張佳杰， 孟子暉， 薛 敏， 魏天曄

(北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京100081)

煙堿，又名尼古丁，分子式為C10H14N2，化學(xué)名為1-甲基-2-(2-吡啶基)吡咯烷，呈無色或淡黃色液體，廣泛存在于煙草中，是煙草中含量最高的生物堿［1］。此外，在新鮮蘑菇、非煙草屬茄科植物(如馬鈴薯、番茄、茄子等)中也檢測到煙堿。一方面，煙堿含量過低嚴重影響煙葉及煙草制品的品質(zhì)，國家相繼出臺卷煙五項“國家標(biāo)準(zhǔn)函”，其中煙堿含量始終作為評價卷煙質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一;另一方面，煙堿具有成癮性，通過咀嚼、吸食煙草或煙草制品，煙堿隨之進入人體，可存在于血液、尿液中，測定血漿、尿液等生物樣品中煙堿的含量對監(jiān)測吸煙者健康狀況，研究煙堿在體內(nèi)的作用機制有重要意義。同時香煙煙霧中也存在煙堿，檢測并控制煙霧、空氣、水等環(huán)境中的煙堿有利于提高公共安全。

煙堿由于吡咯環(huán)上的N連有一個甲基，屬于叔氨型，易被質(zhì)子化，因此煙堿溶液呈堿性，幾乎可與任何酸生成鹽，當(dāng)遇到堿時會游離出煙堿，這成為早期煙堿提取和檢測的重要依據(jù)［2］。早在20世紀(jì)前半葉，由于煙草制品的盛行及尼古丁的成癮性危害，人們對于煙堿的檢測進行了一定的研究工作。據(jù)文獻［3］報道，1909年，Bertrand 和 Javillier采用硅鎢酸重量法測定了煙堿，該法在堿性條件下對煙堿水溶液進行蒸餾，蒸汽中的煙堿被硅鎢酸吸收形成硅鎢酸鹽沉淀［SiO2·12WO3·2H2O·2(C10H14N2)2·5H2O］，將沉淀灼燒后，根據(jù)剩余的無水硅酸殘渣重量間接得出煙堿含量。1950年，Ogg等［3］在此基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化。Markwood［4］于1939年公布了一種煙堿比色測定方法，用溴化氰或氯化氰將煙堿的吡咯環(huán)斷開，之后與對氨基苯磺酸產(chǎn)生一顯色化合物，測定該化合物的吸光度從而確定煙堿含量。這些方法雖簡單，但測定結(jié)果為煙堿類植物堿總量，高于煙堿實際含量。隨著研究的深入和分析儀器的進步，陸續(xù)發(fā)展了紅外光譜法、極譜法、色譜法和電位法等更加準(zhǔn)確的檢測方法。

近年來，電子煙被視為減少吸煙者對香煙的依賴，有益社會公共健康的有效發(fā)明。電子煙液通常由保濕劑(主要是丙二醇和甘油)、調(diào)味劑和尼古丁組成，煙堿的含量直接影響電子煙的品質(zhì)及安全性，因此煙堿的檢測方法再次引起了關(guān)注［5］。由于含有煙堿的樣品種類繁多且檢測具有一定難度，近年來關(guān)于煙堿的檢測方法報道較多，本文對煙草及生物樣品中煙堿測定的樣品前處理技術(shù)(固相/液相微萃取技術(shù)和分子印跡法)和常用的檢測方法(分光光度法、液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法、電化學(xué)法)進行了總結(jié)，并闡述了各種檢測方法的特點和適用范圍。

1 樣品前處理

煙草中已知的生物堿有40多種，其中去甲煙堿、新煙堿等與煙堿有著極其相似的結(jié)構(gòu);而尿液、血液等生物樣品中不僅含有與煙堿結(jié)構(gòu)相似的代謝物，而且煙堿含量低微。盡管高靈敏度的檢測器已經(jīng)被開發(fā)出來，但面臨裝置復(fù)雜、成本較高等問題，發(fā)展簡單有效的樣品前處理方法對成功測定煙堿依然必要。檢測煙堿時常用的前處理方法主要有索氏提取法、液液萃取法、超聲/微波輔助提取法，本文只介紹近年來發(fā)展較快的兩種新型前處理技術(shù)。

