盧霄，姚宸維，何佳蓉，楊艷芳

（1.華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640；2.上海貝奧路生物材料有限公司，上海 201114）

石墨烯（Graphene）是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成六角型呈蜂巢晶格的二維碳納米材料，具有優(yōu)異的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)特性。氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）是石墨烯改性的代表衍生物之一，通過氧化石墨還原法將天然石墨與強(qiáng)酸和強(qiáng)氧化物反應(yīng)而制成，在材料學(xué)、微納加工、能源、生物醫(yī)學(xué)和藥物傳遞等方面具有重要的應(yīng)用前景[1-2]。目前對(duì)石墨烯和GO的相關(guān)研究表明，GO具有良好的生物相容性，細(xì)胞毒性低，人體細(xì)胞可在其上附著和增殖[3-7]。對(duì)生物陶瓷與石墨烯塊體復(fù)合材料的研究（碳化鈦/石墨烯塊體復(fù)合材料、碳納米管/石墨烯塊體復(fù)合材料、氧化鋁/石墨烯塊體復(fù)合材料等）表明，石墨烯可顯著提高陶瓷塊體復(fù)合材料的電學(xué)性能和機(jī)械性能及明顯的補(bǔ)強(qiáng)增韌作用[8-10]。另外，對(duì)于羥基磷灰石（HA）與石墨烯復(fù)合制成生物涂層或復(fù)合薄膜的研究表明，石墨烯可促進(jìn)細(xì)胞的黏附、伸展和增殖[11-13]。β-磷酸三鈣（β-Tricalcium phosphate，β-TCP）生物陶瓷是以β-TCP粉體為原料，經(jīng)加工成形、高溫?zé)Y(jié)成的生物陶瓷，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)作用，其新型的內(nèi)連接結(jié)構(gòu)可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖，而且能在體內(nèi)被降解吸收[14-17]。鑒于石墨烯和β-TCP生物陶瓷各自具有以上特性，為了增加β-TCP生物陶瓷在韌性、細(xì)胞增殖等方面的性能，本文將GO與β-TCP生物陶瓷相結(jié)合生產(chǎn)出一種GO復(fù)合生物陶瓷，旨在研究GO對(duì)β-TCP生物陶瓷的細(xì)胞毒性的影響。為GO促進(jìn)β-TCP生物陶瓷的性能以及在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的生物安全性提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1%GO懸濁液（片徑1～5μm，厚度＜2.5 nm，pH值5～6）為唐山建華科技發(fā)展有限責(zé)任公司產(chǎn)品，β-TCP粉體（純度≥95%，鈣磷原子比為1.50±0.02，粒度0.1～5.0μm）為上海貝奧路生物材料有限公司產(chǎn)品，L929小鼠成纖維細(xì)胞為中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心產(chǎn)品，胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。

1.2 材料制備

1.2.1 β-TCP生物陶瓷制備

通過注漿成型將β-TCP陶瓷漿液灌入模具，干燥坯體，以5℃/min升溫至220℃保溫16 h，再以0.5℃/min升溫至260℃保溫7 h，最后以0.5℃/min升溫至290℃保溫30 min消除有機(jī)物氣化（Carbolite），以5℃/min升溫至1 100℃保溫3 h燒結(jié)（Nabertherm），即可獲得純?chǔ)?TCP生物陶瓷。

1.2.2 0.1%GO復(fù)合生物陶瓷制備

將1%GO懸濁液和β-TCP粉體按1∶9.99混合，通過注漿成型將GO復(fù)合生物陶瓷漿液灌入模具，干燥坯體，以5℃/min升溫至220℃保溫16 h，再以0.5℃/min升溫至260℃保溫7 h，最后以0.5℃/min升溫至290℃保溫30 min進(jìn)行氣化（Carbolite），在氬氣保護(hù)下以2℃/min升溫至1 100℃保溫3 h燒結(jié)（上海晨華電爐有限公司），即獲得GO復(fù)合生物陶瓷。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 浸提液制備

樣本分為6組（A～G組），分別為0.1%GO/TCP陶瓷、TCP陶瓷、1%、0.1%、0.01%、0.001%GO懸濁液和空白對(duì)照加相應(yīng)體積的DMEM，將以下液體一同置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。所有浸提液及稀釋液均用0.22μm的過濾器過濾后備用。

