劉茜桐，田莉，解晉琳，師娟子

(西北婦女兒童醫(yī)院，西安 710003)

輔助生殖領(lǐng)域中，胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)已廣泛應(yīng)用于篩查整倍體胚胎，改善妊娠結(jié)局。近年，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)方法的改進(jìn)，可以對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行全染色體的篩查，因此，嵌合體胚胎的診斷率提高。但是，關(guān)于嵌合體胚胎的文獻(xiàn)報(bào)道較少，本文就嵌合體胚胎的發(fā)生機(jī)制、發(fā)生率，以及移植后臨床結(jié)局做一綜述。

一、嵌合體胚胎的發(fā)生機(jī)制

嵌合體胚胎包含兩種及以上不同染色體成分的細(xì)胞系，是因減數(shù)分裂中染色體分離錯(cuò)誤所致。在兩細(xì)胞期就可以出現(xiàn)嵌合體，但是臨床上多見于在囊胚期進(jìn)行滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢，因?yàn)樵谶@一時(shí)期可以活檢的細(xì)胞數(shù)更多[1]。滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢是否能代表整個(gè)胚胎受諸多因素影響，例如嵌合的類型和程度、活檢細(xì)胞數(shù)量、活檢部位，以及操作方法等。種植前遺傳學(xué)診斷國(guó)際協(xié)會(huì)(PGDIS)規(guī)定異常細(xì)胞占比20%～80%為嵌合體胚胎，>80%為非整倍體胚胎，<20%為整倍體胚胎。染色體嵌合導(dǎo)致染色體增加和/或丟失主要有三種機(jī)制：染色體不分離、后期延遲和核內(nèi)復(fù)制。

1. 染色體不分離：染色體不分離是姐妹染色單體在有絲分裂過程中沒有分離。因此整個(gè)染色體(包括兩條染色單體)被牽引到一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致一個(gè)細(xì)胞是單體性而另一個(gè)細(xì)胞是三體性。如果不分離發(fā)生在細(xì)胞分化之前，例如在種植前的胚胎，將形成普遍嵌合。如果不分離發(fā)生在分化之后，例如滋養(yǎng)層，胎盤將包含嵌合細(xì)胞系，而胚胎可以是整倍體。

種植前染色體不分離的概率無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，主要和發(fā)育的階段和涉及的染色體有關(guān)。例如，導(dǎo)致常染色體第一次和第二次減數(shù)分裂形成非整倍體的機(jī)制和染色體不分離的可能性最小，但是染色體不分離卻是性染色體在第一次卵裂期分裂中的主要機(jī)制。因此，染色體在不同發(fā)育階段對(duì)不分離的敏感性不同。

2.后期延遲：后期延遲是有絲分裂后期，單個(gè)染色單體沒有進(jìn)入子代細(xì)胞核隨后丟失，導(dǎo)致一個(gè)細(xì)胞里該染色體是單體性而另一個(gè)細(xì)胞里是二體性。如果染色單體沒有附著于紡錘體，或者染色單體雖然附著于紡錘體但是后來沒有進(jìn)入細(xì)胞核，即為后期延遲。如果后期延遲發(fā)生在分化前，將包含兩種細(xì)胞系，導(dǎo)致普遍嵌合。如果后期延遲發(fā)生在分化后的滋養(yǎng)層細(xì)胞，胎盤將包含正常和單體性細(xì)胞系，例如限制性胎盤嵌合體(confined placental mosaicism，CPM)。

Loannou等[2]利用丟棄的第5天的胚胎進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)單體性發(fā)生率是三體性的7倍。這一發(fā)現(xiàn)提示后期延遲是人類種植前胚胎嵌合體的主要原因。Coonen等[3]和Capalbo等[4]發(fā)現(xiàn)后期延遲比不分離的發(fā)生率高3～5倍。

3. 核內(nèi)復(fù)制：核內(nèi)復(fù)制是有絲分裂后，子代細(xì)胞內(nèi)某一條或幾條染色體再次發(fā)生復(fù)制，導(dǎo)致一個(gè)細(xì)胞里有三體性染色體而另一個(gè)細(xì)胞里是二體性染色體。染色體增加有兩種可能機(jī)制：一種是由于細(xì)胞周期功能障礙，一個(gè)染色體復(fù)制但是隨后沒有細(xì)胞質(zhì)分裂，另一種是有絲分裂開始后很快結(jié)束，導(dǎo)致染色體復(fù)制。無(wú)論發(fā)生機(jī)制如何，結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致一條染色體的增加。核內(nèi)復(fù)制又稱為多倍體。多倍體可以出現(xiàn)在血液、腸道、皮膚和大腦中[5]。