1．1 固相/液相微萃取技術(shù)

固相/液相微萃取技術(shù)(SPME/LIME)集采樣、萃取和濃縮于一體，可高通量自動化制備樣品，同時降低檢出限。Lim等［6］建立了一種頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法，成功測定了283種調(diào)味液體、21種尼古丁液體和12種一次性電子煙液中14種揮發(fā)性有機化合物的含量，檢出限大多在0.1～3 μg/L。采用固相/液相微萃取技術(shù)進行樣品前處理近年來發(fā)展迅速，顯著提高了煙堿檢測的靈敏度。March等［7］以分散液-液萃取法為樣品前處理手段，GC-MS為檢測方法成功測定了茄子中的尼古丁，檢出限為 0.4 μg/L。Mahpishanian 等［8］建立了一種基于氧化石墨烯的固相微萃取方法，測定生物樣品和水中的尼古丁，檢出限為1.5 μg/L。Boyacl等［9］采用具有2 mm×6 μm涂層的小型超薄SPME纖維，快速、高通量、非消耗的同時測定了血漿中的尼古丁、N，N-二乙基-間-甲苯甲酰胺和雙氯芬酸的含量，檢出限為 5.0 μg/L。

1．2 分子印跡法

分子印跡技術(shù)(MIT)使用模板在大分子中形成特異性識別位點，利用洗脫模板后形成的特定空腔再次識別目標(biāo)分子及其類似物，因分子印跡聚合物的穩(wěn)定性和低成本，其一經(jīng)發(fā)明即作為定制的分離材料被大量嘗試應(yīng)用于分析當(dāng)中。目前，分子印跡與固相萃取(SPE)和SPME等技術(shù)結(jié)合用于食品、藥物分析領(lǐng)域中的樣品制備，具有更高的保留效率和更好的選擇性，同時可以提高樣品回收率［10，11］。近年來，煙堿分子印跡聚合物被證明對香煙煙霧［12］及水中的尼古丁［13］有良好的吸附能力，隨后作為樣品前處理手段成功應(yīng)用于生物樣品中煙堿含量的測定。Franqui等［14］在磁性納米粒子表面上制備了煙堿分子印跡聚合物(MIP)，用于尿樣中尼古丁和可替寧的分散固相萃取，通過GC-MS分析，檢出限為0.1 μg/L。該方法使用外部磁場分離尿樣與MIP，無需離心或過濾，操作簡便迅速，由于MIP的穩(wěn)定性還可獲得較好的重復(fù)性。Ceglowski等［15］分別用尼古丁、異丙安替比林和對羥基苯甲酸甲酯作為模板，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑合成MIP，這些MIP被用作環(huán)境等離子體質(zhì)譜法檢測尿樣和血漿中3種模板分子含量的選擇性吸附劑，其中尼古丁的檢出限為10 nmol/L，回收率可達96%。盡管在檢測過程中MIP被破壞，無法重復(fù)使用，這種方法依然具有低成本優(yōu)勢，可滿足簡單高效分析低煙堿含量生物樣品的要求。本課題組一直致力于MIT在天然產(chǎn)物提取方面的研究［16，17］，基于對近年來煙堿提取方法的考察，已經(jīng)合成了煙堿MIP，將用于高純度煙堿的制備。

2 樣品分析

2．1 紫外分光光度法

由于酸性條件下煙堿水溶液在259 nm處具有最強紫外吸收，且吸光度與溶液濃度成正比。Willits等于1950年開發(fā)了紫外分光光度法檢測煙堿粗提液濃度的檢測方法，目前該法依舊用于工業(yè)檢測［18］。王奕等［19］和陳麗金［20］均通過鹽酸吸收蒸餾出的煙堿水蒸氣，定容后在236 nm、259 nm和282 nm處分別測定吸光度，采用三點矯正法即可計算出煙堿溶液在259 nm的吸光度，進而測定煙堿含量。紫外分光光度法操作簡單，檢測時間短，能夠快速評價煙堿的提取效果。缺點是容易受到與煙堿有相似紫外吸收光譜的植物堿、植物色素等干擾，精確度不高，僅適用于煙堿水蒸氣中煙堿的檢測。