1.3.2 細(xì)胞毒性

在96孔培養(yǎng)板內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿約有105個(gè)細(xì)胞并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后加入浸提液，培養(yǎng)24 h后，用5 g/L噻唑藍(lán)（MTT）方法測(cè)試細(xì)胞毒性，在酶標(biāo)儀570 nm和630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，A組的相對(duì)增殖率為103.9%，B組的相對(duì)增殖率為109.77%，1%、0.1%、0.01%GO懸濁液浸提液樣品的細(xì)胞相對(duì)增殖率先隨濃度降低而逐漸增加，分別為114.43%、118.37%、120.58%，但在0.001%濃度條件下，細(xì)胞相對(duì)增殖率下降為106.32%。以上各組結(jié)果均顯示細(xì)胞毒性結(jié)果為0級(jí)。

2.2 討論

石墨烯具備較好的電學(xué)、力學(xué)和熱學(xué)等性能，在眾多領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。石墨烯及其衍生物的細(xì)胞毒性是石墨烯生物安全性評(píng)估的重要指標(biāo)之一，大量研究表明石墨烯的細(xì)胞毒性與化學(xué)結(jié)構(gòu)、尺寸大小、細(xì)胞類型、劑量、暴露的時(shí)間等因素有關(guān)。劉浩懷等對(duì)GO的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)GO質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，細(xì)胞的相對(duì)存活率仍接近100%，說明GO細(xì)胞毒性較低[2]。

關(guān)淑英等對(duì)絲素-氧化石墨烯復(fù)合膜（SF-GO）的細(xì)胞毒性做了研究。采用MTT比色法檢測(cè)含有不同濃度GO（0.1wt%、0.2wt%、0.5wt%、1.0wt%）制成的SF-GO復(fù)合膜在不同時(shí)期（1、3、5、7 d）對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除GO濃度為1.0wt%時(shí)在1、3 d細(xì)胞毒性為2外，其余各組細(xì)胞毒性為0、1，表明濃度為0.1wt%、0.2wt%、0.5wt%的GO無細(xì)胞毒性。濃度為1.0wt%的GO有輕度細(xì)胞毒性[19]。

近年來還有許多陶瓷與石墨烯塊體復(fù)合材料的研究，制備GNPs/BCP復(fù)合材料，當(dāng)GNPs添加量為1.5wt%時(shí)，復(fù)合材料具有最高的彎曲強(qiáng)度和斷裂韌性，分別達(dá)到151.82 MPa和1.74 MPa·m1/2，與相同條件下制備的純BCP陶瓷相比，分別提高了55%和76%[10]。另有研究用MTT法測(cè)試了所制備的純BCP、GNPs/BCP、Graphene/BCP、CNTs/BCP和Graphene/CNTs/BCP五種復(fù)合材料的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示所有材料的細(xì)胞毒性級(jí)數(shù)均為0～1級(jí)，材料周圍和表面的成骨細(xì)胞形態(tài)正常，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞可在材料表面黏附、伸展和增殖，復(fù)合材料均無細(xì)胞毒性[20]。

MTT比色法是評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的一種常用方法，當(dāng)細(xì)胞相對(duì)增殖率高于75%時(shí)即可初步認(rèn)定該材料無毒。本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法測(cè)試，通過比較L929小鼠成纖維細(xì)胞在各浸提液分組中的相對(duì)增殖率來評(píng)價(jià)GO的細(xì)胞毒性。從A組到F組的細(xì)胞相對(duì)增殖率都大于100%，說明該GO復(fù)合生物陶瓷無明顯細(xì)胞毒性，生物陶瓷與GO之間具有濃度依賴性，而且具有良好的生物相容性。

3 結(jié)論

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)可見，各組細(xì)胞增殖較空白對(duì)照組效果均不明顯，因此得出GO對(duì)β-TCP生物陶瓷的細(xì)胞毒性無影響。石墨烯及其衍生物、陶瓷與石墨烯塊體復(fù)合材料的生物安全性研究已經(jīng)積累了一定的基礎(chǔ)，但由于其制備方法的多樣性和生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，它們的生物安全性問題仍不能簡(jiǎn)單歸納得出結(jié)論，還需要綜合多方面的因素進(jìn)行深入研究。

[1]田甜,呂敏,田旸,等.石墨烯的生物安全性研究進(jìn)展[J].科學(xué)通報(bào),2014,59(20):1927-1936.

