王淑麗 張晶晶 侯玉華

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌;Foxm1;Gli2;Hh信號通路

中圖分類號：R737.9?? 文獻標識碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.01.020

Expression of Foxm1 and Gli2 and its clinical significance in breast cancer

WANG Shuli，ZHANG Jingjing，HOU Yuhua

【Abstract】 Objective To analyze the expression of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues，and to discuss the effect of the two in the occurrence，progression，invasion and metastasis of breast cancer，so as to provide reference indexes for the diagnosis and metastasis evaluation of breast cancer.

Methods 106 specimens of breast cancer were collected，including 68 cases of invasive breast cancer and 38 cases of breast fibroadenoma. A total of 40 cases of normal breast tissue beside the cancer were taken as controls. Immunohistochemical method was used to detect the expression of Foxm1 and Gli2 in these specimens. Relationship between the expression of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues as well as relationship between them and the clinical characteristics of breast cancer were analyzed.

Results The expression levels of Foxm1 protein and Gli2 protein in breast cancer tissues were significantly higher than those in breast fibroadenoma tissues and normal breast tissues （P<0.05）.The positive rates of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues with lymph node metastasis were higher than those without lymph node metastasis （P<0.05）.Spearman correlation analysis showed that Foxm1 was positively correlated with Gli2 （r=0517，P<0.001）.

Conclusion Foxm1 and Gli2 are highly expressed in breast cancer tissues，they have certain correlation，and may involve in the process of occurrence，invasion and metastasis of breast cancer.Therefore，the detection of expression levels of them? may be of guiding significance for the diagnosis of breast cancer and the assessment of whether there is a metastasis.

【Key words】 breast cancer;Foxm1;Gli2;Hh signaling pathway

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，它對女性的健康造成了極大威脅，癌細胞轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的重要原因。近年來，雖然腫瘤治療手段已取得了極大進展，但乳腺癌的常規(guī)治療效果并不理想。近期的研究證實，分子靶向藥物治療可有效延長乳腺癌患者的生存期，改善其生活質(zhì)量[1]。故了解乳腺癌發(fā)生、進展的信號通路及關(guān)鍵分子，找到乳腺癌的治療靶點是廣大學者關(guān)注的熱點。Foxm1是一種特異性細胞增殖轉(zhuǎn)錄因子，它對細胞周期變化具有調(diào)節(jié)作用，參與了乳腺癌的發(fā)生、進展過程[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxm1的轉(zhuǎn)錄受Hedgehog（Hh）信號通路的下游轉(zhuǎn)錄因子Gli2調(diào)控，Gli2基因是Hh信號通路的直接轉(zhuǎn)錄靶點。腫瘤的增殖是通過解除細胞周期的控制，活化Hh信號通路來實現(xiàn)[3]。本研究采用免疫組化法檢測乳腺癌、良性乳腺腫瘤及正常乳腺組織中的Foxm1、Gli2蛋白表達，以探討兩者在乳腺癌中的作用機制及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

收集2015年8月至2017年2月在河南鄭州市中心醫(yī)院婦科手術(shù)切除并進行石蠟包埋的乳腺腫瘤標本106例，其中浸潤性乳腺癌68例，乳腺纖維腺瘤38例。另以癌旁正常乳腺組織作為對照，共40例。上述標本的患者均為初次發(fā)病，年齡30～72歲，平均年齡為（53.6±6.1）歲，術(shù)前未接受其他方法治療。所有病理診斷均由本院經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生確認。

1.2 實驗試劑

兔抗人Foxm1多克隆抗體（美國ABGENT公司），Gli2多克隆抗體（英國Abcam公司），抗體工作液和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。

1.3 免疫組化法檢測

將上述標本石蠟切片脫蠟、梯度酒精脫水，室溫下置于3%過氧化氫溶液終孵育5～10 min，PBS沖洗3次，每次5 min。血清封閉，滴加抗Foxm1、Gli2一抗（Gli2按1∶200，F(xiàn)oxm1按1∶300稀釋），4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5 min，滴加對應(yīng)二抗工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標記的二抗，滴加少量DAB顯色液反應(yīng)3 min，復(fù)染、脫水、鏡檢。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

Foxm1蛋白定位于細胞漿和細胞核，陽性染色時胞漿和胞核呈淡黃、棕黃色甚至棕褐色;Gli2蛋白定位于細胞漿，陽性染色時胞漿呈淡黃、棕黃色甚至棕褐色。根據(jù)鏡下切片染色強度及陽性細胞的占比評分。染色強度：無染色計0分;淡黃色計1分;深黃色計2分;棕褐色計3分。陽性細胞占比<5%計0分;陽性細胞占比為5%～25%計1分;陽性細胞占比為26%～50%計2分;陽性細胞占比為51%～75%計3分;陽性細胞占比為76%～100%計4分。免疫組化評分=染色強度評分×陽性細胞占比評分[4]。免疫組化評分總分為0～12分，分為：陰性（≤1分）、弱陽性（≤3分）、陽性（≤6分）、強陽性（>6分）。免疫組化評分2分及以上者表示陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