2．2 絡(luò)合分光光度法

煙堿可與一些化合物產(chǎn)生有色絡(luò)合物，與傳統(tǒng)紫外分光光度法相比，將絡(luò)合物萃取后進行分光光度測定，可以有效減少干擾，提高靈敏度和準(zhǔn)確度。常用的絡(luò)合試劑是甲基橙，煙堿與甲基橙在pH=5時形成黃色絡(luò)合物，經(jīng)氯仿或二氯甲烷萃取后，在420 nm處測定其吸光度從而測定煙草中煙堿的含量［21，22］。該檢測方法迅速簡便，靈敏度與 LC-UV/PDA法相當(dāng)，可檢測常規(guī)煙草樣品，但所用萃取劑毒性較大。朱澤華等［23］采用碘化鉀為絡(luò)合試劑，利用二溴化尼古丁在淀粉存在的條件下和碘化鉀反應(yīng)生成藍色染料，成功測定了香煙、香煙煙霧、血樣和尿樣中的總煙堿和尼古丁含量，該法避免了有毒試劑的使用，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。此外，文獻［24］以高錳酸鉀為絡(luò)合劑測定了香煙中的煙堿含量;文獻［25］采用飽和苯胺及Br-SCN－作為雙絡(luò)合試劑，在458 nm處測定吸光度進而檢測了尿液中的尼古丁。

2．3 液相色譜法

與紫外分光光度法相比，液相色譜法(LC)的檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確，適用范圍更廣，已經(jīng)成為目前國內(nèi)外檢測實際樣品中煙堿含量最常用的方法。煙堿為二元弱堿，極性較強，液相色譜法一般采用反相C18柱或C8柱為固定相，極性有機溶劑/磷酸鹽或乙酸鹽緩沖液為流動相。由于煙堿在水溶液中以游離態(tài)的單質(zhì)子態(tài)和雙質(zhì)子態(tài)存在，易與色譜柱上殘余硅羥基的氫鍵鍵合，造成寬峰、拖尾等現(xiàn)象，通常需要添加三乙胺改善峰形［26，27］。另外，水相 pH 值的選擇對成功檢測煙堿尤為重要，pH=2.5～4.2［28－31］或pH=6.0 ～ 6.8［32，33］可以獲得較好的檢測結(jié)果。采用低pH值緩沖液時煙堿保留時間短，易形成對稱尖峰，但需注意與干擾組分吸收峰的重疊;而選用pH=6左右的緩沖液時，煙堿保留時間略長，與其他物質(zhì)分離良好，但拖尾現(xiàn)象較低pH值時嚴重。近年來發(fā)展起來的親水色譜(HILIC)，由于其可在極性固定相上采用含水的極性溶劑洗脫進而分離極性或離子化目標(biāo)物，流動相通常是高濃度的乙腈(60%～97%)/低濃度的水(40%～3%)，色譜柱具有低黏度和小背壓的優(yōu)點，在藥物分析、生物醫(yī)學(xué)和臨床分析方面的大量應(yīng)用引起了極大的關(guān)注［34］。Silva等［35］采用HILIC柱建立了室外公共區(qū)域三手煙中尼古丁含量的測定方法，流動相采用了乙腈-水(9∶1，v/v)，避免了緩沖液的使用，且無需添加三乙胺。