二、嵌合體胚胎發(fā)生率

既往研究報(bào)道胚胎嵌合體發(fā)生率不一，從30%到90%不等[5-6]，歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)指南(ESHRE)給出的嵌合體發(fā)生率為40%～60%。報(bào)道的差異可能和應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)有關(guān)。FISH技術(shù)可以檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，因此很多文獻(xiàn)應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。但是FISH技術(shù)本身存在局限性，例如需要細(xì)胞固定，該操作難以掌握，且方法多樣，部分方法出錯(cuò)率很高，并且診斷胚胎異常的標(biāo)準(zhǔn)不一[7]。檢測(cè)的材料對(duì)結(jié)果也有影響，如果檢測(cè)的是發(fā)育阻滯的胚胎，則出現(xiàn)嵌合體的幾率比形態(tài)正常的胚胎高。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境(溫度、pH值、培養(yǎng)液成分等)也會(huì)影響嵌合體胚胎的診斷。無(wú)論是卵裂期胚胎或囊胚應(yīng)用合適的FISH方法，嵌合體的檢出率都可控制在30%左右。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)、比較基因組雜交(aCGH)、定量PCR(qPCR)和二代測(cè)序(NGS)等分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)比FISH更具有優(yōu)勢(shì)，可以同時(shí)對(duì)24對(duì)染色體進(jìn)行檢測(cè)。但是由于對(duì)每個(gè)細(xì)胞都進(jìn)行檢測(cè)費(fèi)用昂貴，因此很少用于診斷胚胎是否為嵌合體。很多新的研究應(yīng)用全面染色體篩查(CCS)技術(shù)，通過囊胚活檢，一次活檢約5個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)整體進(jìn)行分析。由于正常細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞混合檢測(cè)，難以準(zhǔn)確診斷嵌合體。不同檢測(cè)方法得出卵裂期胚胎活檢嵌合體發(fā)生率在15%到75%[8-9]。

由于卵裂期胚胎嵌合體發(fā)生率高，目前學(xué)界傾向于對(duì)第5天或第6天囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)外胚層活檢，同時(shí)應(yīng)用CCS技術(shù)，對(duì)胚胎進(jìn)行更全面的評(píng)估[10]。囊胚期活檢的優(yōu)點(diǎn)在于比起卵裂期胚胎，可以活檢更多的細(xì)胞(大約5～10個(gè))，對(duì)非整倍體篩查更加全面。嵌合體囊胚的多細(xì)胞活檢容易檢出不同細(xì)胞系來源的細(xì)胞，單次活檢即可以做出診斷。文獻(xiàn)報(bào)道卵裂期嵌合體發(fā)生率最高，在15%～90%，囊胚活檢嵌合體發(fā)生率在3%～24%之間[11-13]。

和非整倍體不同，嵌合體發(fā)生率不會(huì)隨著年齡增大而增加，不同年齡的女性囊胚嵌合體發(fā)生率均約為30%。但是，由于高齡女性更容易出現(xiàn)減數(shù)分裂錯(cuò)誤，囊胚活檢細(xì)胞全部為整倍體細(xì)胞的幾率降低，文獻(xiàn)報(bào)道35歲以下的女性整倍體細(xì)胞占48.2%，42歲以上的女性僅占10.6%[7]。有絲分裂錯(cuò)誤導(dǎo)致嵌合體的發(fā)生，減數(shù)分裂錯(cuò)誤導(dǎo)致非整倍體發(fā)生，而有絲分裂錯(cuò)誤可伴隨減數(shù)分裂錯(cuò)誤從而導(dǎo)致胚胎嵌合體，因此對(duì)這部分人群可進(jìn)行胚胎植入前非整倍體篩查(PGS-A)。目前應(yīng)用非常廣泛的是NGS技術(shù)，由于測(cè)序深度和平臺(tái)的不同，檢測(cè)細(xì)胞的敏感性也不同，因此導(dǎo)致PGS-A的結(jié)果也可能出現(xiàn)不同。

