因此監(jiān)測(cè)魚(yú)體內(nèi)OH-PBDEs的含量對(duì)保障人們的健康尤為重要。

目前，檢測(cè)OH-PBDEs有采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）的，如LACORTE等[5]運(yùn)用GC HRMS法測(cè)魚(yú)肉和母乳中的5種OH-PBDEs，但用GC-MS/MS法需繁瑣的衍生化處理過(guò)程，多數(shù)人則采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，如LUPTON等[6]運(yùn)用LC-APCI-MS/MS測(cè)定了人體肝臟中的9種OH-PBDEs。本文建立了LC-ESI-MS/MS法，采用UAE、SPE凈化測(cè)定魚(yú)肉組織中的7種OHPBDEs。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：AB SCIEX 4000 QTRAP 質(zhì)譜儀，配置島津高效液相色譜儀，美國(guó)AB SCIEX公司；色譜柱（C18反相柱，150 mm×2.00 mm，3μm），美國(guó)Waters公司； Si-SPE（1g/6 mL）， 上海安譜公司；電熱對(duì)流烘箱，德國(guó)賓得儀器公司；IKA VORTEX 3漩渦混勻器，德國(guó)IKA公司；超聲儀，韓國(guó)Elma公司；HGC型氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；Milli-Q PLUS超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；PL2002電子分析天平，瑞士Mettler公司；可調(diào)式移液器，Eppendorf公司；離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

3-羥基-2，2，4，4-四溴聯(lián)苯醚（ 3-OH-BDE-47），5-羥基-2，2，4，4-四溴聯(lián)苯醚（5-OH-BDE-47），6-羥基-2，2，4，4 -四溴聯(lián)苯醚（6-OH-BDE-47），2-羥基-2，3，4，5-四溴聯(lián)苯醚（2'-OH-BDE-68），4-羥基-2，2，3，4-四溴聯(lián)苯醚（4-OH-BDE-42 ），6-羥基-2，2，3，4，4 -五溴聯(lián)苯醚（6-OH-BDE-85），6-羥基-2，2，4，4 5-五溴聯(lián)苯醚（6-OH-BDE-99）標(biāo)準(zhǔn)品（10 μg/mL，純度均在98%以上，美國(guó)AccuStandard公司）。

正己烷，丙酮，乙腈，甲基叔丁基醚，異丙醇，色譜純，美國(guó)TEDIA公司；二氯甲烷（DCM），分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；甲酸，色譜純；各種魚(yú)購(gòu)自蘇州當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 樣品前處理

魚(yú)解剖去皮后取整魚(yú)脊背肌肉，與適量無(wú)水硫酸鈉均勻混合后，用研缽攪勻取2g于離心管中（n=3），加入3ng混合標(biāo)樣，2mL異丙醇，5mL正己烷/丙酮（1：1，v：v）萃取液，振蕩2min，完全混合均勻后，超聲波提取30min（30℃，37Hz），6000r/min離心4min，將上清液移走。此過(guò)程重復(fù)2次，合并上清液，氮吹干，用5mL正己烷振蕩復(fù)溶，然后過(guò)SPE硅膠小柱凈化，用DCM洗脫，收集洗脫液并氮吹干，然后用1mL乙腈溶解，過(guò)0.22μm的有機(jī)濾膜，裝入小瓶待UPLC-MS/MS分析。

SPE硅膠小柱用5mLDCM+5mL正己烷活化，上樣棄去流出液，5mL正己烷淋洗，6mLDCM洗脫，收集洗脫液。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

流動(dòng)相：0.2%甲酸-乙腈，梯度洗脫：0～9min，乙腈由65%增至75%，9～12min，乙腈保持75%，12～17min，乙腈由75%降至65%；流速：0.25mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：35℃.電噴霧負(fù)離子掃描模式（ESI-），多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；離子噴霧電壓：4500V；離子源溫度T：500℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取方式的選擇

為了能充分提取魚(yú)肉組織中的OH-PBDEs，比較了常規(guī)固液萃取和超聲波2種萃取方法，結(jié)果顯示，除了4-OH-BDE-42外其余6種OH-PBDEs超聲波提取的效果較好，故選用超聲波的提取方式，SUN等[7]也選擇了超聲波萃取。之后又比較了超聲時(shí)間（20min，30min，40min）對(duì)OH-PBDEs提取效果的影響，結(jié)果顯示，超聲30min和40min效果相近，都比20min效果好，因此選擇超聲時(shí)間30min.。