液相色譜法檢測煙堿常用的檢測器為紫外可見光檢測器(UV/PDA)和質(zhì)譜檢測器(MSD)。LCUV/PDA法應(yīng)用最廣，已成功用于檢測煙葉、煙草制品、尿液、血漿等樣品中的煙堿含量，該法操作簡單，重現(xiàn)性好，適用于大量常規(guī)樣品的分析;缺點是對樣品要求較高，樣品前處理耗時長。Wang等［36］采用高通量動態(tài)微波輔助提取(HTDMAE)裝置聯(lián)用SPE法處理新鮮蘑菇中的煙堿，后采用LC-UV法檢測，檢出限為5.6 μg/kg，遠低于歐洲食品安全局(EFSA)對蘑菇中尼古丁最大殘余量36 μg/kg的要求。該方法可在9 min內(nèi)同時處理20個樣品，檢測迅速，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為LC-UV法分析復(fù)雜固體樣品中煙堿含量的參考方案。LC-MS/MS法既具有液相色譜的高分離效能，又有著質(zhì)譜的高定性能力，被廣泛用于代謝組學(xué)研究，與其他技術(shù)相比，具有更高的靈敏度和代謝物覆蓋率。Siskos等［37］通過LC-MS/MS測量人體血清和血漿中的189種代謝物，精密度小于20%。該法大大降低了樣品前處理的要求，尤其適用于生物樣品中煙堿的含量測定［38－44］。Marclay 等［45］利用 HILIC-MS 法成功檢測了72個尿樣中的尼古丁和4種主要代謝產(chǎn)物的含量，樣品只需要經(jīng)過液液萃取(LLE)即可進行檢測，檢出限為500 pg/mL，該法已用于調(diào)查2009年冰球世界錦標(biāo)賽期間運動員的吸煙情況。Abu-Awwad等［46］采用LC-MS法分別測定了人體血漿、精液和精子中尼古丁、可替寧和尼古丁N-氧化物的含量。此外，LC-MS/MS法還可用于檢測電子煙液［47－49］中的煙堿。Aszyk 等［50］開發(fā)了一種以環(huán)磷酰胺為內(nèi)標(biāo)物的LC-MS/MS方法，該方法用于同時測定電子香煙液體中的煙堿和42種調(diào)味化合物，檢出限范圍在1～148 μg/L，為規(guī)范和監(jiān)控電子香煙中的成分提供了便利。新的LC-MS/MS方法也用于測定普通煙草制品中的煙堿含量。Shifflett等［51］建立了一種超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法(UPLC-ESI-MS/MS)用于同時檢測新鮮煙葉及煙草相關(guān)化學(xué)制品中煙堿、茄尼醇和煙草特異性亞硝胺等14種物質(zhì)的含量，可獲得高分離效率和低檢出限。LC-MS/MS法精密度高，檢測時間短，但由于操作復(fù)雜，成本高昂，應(yīng)用受到一定限制。

2．4 氣相色譜法

氣相色譜法(GC)以氣體為流動相，快速傳遞樣品，使樣品組分瞬間完成分離，是檢測煙草及卷煙煙氣中煙堿的常規(guī)方法，也用于生物樣品(如血漿、尿液、頭發(fā))中煙堿的檢測。氫火焰離子化檢測器(FID)、氮磷檢測器(NPD)和質(zhì)譜檢測器(MSD)是目前氣相色譜法檢測煙堿常用的檢測器。

GC-FID法響應(yīng)快、成本較低、靈敏度足以分析大多數(shù)煙草樣品中的尼古丁。國標(biāo)GB/T 23355-2009規(guī)定以高純氮氣或氦氣為載氣、正十七烷或喹哪啶為內(nèi)標(biāo)物、異丙醇為萃取劑，測定卷煙煙氣總粒相物中煙堿的含量。此外，中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 246-2008同樣采用GC-FID法測定煙草及煙草制品中的煙堿含量，規(guī)定以氦氣或高純氫氣為載氣，以喹啉為內(nèi)標(biāo)物，以甲基-丁基醚為萃取劑;或以正十七烷或喹哪啶為內(nèi)標(biāo)物，以正己烷為萃取劑。采用 GC-FID 法檢測頭發(fā)［52］、尿液［53］、戒煙保健品［54］及電子煙煙液［55，56］中的煙堿也屢見報道，該方法具有分析時間短，結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，但樣品前處理較為復(fù)雜。