三、如何檢測(cè)出嵌合體胚胎

NGS有多個(gè)平臺(tái)，檢測(cè)嵌合體的敏感性也不同。國(guó)際上最廣泛應(yīng)用的高分辨NGS(hr-NGS)方法是Illumina公司的VeriSeq PGS。利用MiSeq臺(tái)式測(cè)序儀，對(duì)短片段DNA序列進(jìn)行讀取。不需要對(duì)每一個(gè)染色體片段都進(jìn)行測(cè)序，為了降低檢測(cè)費(fèi)用，只需要同時(shí)檢測(cè)部分DNA“條形碼”，以判斷被檢測(cè)標(biāo)本是否為嵌合體[14]。hr-NGS可以檢測(cè)出異常細(xì)胞占20%～80%的嵌合體，由于每個(gè)囊胚平均活檢5～10個(gè)細(xì)胞，hr-NGS可以檢測(cè)出1/5(20%)至4/5(80%)的嵌合性。但是，也有觀點(diǎn)質(zhì)疑hr-NGS診斷嵌合體的準(zhǔn)確性。有研究認(rèn)為hr-NGS不能區(qū)別低比例嵌合和背景噪音[15]，還有觀點(diǎn)認(rèn)為嵌合體檢測(cè)存在缺陷，如果三體和單體細(xì)胞數(shù)目相等，檢測(cè)結(jié)果將會(huì)是整倍體[16]。但是一項(xiàng)初步研究[17]通過對(duì)同一胚胎進(jìn)行多次活檢，然后應(yīng)用hr-NGS進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)28個(gè)胚胎中僅有兩個(gè)胚胎同時(shí)有單體和三體細(xì)胞系，提示這種現(xiàn)象很少發(fā)生，因?yàn)楫?dāng)胚胎發(fā)育到囊胚期時(shí)一個(gè)異常細(xì)胞系已經(jīng)替代另一異常細(xì)胞系。

aCGH應(yīng)用Illumina公司的Bluefuse分析軟件，也用于嵌合體胚胎的診斷，但是相比hr-NGS，其對(duì)多細(xì)胞樣本的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍窄(異常細(xì)胞約占40%～60%)、錯(cuò)誤率高[18]，難以區(qū)分背景噪音和嵌合。Maxwell 等[19]進(jìn)行了驗(yàn)證性研究，對(duì)aCGH診斷為整倍體胚胎但移植后流產(chǎn)，用NGS對(duì)囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞DNA樣本擴(kuò)增產(chǎn)物重新檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中31.6%的胚胎為嵌合體，5.2%為多倍體。也有文獻(xiàn)報(bào)道第3天胚胎行aCGH活檢，再用FISH重新檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)aCGH的假陽(yáng)性率是2%～3%[11]。由于aCGH也是將整倍體細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞混合檢測(cè)，當(dāng)樣本中≥35%的細(xì)胞是非整倍體細(xì)胞aCGH才能檢測(cè)出來[20]，敏感性和準(zhǔn)確性較差。

細(xì)胞活檢技術(shù)本身也會(huì)影響結(jié)果。雖然沒有完全證實(shí)，但是觀察發(fā)現(xiàn)應(yīng)用激光或機(jī)械牽拉進(jìn)行細(xì)胞活檢可能導(dǎo)致人為的染色體丟失或增加。如果活檢的細(xì)胞中有已經(jīng)死亡或凋亡的細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致樣本污染，影響DNA擴(kuò)增，從而將正常胚胎誤診為嵌合體。還有一種比較極端的情況是當(dāng)異常細(xì)胞局限于胚胎的某一區(qū)域，容易造成將嵌合胚胎誤認(rèn)為整倍體或非整倍體。但是，目前證據(jù)證實(shí)嵌合體胚胎的異常細(xì)胞一般是均勻隨機(jī)分布的，因?yàn)槭芫蟮那皫状斡薪z分裂容易出錯(cuò)，從而導(dǎo)致嵌合體的異常細(xì)胞分散分布。