[2]劉浩懷,劉力飛,盧嘉明,等.石墨烯及其衍生物的抗菌性研究進(jìn)展[J].中國(guó)測(cè)試,2015,41(3):8-13.

[3]李婷,張超智,沈丹,等.石墨烯和氧化石墨烯的生物體毒性研究進(jìn)展[J].南京大學(xué)學(xué)報(bào),2016,52(2):235-243.

[4]沈賀,張立明,張智軍.石墨烯在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,30(1):218-223.

[5]惠麗偉,樸寄綱,Jeffrey Auletta,等.氧化石墨烯的表面可吸附性決定其抗菌活性和細(xì)胞毒性[C]//.中國(guó)化學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì),2014.

[6]Zhang X,Yang R,Wang C,et al.Cell Biocompatibility of Functionalized GrapheneOxide[J].ActaPhysico-Chimica Sinica,2012,28(6):1520-1524.

[7]徐宏楊,范敏敏,張志榮,等.氧化石墨烯PEG化后對(duì)L929細(xì)胞毒性的影響[J].華西藥學(xué)雜志,2015,30(4):425-427.

[8]李建林,陳彬彬,章文,等.陶瓷/石墨烯塊體復(fù)合材料的研究進(jìn)展[J].無機(jī)材料學(xué)報(bào),2014,29(3):225-236.

[9]帥詞俊,彭淑平,高成德,等.利用石墨烯強(qiáng)韌化生物陶瓷材料及其人工骨的制備方法[P].中國(guó):CN201210358185.4,2014-03-26.

[10]趙琰,畢見強(qiáng),程福明,等.不同分散劑制備的石墨烯納米片/雙相磷酸鈣生物復(fù)合材料及其力學(xué)性能研究[J].人工晶體學(xué)報(bào),2013(5):927-932.

[11]劉奕,黃晶,李華.真空冷噴涂制備羥基磷灰石-石墨烯納米復(fù)合生物涂層及其表界面特性研究.中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)大會(huì),2013.

[12]曾永香,賀瑞,裴錫波,等.電沉積制備氧化石墨烯-羥基磷灰石復(fù)合涂層[J].稀有金屬材料與工程,2016(3):727-731.

[13]馬海冰,邰志新,孫東飛,等.聚乳酸/納米羥基磷灰石/氧化石墨烯納米復(fù)合膜的制備及生物性能研究[J].材料導(dǎo)報(bào),2011,25(10):19-22.

[14]Zhen Wang,Zheng Guo,HuaBai,et al.Clinical Evaluation of β-TCP in the Treatment of Lacunar Bone Defects: A Prospective,Randomized Controlled Study[J].Materials Science & Engineering C Materials for Biological Applications,2013,33(4):1894-1899.

[15]強(qiáng)輝,王坤正,張明宇,等.β-磷酸三鈣復(fù)合成骨細(xì)胞的異位成骨[J].中國(guó)組織工程研究,2009,13(12):2300-2304.

[16]史定偉,朱振安,戴尅戌,等.多孔磷酸三鈣修復(fù)骨缺損的臨床觀察[J].國(guó)際骨科學(xué)雜志,2003,24(4):241-242.

[17]Jianxi Lu,Michel Descamps,Jacques Dejou,et al.The Biodegradation Mechanism of Calcium Phosphate Biomaterials in Bone[J].Journal of Biomedical Materials Research,2002,63(4):408-412.

[18]王彥偉,蔡舒,彭珍珍,等.多孔β-TCP生物材料的制備及其細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)[J].稀有金屬材料與工程,2005,34(2):1177-1180.

[19]關(guān)淑英,武峰,趙彬.MTT法檢測(cè)氧化石墨烯的細(xì)胞毒性[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2014,52(17):18-20.

[20]趙琰.石墨烯/碳納米管/雙相磷酸鈣生物陶瓷復(fù)合材料研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2013.