GC-NPD較GC-FID增加了一個熱離子源(由銣鹽珠構(gòu)成)，對含氮和含磷化合物的離子化效率大為提高。GC-NPD法目前集中用于檢測煙草中的煙堿，由于對含氮化合物具有強選擇性，因此可同時測定煙草中的多種生物堿，具有分離效率高、檢測速度快等特點。Yang等［57］對已有的GC-NPD法進行優(yōu)化，可同時測定新鮮煙葉或烤煙葉中包括煙堿在內(nèi)的5種生物堿含量，該方法被證明適用于煙草樣品中生物堿的常規(guī)分析。

GC-MS法基于質(zhì)譜的高定性能力，較前兩種方法更為靈敏，樣品前處理簡單，已經(jīng)逐步取代GCFID/NPD法在檢測煙草樣品中煙堿含量的應(yīng)用［58－61］。師君麗等［62］采用 GC-MS 法同時測定香煙、白肋煙和烤煙樣品中8種生物堿的含量，選擇性好、回收率高，適用于同時測定煙草中含量差別大且有些含量低微的生物堿。此外，GC-MS法也用于血漿中煙堿含量的測定。20世紀(jì)末，已有國外學(xué)者以索氏提取法為樣品前處理手段，采用GC-MS法檢測人體血漿中的尼古丁，檢出限低，但精密度受濃度影響波動較大［63］。近年來，國內(nèi)學(xué)者分別以二苯胺［64］或茴香腦［65］為內(nèi)標(biāo)物建立了檢測鼠類血漿中煙堿含量的GC-MS法，探究尼古丁在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點。該法特異性強、操作簡便、精密度好。隨著安全意識的不斷提高，人們逐漸重視非煙草類植物及水中的煙堿含量。Lozano等［66］分別采用LC-MS法和GC-MS/MS法檢測蘑菇中的尼古丁，檢出限為 0.7 μg/kg。Dobrowska 等［67］建立了一種LLE-GC/MS的方法檢測自來水、廢水和唾液中的煙堿含量。通過液液萃取富集樣品中的煙堿，以萘為內(nèi)標(biāo)物，精確、簡便地檢測煙堿，檢出限為2.6 μg/L。Moldoveanu 等［68］應(yīng)用 GC-MS/MS 方法測定了煙堿含量在十億分之幾范圍內(nèi)的茄科和其他幾種常見蔬菜中的煙堿水平，檢測到的最小含量為1.9 ng/g(干基計)。GC-MS法具有極低的檢出限，操作簡單，成本低于LC-MS/MS法，是分析含有痕量尼古丁且基質(zhì)復(fù)雜樣品的首選檢測方法。

隨著聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，氣相色譜耦合離子阱質(zhì)譜檢測(GC-IT-MS)和二維氣相色譜-氮化學(xué)發(fā)光檢測器(GC×GC-NCD)分別用于屋塵中有機氮致癌物的測定，包括尼古丁、4種芳香胺、2種硝基化合物、8種N-亞硝胺和2種煙草特有的亞硝胺［69］。實驗證明，對于衍生化的芳族胺，GC-IT-MS有更高的選擇性和靈敏度;而GC×GC-NCD的優(yōu)勢在于不需要衍生化即可確定這些不同種類致癌物的含量。

2．5 毛細管電泳法

20世紀(jì) 80年代，Jorgenson等［70］報道了使用毛細管區(qū)帶電泳法分離氨基酸和多肽的研究。與LC-UV/PDA法相比，毛細管電泳法具有樣品用量少、快速、高效等特點，但由于其毛細管直徑小，光路太短，采用紫外檢測時其靈敏度較低，另外電滲流現(xiàn)象也會影響其分離的重現(xiàn)性。［71，72］。