四、嵌合體胚胎移植后流產(chǎn)率和生育健康孩子的幾率

當(dāng)PGS檢測(cè)結(jié)果同時(shí)有整倍體和嵌合體時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選擇整倍體胚胎進(jìn)行移植。但是如果檢測(cè)結(jié)果僅有嵌合體胚胎，是否應(yīng)該移植嵌合體胚胎仍然有爭(zhēng)議。Bolton等[21]通過構(gòu)建小鼠嵌合體模型，發(fā)現(xiàn)非整倍體細(xì)胞的結(jié)局取決于細(xì)胞譜系。胎兒譜系的非整倍體細(xì)胞可通過凋亡清除，胎盤譜系的非整倍體細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷。Fiorentino等[22]研究發(fā)現(xiàn)，移植18個(gè)嵌合體胚胎(嵌合細(xì)胞占35%～50%)，其中6個(gè)最終正常活產(chǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道約40%的嵌合體胚胎移植后可以獲得妊娠[11，23-24]，但是與滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢正常的囊胚相比，嵌合體胚胎種植率低，流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)高，且復(fù)雜嵌合體(約占總胚胎的4.5%)比僅有一兩條染色體嵌合的胚胎明顯種植率低[24]。PGS診斷為嵌合體的胚胎有自我糾正的機(jī)制，學(xué)說包括以下幾種：整倍體細(xì)胞優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)、異常細(xì)胞自我糾正、正常細(xì)胞向內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集。三體細(xì)胞群可通過后期延遲或染色體不分離以丟失多余的染色體達(dá)到自我糾正[25]，但是這種情況可能性很小，因?yàn)樵谀遗邫z測(cè)中很少發(fā)現(xiàn)單親二體[26]。研究發(fā)現(xiàn)非整倍體細(xì)胞生長(zhǎng)慢，可在細(xì)胞凋亡過程中死亡，在胚胎發(fā)育過程中數(shù)量逐漸減少，最終健康胎兒出生。嵌合發(fā)生的染色體號(hào)數(shù)和持續(xù)種植率無(wú)關(guān)，除了17號(hào)染色體外，幾乎所有出現(xiàn)嵌合的染色體都有最終妊娠。染色體的大小和持續(xù)種植率也無(wú)關(guān)，但是大染色體的嵌合部分顯著比小染色體多。

對(duì)于活檢滋養(yǎng)外胚層的5～10個(gè)細(xì)胞能否準(zhǔn)確代表整個(gè)胚胎仍不清楚，因此這就可以解釋為什么異常細(xì)胞>40%的嵌合胚胎移植后也有著床的。胎兒或新生兒的嵌合型可導(dǎo)致先天畸形，自閉癥和精神發(fā)育遲緩。每條染色體的嵌合型都可能導(dǎo)致異常表型。異常表型可能胎兒發(fā)育正常，也可能受到嚴(yán)重影響，基因型與表型的關(guān)系很難判斷。因此，理論上所有移植嵌合體胚胎的妊娠和活產(chǎn)都應(yīng)該檢查胎兒染色體核型，并且對(duì)孩子的發(fā)育進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪。PGDIS指南建議，對(duì)于移植嵌合胚胎妊娠的女性需做羊水穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷。僅進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查和絨毛活檢是不夠的，因?yàn)樗鼈冎粰z查滋養(yǎng)外胚層(形成胎盤)，并不能檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(形成胎兒)。

五、如何處置嵌合體胚胎

是否移植嵌合體胚胎需要考慮多方面因素[27]，例如PGD的檢測(cè)方法、嵌合程度、嵌合發(fā)生在哪條染色體、患者的要求等。一些實(shí)驗(yàn)室用截點(diǎn)值來區(qū)分嵌合型胚胎是正?；虍惓?，通常把異常細(xì)胞的截點(diǎn)值定為40%或50%，但是這樣容易出現(xiàn)假陽(yáng)性(浪費(fèi)正常胚胎)和假陰性(導(dǎo)致誤診和可能的并發(fā)癥)[28]。嵌合體是除了整倍體和非整倍體以外的第三種胚胎類型，在移植級(jí)別中次優(yōu)于整倍體胚胎。如果沒有整倍體胚胎，根據(jù)患者的需求，進(jìn)行遺傳咨詢，在充分了解風(fēng)險(xiǎn)和知情同意的情況下，可以考慮移植嵌合體胚胎[29-30]。對(duì)于移植嵌合體胚胎妊娠的患者，建議行產(chǎn)前診斷。

六、展望

隨著科技的發(fā)展，未來有望能準(zhǔn)確診斷嵌合體胚胎，這樣可以避免丟棄可用胚胎，對(duì)于卵巢儲(chǔ)備功能差、無(wú)整倍體胚胎的患者可以增加移植機(jī)會(huì)。為了了解嵌合體的真實(shí)發(fā)生率，需要對(duì)全面染色體篩查實(shí)驗(yàn)室制定標(biāo)準(zhǔn)化流程和共識(shí)。同時(shí)，也需要進(jìn)一步研究和長(zhǎng)時(shí)間隨訪以了解嵌合體胚胎移植后的結(jié)局。

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