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        GO/β-TCP復(fù)合生物陶瓷的細(xì)胞毒性研究

        2018-03-28 15:00:36盧霄姚宸維何佳蓉楊艷芳
        生物化工 2018年1期
        關(guān)鍵詞:復(fù)合材料生物研究

        盧霄,姚宸維,何佳蓉,楊艷芳

        (1.華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640;2.上海貝奧路生物材料有限公司,上海 201114)

        石墨烯(Graphene)是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成六角型呈蜂巢晶格的二維碳納米材料,具有優(yōu)異的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)特性。氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)是石墨烯改性的代表衍生物之一,通過氧化石墨還原法將天然石墨與強(qiáng)酸和強(qiáng)氧化物反應(yīng)而制成,在材料學(xué)、微納加工、能源、生物醫(yī)學(xué)和藥物傳遞等方面具有重要的應(yīng)用前景[1-2]。目前對(duì)石墨烯和GO的相關(guān)研究表明,GO具有良好的生物相容性,細(xì)胞毒性低,人體細(xì)胞可在其上附著和增殖[3-7]。對(duì)生物陶瓷與石墨烯塊體復(fù)合材料的研究(碳化鈦/石墨烯塊體復(fù)合材料、碳納米管/石墨烯塊體復(fù)合材料、氧化鋁/石墨烯塊體復(fù)合材料等)表明,石墨烯可顯著提高陶瓷塊體復(fù)合材料的電學(xué)性能和機(jī)械性能及明顯的補(bǔ)強(qiáng)增韌作用[8-10]。另外,對(duì)于羥基磷灰石(HA)與石墨烯復(fù)合制成生物涂層或復(fù)合薄膜的研究表明,石墨烯可促進(jìn)細(xì)胞的黏附、伸展和增殖[11-13]。β-磷酸三鈣(β-Tricalcium phosphate,β-TCP)生物陶瓷是以β-TCP粉體為原料,經(jīng)加工成形、高溫?zé)Y(jié)成的生物陶瓷,具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)作用,其新型的內(nèi)連接結(jié)構(gòu)可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖,而且能在體內(nèi)被降解吸收[14-17]。鑒于石墨烯和β-TCP生物陶瓷各自具有以上特性,為了增加β-TCP生物陶瓷在韌性、細(xì)胞增殖等方面的性能,本文將GO與β-TCP生物陶瓷相結(jié)合生產(chǎn)出一種GO復(fù)合生物陶瓷,旨在研究GO對(duì)β-TCP生物陶瓷的細(xì)胞毒性的影響。為GO促進(jìn)β-TCP生物陶瓷的性能以及在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的生物安全性提供參考。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1%GO懸濁液(片徑1~5μm,厚度<2.5 nm,pH值5~6)為唐山建華科技發(fā)展有限責(zé)任公司產(chǎn)品,β-TCP粉體(純度≥95%,鈣磷原子比為1.50±0.02,粒度0.1~5.0μm)為上海貝奧路生物材料有限公司產(chǎn)品,L929小鼠成纖維細(xì)胞為中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心產(chǎn)品,胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。

        1.2 材料制備

        1.2.1 β-TCP生物陶瓷制備

        通過注漿成型將β-TCP陶瓷漿液灌入模具,干燥坯體,以5℃/min升溫至220℃保溫16 h,再以0.5℃/min升溫至260℃保溫7 h,最后以0.5℃/min升溫至290℃保溫30 min消除有機(jī)物氣化(Carbolite),以5℃/min升溫至1 100℃保溫3 h燒結(jié)(Nabertherm),即可獲得純?chǔ)?TCP生物陶瓷。

        1.2.2 0.1%GO復(fù)合生物陶瓷制備

        將1%GO懸濁液和β-TCP粉體按1∶9.99混合,通過注漿成型將GO復(fù)合生物陶瓷漿液灌入模具,干燥坯體,以5℃/min升溫至220℃保溫16 h,再以0.5℃/min升溫至260℃保溫7 h,最后以0.5℃/min升溫至290℃保溫30 min進(jìn)行氣化(Carbolite),在氬氣保護(hù)下以2℃/min升溫至1 100℃保溫3 h燒結(jié)(上海晨華電爐有限公司),即獲得GO復(fù)合生物陶瓷。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 浸提液制備

        樣本分為6組(A~G組),分別為0.1%GO/TCP陶瓷、TCP陶瓷、1%、0.1%、0.01%、0.001%GO懸濁液和空白對(duì)照加相應(yīng)體積的DMEM,將以下液體一同置于37℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。所有浸提液及稀釋液均用0.22μm的過濾器過濾后備用。