2.2 萃取溶劑的選擇

萃取溶劑是萃取環(huán)節(jié)中一個(gè)很重要的研究對(duì)象，這里比較了正己烷/甲基叔丁基醚（1：1）、正己烷/丙酮（1：1）、丙酮/二氯甲烷（1：1）、10%正己烷/二氯甲烷這幾種常見(jiàn)萃取溶液的萃取效果。結(jié)果顯示（如圖1所示），綜合考慮各萃取液對(duì)7種物質(zhì)的回收率選擇正己烷/丙酮（1：1），其對(duì)各種物質(zhì)的回收率在71.11%～99.30%之間。

2.3 固相萃取小柱洗脫液體積的優(yōu)化

選擇二氯甲烷作為洗脫溶劑，在洗脫時(shí)每3mL收集一次，共收集6次，結(jié)果顯示（見(jiàn)表1），只有前2次收集的有目標(biāo)物，因此洗脫液二氯甲烷用6mL。而Sun等[7]在測(cè)環(huán)境基質(zhì)中的OH-PBDEs時(shí)用酸性硅膠柱凈化時(shí)洗脫液二氯甲烷耗費(fèi)70mL，王英等[8]在測(cè)人血中的OH-PBDEs時(shí)用1cm酸性硅膠柱凈化用12mL二氯甲烷洗脫，較前兩者，本方法大大節(jié)省了洗脫溶劑。

2.4 LC-MS/MS條件優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)品在電噴霧負(fù)離子模式（ESI-）下進(jìn)行全掃描和子離子掃描，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)得到母離子和子離子如表2所示，這與王英等[8]、SUN等[7]及LACORTE等[5]的研究結(jié)果一致。碰撞電壓是MS/MS分析的關(guān)鍵，碰撞電壓能量不足，難以出現(xiàn)二次電離，無(wú)子離子生成；能量過(guò)高，產(chǎn)生碎片離子成分復(fù)雜，且母離子消失。通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)得到的7種的碰撞電壓如表2所示。在優(yōu)化好的條件下得到的7種OH-PBDEs的分離色譜圖如圖2所示。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與檢測(cè)限

按上述的色譜-質(zhì)譜條件測(cè)定配置的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25，0.5，2，5，25，50，100 ng/mL， 以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，7種OH-PBDEs的回歸方程、線(xiàn)性區(qū)間和檢出限如表3所示。

2.6 回收率和精密度

準(zhǔn)確稱(chēng)取干魚(yú)肉2.00g，按低、中、高3個(gè)水平加入混合標(biāo)樣，分別是0.5，1，5ng，驗(yàn)證方法回收率（n=3），經(jīng)UPLC-MS/MS分析后7種OH-PBDEs的回收率如表4所示。平均回收率在71.11%～99.30%，RSD在3.35%～18.41%，符合GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》中的規(guī)定：被測(cè)組分含量<0.1mg/kg時(shí)，回收率范圍60%～120%，實(shí)驗(yàn)內(nèi)變異系數(shù)CV在20%以?xún)?nèi)；因此本方法準(zhǔn)確可靠，可滿(mǎn)足實(shí)際測(cè)定的需要。

2.7 樣品的分析

綜合考慮水產(chǎn)品的產(chǎn)量、居民的日常食用習(xí)慣和市場(chǎng)消費(fèi)情況等方面因素，采集了8種魚(yú)：花鰱、白魚(yú)、鳊魚(yú)、鯽魚(yú)、黑魚(yú)、昂刺魚(yú)、鯰魚(yú)和草魚(yú)，每種至少3條，檢測(cè)其體內(nèi)的OH-PBDEs含量。

2.7.1 不同品種魚(yú)的污染情況

運(yùn)用建立好的方法檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表5，其中只有4種魚(yú)體內(nèi)檢出了OH-PBDEs。