選用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較用協(xié)方差分析，兩兩比較用SNK法檢驗，計數(shù)資料用百分比（%）表示，組間比較用χ2檢驗，F(xiàn)oxm1與Gli2間的關(guān)系用Spearman等級相關(guān)性檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)? 果

2.1 乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤組織及正常乳腺組織中的Foxm1、Gli2蛋白表達情況

Foxm1蛋白在細胞漿和細胞核中均有表達，正常乳腺組織少量表達或無表達，乳腺纖維腺瘤弱陽性表達，乳腺癌組織強陽性表達（見圖1）。Gli2蛋白表達于胞漿，正常乳腺組織極少表達或無表達，乳腺纖維腺瘤弱陽性表達，乳腺癌組織表達明顯增強（見圖2）。乳腺癌組織Foxm1蛋白、Gli2蛋白表達評分高于乳腺纖維腺瘤組織和正常乳腺組織（P<0.05）。見表1。

2.2 Foxm1和Gli2的表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

Foxm1和Gli2的表達與乳腺癌患者年齡、腫瘤直徑、組織學分級、臨床分期差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的乳腺癌組織的Foxm1和Gli2的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 Foxm1與Gli2表達的關(guān)系

Spearman等級相關(guān)檢驗結(jié)果顯示，F(xiàn)oxm1與Gli2呈正相關(guān)（r=0.517，P<0.001）。

3 討? 論

Foxm1為叉頭框蛋白家族，是一類具有嚴格細胞核定位，DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。它屬于增殖特異性蛋白，可通過調(diào)控細胞周期來促進細胞增生和有絲分裂，在靜止或未分化細胞中低表達或無表達，而在增殖細胞中高表達[5]。Foxm1的活化過程中是多因子、多細胞信號通路共同參與作用的結(jié)果，信號通路包括Hh信號通路和Ras-MAPK信號通路[6]。Hh信號通路是由Hh配體、跨膜蛋白質(zhì)受體patched和Smoothened組成的受體復(fù)合物、下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白（Gli1、Gli2、Gli3）等組成，它的激活與多種腫瘤的發(fā)生、進展及侵襲和轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)[7]。有研究報道，敲除Gli2基因可使其相關(guān)蛋白表達水平降低，且會極大降低Foxm1的表達水平，提示Gli2與Foxm1在腫瘤的發(fā)生和進展中可能有一定的關(guān)系[8]。Gli2作為Hh信號通路的轉(zhuǎn)錄因子之一，對下游多種靶基因的表達具有調(diào)控作用，如與細胞增殖、分化有關(guān)的基因（cyclin D1）、抗凋亡基因Bcl2等[9]。大量研究報道，在多種惡性腫瘤（如基底細胞癌、前列腺癌、肺癌等）中均有Gli2的異常高表達，其過表達與低預(yù)后有關(guān)[10]。而且Foxm1作為Hh信號通路的下游靶基因，Hh信號通路活化后可上調(diào)Foxm1基因的表達[11]。??蓋領(lǐng)等人[12]研究顯示，F(xiàn)oxm1在乳腺浸潤癌中的表達顯著升高，其表達水平與腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。李周芳等[13]研究指出，F(xiàn)oxm1在乳腺癌細胞增殖過程中起重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，正常乳腺組織中Foxm1呈低表達或不表達，乳腺纖維腺瘤組織表達量有所增加，而乳腺癌組織中表達量顯著增高，染色強度明顯強于正常乳腺組織和乳腺纖維腺瘤;而且在乳腺癌組織中，F(xiàn)oxm1雖與患者年齡、腫瘤直徑、組織分級及臨床分期無明顯相關(guān)性，但在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，說明Foxm1蛋白表達上調(diào)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究同時也發(fā)現(xiàn)，Gli2蛋白在乳腺癌組織中的表達水平也明顯高于正常乳腺組織和乳腺纖維腺瘤組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系與Foxm1相似。Spearman秩和相關(guān)檢驗結(jié)果顯示，F(xiàn)oxm1與Gli2呈正相關(guān)，這一結(jié)果佐證了Gli2作為Hh信號通路的轉(zhuǎn)錄因子，其對作為Hh信號通路下游靶基因的Foxm1的表達具有調(diào)控作用。

綜上所述，F(xiàn)oxm1、Gli2在乳腺癌組織中均高表達，兩者存在一定的相關(guān)性，可能參與了乳腺癌的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過程，因此對兩者表達水平進行檢測，可能對乳腺癌的診斷及是否轉(zhuǎn)移的評估具有指導(dǎo)意義。

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