目前，毛細管電泳法用于煙堿含量的測定主要集中于煙草及煙堿制品，隨著多種高分離效率并高靈敏度的檢測器在毛細管電泳中的應(yīng)用，未來有望實現(xiàn)在更多樣品中的檢測。Marsh等［73］分別采用微乳液毛細管電動色譜、非水毛細管電泳和自由溶液毛細管電泳測定了尼古丁錠劑中的煙堿和5種相關(guān)生物堿的含量，3種方法均能成功地對6種目標(biāo)物進行定性定量分析，且測定結(jié)果與高效液相色譜結(jié)果一致。趙利敏等［74］建立了一種毛細管電泳-電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用方法檢測煙草中的尼古丁，檢出限為0.5 μg/L，高于 UV檢測器的靈敏度。Lochmann等［75］采用毛細管電泳-紫外檢測法直接測定煙草植物表皮細胞內(nèi)的煙堿、去甲煙堿和赤蘚紅素，檢出限為0.013 pmol，該法簡化了樣品前處理步驟，可快速準(zhǔn)確地測定煙草中的煙堿含量。近年來，毛細管電泳通過與高靈敏度的檢測器聯(lián)用，檢出限可以控制在μg/L水平。對于較復(fù)雜的煙堿樣品來說，毛細管電泳法在簡化樣品前處理而不影響檢測效果方面具有明顯優(yōu)勢。

2．6 電化學(xué)法

電化學(xué)分析法是以電化學(xué)原理為基礎(chǔ)，利用被分析溶液的組成及含量與其電化學(xué)性質(zhì)相對應(yīng)而建立起來的一類分析方法。該方法檢測過程簡便迅速，便于自動化，在微量分析、動態(tài)分析等領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展前景。電極改性劑是影響電化學(xué)感應(yīng)器性能的關(guān)鍵因素，目前已有多種電極改性劑被應(yīng)用于尼古丁電化學(xué)傳感器的制作，主要有氧化石墨烯(RO)修飾電極［76］、還原氧化石墨烯(RGO)修飾電極［77，78］和碳糊(CPE) 修飾電極［79，80］。RO 制作方法成熟，具有較高的比表面積，表面豐富的官能團使其可與金屬鹽形成穩(wěn)定復(fù)合物以增強催化性能和靈敏度，但還未有檢測實際樣品的報道;RGO經(jīng)金納米粒子修飾后用于香煙及戒煙咀嚼片中煙堿含量的測定，樣品前處理簡單，檢出限為 0.015～0.12 μmol/L，缺點是RGO容易發(fā)生不可逆的自發(fā)團聚從而降低修飾電極性能，常采用涂層法增強穩(wěn)定性;CPE經(jīng)納米碳管或Nano-TiO2修飾后不僅可以檢測香煙中的煙堿，還可檢測生物樣品(尿液、血漿)中的尼古丁含量，檢出限為0.01 μmol/L。電化學(xué)法裝置簡單，成本低廉，檢測方法迅速直接，基本不需要有機溶劑，可作為綠色煙堿分析方法，但不適用于批量煙堿樣品的檢測。

3 結(jié)論和展望

煙堿作為評價煙草及其制品的重要指標(biāo)，其在煙草樣品中的檢測技術(shù)由來已久且已趨于成熟。近年來，隨著電子煙的興起以及人們對食品和環(huán)境中煙堿安全性的重視，煙堿含量測定有了新的條件和要求。液相色譜法作為最經(jīng)典的煙堿檢測方法，基本可以滿足包括煙草、煙堿制劑、血漿、尿樣在內(nèi)的常規(guī)樣品的檢測。氣相色譜法作為測定煙氣總粒相物中煙堿含量的標(biāo)準(zhǔn)方法，與質(zhì)譜聯(lián)用適用于樣品前處理復(fù)雜、對靈敏度要求極高的情況。毛細管電泳法可與多種檢測器匹配，未來可發(fā)展為檢測生物樣品中煙堿含量的綠色方法。煙堿檢測手段不斷發(fā)展和完善的同時，依然存在著一些問題，例如樣品前處理中大量溶劑的使用、高靈敏度檢測器帶來的高成本和裝置復(fù)雜的問題，因此，未來需要發(fā)展更加綠色、精簡、成本低的煙堿檢測方法。