其中花鰱、鳊魚(yú)和鯽魚(yú)體內(nèi)可檢出4種以上的OH-PBDEs，草魚(yú)體內(nèi)雖只有兩種OH-PBDEs，但含量很高，6-OH-BDE-47達(dá)到3.1928 ng/g（干重），比其他魚(yú)體內(nèi)的高一個(gè)數(shù)量級(jí)；昂刺魚(yú)、白魚(yú)、鯰魚(yú)和黑魚(yú)的污染情況比較樂(lè)觀，其體內(nèi)OH-PBDEs含量均低于檢出限。各種魚(yú)體內(nèi)目標(biāo)物含量的差別可能與其自身的組織結(jié)構(gòu)對(duì)OH-PBDEs積累能力的強(qiáng)弱有關(guān)，草魚(yú)、鳊魚(yú)、鯽魚(yú)和花鰱對(duì)OH-PBDEs的積累能力較強(qiáng)，而其他的魚(yú)相對(duì)較弱；也可能是由于各種魚(yú)生活的局部水域環(huán)境不同所致，亦或是由于魚(yú)的魚(yú)齡差別所致。

2.7.2 魚(yú)體內(nèi)不同組織的污染情況

在2.7.1的基礎(chǔ)上研究了以上4種體內(nèi)含有目標(biāo)污染物的魚(yú)體內(nèi)OH-PBDEs分布情況，分別測(cè)了魚(yú)的脊背肌肉、脂肪含量較高的腹部處肉、魚(yú)皮、魚(yú)鰭、魚(yú)鱗、內(nèi)臟中的肝臟、腸、魚(yú)鰾和內(nèi)膜臟層（俗稱(chēng)黑膜）9處OH-PBDEs的含量，含量分布示意圖如圖3。

檢測(cè)結(jié)果顯示鳊魚(yú)、鯽魚(yú)、草魚(yú)和花鰱的黑膜中都有目標(biāo)污染物檢出，而且黑膜中的目標(biāo)物總量最多，魚(yú)鰾（俗稱(chēng)魚(yú)泡）次之（如圖3），而其它體內(nèi)沒(méi)有黑膜的魚(yú)均未檢出OH-PBDEs；其中鳊魚(yú)的黑膜中檢出了兩種污染物，6-OH-BDE-47含量最高，有0.4366 ng/g（干重），內(nèi)臟魚(yú)鰾和肝臟中也有目標(biāo)物檢出，含量均低于黑膜中的；鯽魚(yú)的黑膜中也檢出了5-OH-BDE-47和6-OH-BDE-47，魚(yú)鰾中檢出了微量6-OH-BDE-85（0.1516 ng/g（干重）），魚(yú)體的其它部位僅在魚(yú)皮中檢出了0.1698 ng/g（干重）6-OH-BDE-47；草魚(yú)中也僅僅在內(nèi)臟部分檢測(cè)到了目標(biāo)污染物，黑膜中檢出了較高含量的6-OH-BDE-47，高達(dá)2.932 ng/g（干重），這比其它魚(yú)體內(nèi)的污染物含量高一個(gè)數(shù)量級(jí)；花鰱的黑膜中檢出了5種目標(biāo)污染物，其中6-OH-BDE-47的含量最高（0.6632 ng/g（干重）），而其它部位均沒(méi)有檢出。這可能是由于黑膜是魚(yú)腹中的“保護(hù)層”，不但可以起到魚(yú)腹與器官隔離的作用，還可以防止內(nèi)臟器官分泌的有害物質(zhì)通過(guò)腸壁滲透到肌肉中去，這層黑膜可能是各種有害物質(zhì)的匯集處。

3 結(jié)論

本文建立了高效快速的LC-ESI-MS/MS方法，用于分析檢測(cè)魚(yú)肉組織中的7種OH-PBDEs，該方法的回收率和重復(fù)性均在可接受范圍內(nèi)，可快速完成檢測(cè)過(guò)程，這一基礎(chǔ)性工作為后續(xù)OH-PBDEs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和對(duì)其建立減控措施奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)；利用建立好的方法檢測(cè)了8種魚(yú)的OH-PBDEs污染情況，結(jié)果顯示目標(biāo)污染物多數(shù)集中在黑膜中，建議食用時(shí)盡量清洗干凈或?qū)⒑谀とコ?/p>

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