        1.3.2 細(xì)胞毒性

        在96孔培養(yǎng)板內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿約有105個(gè)細(xì)胞并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,然后加入浸提液,培養(yǎng)24 h后,用5 g/L噻唑藍(lán)(MTT)方法測(cè)試細(xì)胞毒性,在酶標(biāo)儀570 nm和630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[18]。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        結(jié)果表明,A組的相對(duì)增殖率為103.9%,B組的相對(duì)增殖率為109.77%,1%、0.1%、0.01%GO懸濁液浸提液樣品的細(xì)胞相對(duì)增殖率先隨濃度降低而逐漸增加,分別為114.43%、118.37%、120.58%,但在0.001%濃度條件下,細(xì)胞相對(duì)增殖率下降為106.32%。以上各組結(jié)果均顯示細(xì)胞毒性結(jié)果為0級(jí)。

        2.2 討論

        石墨烯具備較好的電學(xué)、力學(xué)和熱學(xué)等性能,在眾多領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。石墨烯及其衍生物的細(xì)胞毒性是石墨烯生物安全性評(píng)估的重要指標(biāo)之一,大量研究表明石墨烯的細(xì)胞毒性與化學(xué)結(jié)構(gòu)、尺寸大小、細(xì)胞類型、劑量、暴露的時(shí)間等因素有關(guān)。劉浩懷等對(duì)GO的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)GO質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/L時(shí),細(xì)胞的相對(duì)存活率仍接近100%,說明GO細(xì)胞毒性較低[2]。

        關(guān)淑英等對(duì)絲素-氧化石墨烯復(fù)合膜(SF-GO)的細(xì)胞毒性做了研究。采用MTT比色法檢測(cè)含有不同濃度GO(0.1wt%、0.2wt%、0.5wt%、1.0wt%)制成的SF-GO復(fù)合膜在不同時(shí)期(1、3、5、7 d)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除GO濃度為1.0wt%時(shí)在1、3 d細(xì)胞毒性為2外,其余各組細(xì)胞毒性為0、1,表明濃度為0.1wt%、0.2wt%、0.5wt%的GO無細(xì)胞毒性。濃度為1.0wt%的GO有輕度細(xì)胞毒性[19]。

        近年來還有許多陶瓷與石墨烯塊體復(fù)合材料的研究,制備GNPs/BCP復(fù)合材料,當(dāng)GNPs添加量為1.5wt%時(shí),復(fù)合材料具有最高的彎曲強(qiáng)度和斷裂韌性,分別達(dá)到151.82 MPa和1.74 MPa·m1/2,與相同條件下制備的純BCP陶瓷相比,分別提高了55%和76%[10]。另有研究用MTT法測(cè)試了所制備的純BCP、GNPs/BCP、Graphene/BCP、CNTs/BCP和Graphene/CNTs/BCP五種復(fù)合材料的細(xì)胞毒性,結(jié)果顯示所有材料的細(xì)胞毒性級(jí)數(shù)均為0~1級(jí),材料周圍和表面的成骨細(xì)胞形態(tài)正常,貼壁生長(zhǎng)良好,細(xì)胞可在材料表面黏附、伸展和增殖,復(fù)合材料均無細(xì)胞毒性[20]。

        MTT比色法是評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的一種常用方法,當(dāng)細(xì)胞相對(duì)增殖率高于75%時(shí)即可初步認(rèn)定該材料無毒。本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法測(cè)試,通過比較L929小鼠成纖維細(xì)胞在各浸提液分組中的相對(duì)增殖率來評(píng)價(jià)GO的細(xì)胞毒性。從A組到F組的細(xì)胞相對(duì)增殖率都大于100%,說明該GO復(fù)合生物陶瓷無明顯細(xì)胞毒性,生物陶瓷與GO之間具有濃度依賴性,而且具有良好的生物相容性。

        3 結(jié)論

        根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)可見,各組細(xì)胞增殖較空白對(duì)照組效果均不明顯,因此得出GO對(duì)β-TCP生物陶瓷的細(xì)胞毒性無影響。石墨烯及其衍生物、陶瓷與石墨烯塊體復(fù)合材料的生物安全性研究已經(jīng)積累了一定的基礎(chǔ),但由于其制備方法的多樣性和生物系統(tǒng)的復(fù)雜性,它們的生物安全性問題仍不能簡(jiǎn)單歸納得出結(jié)論,還需要綜合多方面的因素進(jìn)行深入研究。

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